中藥調控RhoA信號通路防治糖尿病腎病研究進展*

陳影,劉玲玉,劉浩飛,馮睿,苗少博,馬繼偉,

1.河南中醫藥大學第一臨床醫學院,河南 鄭州 450000; 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院腎病科二病區,河南 鄭州 450000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是以持續性蛋白尿為主要特征的一組臨床綜合征[1],是糖尿病(diabetes mellitus,DM)常見的微血管并發癥,其早期病理特征表現為腎小球基底膜增厚,系膜的擴張、腎小管細胞和足細胞受損;晚期形成彌漫性/結節性的腎小球硬化以及腎間質的纖維化[2-3]。流行病學調查研究顯示,DN的發病率迅速上升,約30%～40%的糖尿病患者會發生DN[4],已經成為終末期腎臟病(end stage renal disease,ESRD)的主要病因[5-7]。通常認為DN是多種基因相互作用,病因復雜,其發揮作用的分子機制尚未明確[8]。目前治療DN的藥物主要有免疫抑制劑、單抗類靶向藥RAAS抑制劑、SGLT2抑制劑等,但只能適當改善水腫、乏力、泡沫尿和蛋白尿等臨床癥狀,尚不能阻止疾病進展,且藥物具有較大毒副作用及不良反應,加之患者個體差異,尚不能滿足臨床需求[9]。研究發現,中藥及中藥復方具有多途徑、多靶點、作用溫和、毒副作用小的特點,在防治DN中療效突出[10]。從信號通路探究藥物對DN的調控機制及作用靶點已成為當今研究熱點,DN的發病與多條信號通路的異常傳導息息相關,而RhoA信號通路作為細胞內關鍵的信號轉導通路之一,能夠抗氧化應激、抗炎、抑制腎臟纖維化、維持內皮細胞功能和保護足細胞等,在DN的發生發展中具有重要作用[11]?；诖?本文通過梳理RhoA信號通路在DN中的作用機制,首次綜述中藥、中藥活性成分及中藥復方的干預作用,以期為DN的中醫藥治療和新藥研發提供理論依據。

1 RhoA信號通路

RhoA信號通路是一種調控細胞生長、凋亡、增殖及血小板聚集、細胞黏附、接觸抑制的信號軸,在多種生物活動中發揮重要作用[12]。RhoA是小的GTP結合蛋白,在細胞活動中發揮作用,參與維持細胞形態、調節細胞骨架、細胞遷移、平滑肌細胞收縮等。RhoA GTP酶和下游的Rho激酶(Rho-associated coiled-coil-forming kinases,ROCK)激活,誘導肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)磷酸化,從而維持內皮細胞屏障的完整性[13]。MLC的磷酸化又進一步有助于F-肌動蛋白細胞骨架的收縮和內皮細胞之間的細胞間隙,從而增加腎小球濾過屏障(glomerular filtration barrier,GFB)的通透性,RhoA/ROCK的激活參與了腎小球白蛋白的高濾過和高血糖引起的微血管/視網膜并發癥。高糖激活RhoA/ROCK通路,導致MLC的磷酸化增加,肌動蛋白應激纖維形成,導致內皮通透性增加[14]。

2 中醫藥治療DN的優勢

DN屬于中醫學上的“水腫”“尿濁”“膏淋”“關格”“消渴”“水病”[15]等范疇。醫史典籍中對消渴日久轉變成水腫和尿濁早有論述。隋代巢元方《諸病源候論》載:“消渴其久病變,或發癰疽,或成水疾[16]?！辈∫虿C的研究方面,國醫大師呂仁和提出“微型癥瘕”,提供一種新的治療思路[17]。朱政潔等[18]認為DN的病機是本虛標實、脾腎虧虛,虛實夾雜為發病的主要基礎,其進展的重要因素是痰瘀內阻,內外風邪相加,治療應以益氣養陰和補腎活血為本,重視溫陽和祛風。王耀獻提出了“辨機論治”[19]和“內熱致癥”的思想,治療過程中重在引邪透邪,截斷疾病入里的趨勢[20],臨床上能顯著改善癥狀,控制血糖和蛋白尿[21]。目前,臨床湯藥集中在當歸補血湯、五苓散、豬苓湯、六味地黃丸等,中醫外治療法包含針灸、穴位貼敷、中藥保留灌腸等[22],中醫藥可以顯著改善臨床有效率,減少尿蛋白,改善乏力、水腫的臨床癥狀,推遲進入終末期腎臟病和開始透析時間,降低全因死亡率,改善患者的長期預后[23-24]。在一項荊防當歸補血湯治療DN的臨床觀察中,與單用西藥相比,中藥聯合西藥能夠明顯減輕患者早期臨床癥狀,降低血清中miR-148b-3p、miRNA-21的水平,抑制氧化應激,減輕足細胞損傷,改善腎功能,療效顯著[25]。郭帥等[26]經多中心、隨機對照試驗表明,益氣養陰消癥通絡方聯合西藥治療Ⅲ、Ⅳ期DN,可有效改善患者臨床癥狀,降低蛋白尿,保護腎功能,提高患者生活質量,諸多研究都彰顯了中醫藥治療的優勢。

3 RhoA與DN的關系

3.1 RhoA與氧化應激氧化應激是氧化劑和抗氧化劑平衡紊亂的反應過程。在內外環境作用下,體內產生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)和氮自由基,抗氧化防御系統不能完全清除,機體內ROS生成增多,而抗氧化應激能力下降,在細胞和組織中產生一系列生理和病理反應過程[27]。氧化應激是DN發病的核心機制之一,糖尿病可以增強氧化應激的活性,過度氧化應激又可以導致糖尿病并發癥發生,直接導致腎間質、腎小球和腎臟足細胞的損傷[28]。RhoA和氧化應激關系密切,氧化應激可以通過多種途徑激活RhoA,并且調節其活性;而RhoA信號通路又參與到調節細胞對氧化應激的應答,具體表現在以下3方面:(1)RhoA在氧化應激中的作用:RhoA的活化可以調節細胞骨架的重塑、細胞黏附以及遷移的過程,并且參與到調控細胞對氧化應激的應答。RhoA信號通路的激活可通過調節多個下游效應蛋白如ROCK,參與氧化應激引發的炎癥反應和損傷修復的過程。(2)活性氧物種調控RhoA信號:活性氧物種,如過氧化氫和超氧陰離子可以直接調節RhoA,進一步促進其下游信號通路的激活。(3)抗氧化劑調控RhoA:某些抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽等可通過減少氧化應激和清除活性氧的物種,抑制RhoA信號通路的活化,表明控制氧化應激的水平可以調節RhoA信號通路的活性[29]?？傊?RhoA信號通路和氧化應激相互影響和調節,氧化應激可以激活RhoA,而RhoA的激活又參與到調控細胞對氧化應激的應答。

3.2 RhoA與炎癥反應炎癥反應是導致DN的關鍵因素,雖然適當的炎癥可以維持組織完整性和穩態,但是過度的炎癥加速ECM的沉積,加重腎組織損傷[30-31]。RhoA與炎癥反應關系密切,可以從多個機制參與調控炎癥反應:(1)細胞遷移:一方面,RhoA可以調節細胞運動和細胞遷移,如巨噬細胞和中性粒細胞。另一方面,RhoA可通過激活ROCK和下游的其他效應蛋白,進而調節細胞骨架的重塑,使細胞產生收縮和變形,促進細胞的遷移。(2)炎癥介質的釋放:炎癥細胞一旦受到刺激會產生大量炎癥介質,如化學介質和細胞因子等。RhoA通過調控細胞骨架以及內質網重塑,影響炎癥介質的合成和釋放。(3)細胞和細胞之間相互作用:RhoA通過調節細胞和細胞外基質相互作用,影響炎癥細胞和內皮細胞的黏附遷移,參與到炎癥反應的浸潤中[32]。

3.3 RhoA與腎臟纖維化腎臟纖維化是一種病理過程,其特征是腎臟組織中的瘢痕和纖維化區域的增加,導致正常的腎小球和腎單位結構受損[33]。RhoA的激活可導致細胞內信號通路的異常激活,進而促進腎小球內皮細胞和間質細胞的增殖、遷移和分泌膠原等纖維化相關分子。這些變化最終導致腎臟組織的結構紊亂和纖維化病變[34]。具體表現在以下兩個方面:(1)RhoA通過激活下游信號通路,如Rho激酶和Rho關聯蛋白激酶(ROCK),參與調節腎臟纖維化過程中的各種生物學效應,包括增強腎小管上皮細胞的收縮,促進成纖維細胞的增殖和膠原基質的合成,引導腎小球內皮細胞的遷移以及破壞腎小球濾過屏障等。ROCK活性增強又可以進一步促進腎小球內皮細胞和間質細胞轉化為肌成纖維細胞,刺激基質的合成和沉積,最終導致腎臟纖維化[35]。(2)RhoA直接調節促纖維化基因的表達,通過調節促纖維化信號通路的激活,進一步調節細胞外基質的產生。研究表明,選擇性ROCK2抑制劑KD025能減輕db/db小鼠的蛋白尿和腎小球的纖維化[36]。

3.4 RhoA與內皮功能障礙內皮功能障礙是由多種途徑導致的,晚期糖基化終產物(advanced glycation end product,AGEs)是葡萄糖與蛋白質、脂質或核酸大分子之間非酶糖基化反應的產物,長期高糖環境下,大量的AGEs在腎臟中積累,導致內皮細胞損傷,并且改變形態和細胞骨架,內皮損傷是腎小球系膜病變及腎小球硬化的始動因素[14],蛋白尿就是DN中腎小球內皮細胞廣泛損害的標志之一。DN的蛋白尿發病機制復雜,涉及GFB功能障礙,人腎小球內皮細胞與足細胞相互作用,有助于GFB的完整性。RhoA信號通路和內皮細胞功能障礙關系密切,MLC的磷酸化和F-肌動蛋白應激纖維的形成是內皮高通透性的關鍵因素[37-38]。HG激活RhoA/ROCK信號通路,導致MLC磷酸化增加,肌動蛋白應激纖維形成,導致內皮細胞通透性增加。RhoA GTP酶和下游ROCK的激活,誘導MLC的磷酸化[37],在維持內皮細胞屏障的完整性方面發揮重要作用[39]。

3.5 RhoA與足細胞損傷足細胞排列在腎小球基底膜外表面,是腎小球濾過屏障的重要組成部分,與內皮細胞和腎小球基底膜共同調節腎小球濾過功能。DN是由于足細胞凋亡增加,導致腎小球濾過功能減弱,進而出現蛋白[40]。足細胞損傷后,RhoA信號通路的激活導致RhoA蛋白轉換為活性GTP結合形式,調控其下游效應蛋白ROCK蛋白激酶,進一步調控細胞骨架重構和細胞功能改變。下游蛋白ROCK被激活,磷酸化肌球蛋白輕鏈,促進肌動蛋白收縮和細胞骨架重塑,有利于足細胞損傷的修復和重新連接[41]。綜上所述,RhoA信號通路在足細胞損傷的修復過程中發揮著重要調節作用,通過調控細胞骨架的重組、肌動蛋白的收縮以及細胞遷移和增殖等過程,幫助維持足細胞的正常功能和組織結構。

4 中醫藥通過RhoA信號通路對DN的干預作用

4.1 中藥單體對RhoA信號通路的影響

4.1.1 水蛭素水蛭素是中藥水蛭的有效成分,具有抗凝、抗血栓、抗纖維化、抗腫瘤、減輕腦損傷和提高隨意皮瓣成活率的作用,能夠減少鈣離子內流,保護足細胞,減少RhoA蛋白,保護足細胞骨架[42]。研究發現,水蛭素能夠減輕db/db小鼠的蛋白尿和腎功能,同時維持高糖誘導的相關蛋白的表達水平,修復足細胞F-actin,與RhoA信號調節足細胞骨架相關[43]。水蛭素還可以阻斷RhoA/p38/NF-κB信號通路,抑制血管生成因子的表達,從而抑制腎小球內皮細胞的遷移和血管生成[44]。

4.1.2 柚皮素柚皮素是一種從柑橘類植物中提取出來的黃酮類化合物,主要作用是抗心律失常、抗炎、抗纖維化以及抗腫瘤和病毒等[45]。有研究表明,經柚皮素和ROCK的抑制劑法舒地爾干預后,腎臟組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 的表達下降,MYPT1 Thr853 磷酸化程度也減低,ROCK活性減弱,并且伴有蛋白尿的減少和腎功能的改善[46-47]。

4.1.3 雷公藤多苷雷公藤多苷是中藥雷公藤的有效成分,可以直接作用于抗原抗體復合物,發揮抗氧化、抗炎、免疫抑制、抗增殖和抗癌的作用[48]。保護腎功能主要是通過提高系膜細胞代謝速度,避免分泌血管內皮生長因子。研究表明,雷公藤多苷治療DN,主要是通過上調足細胞 nephrin、podocin表達,保護和及時修復足細胞以達到減輕蛋白尿的目的。此外,對DN大鼠的血清總膽固醇、三酰甘油和空腹血糖都有明顯的改善作用,可能與2型糖尿病的胰腺細胞以及血管內皮功能障礙與ROCKs的活性密切相關[49]。

4.1.4 梓醇梓醇是地黃代表性的效應單體,發揮著抗細胞凋亡、抗氧化應激和抗高血糖的作用。梓醇能顯著減少腎內皮細胞分泌單核細胞趨化蛋白-1、抑制巨噬細胞遷移和炎性因子分泌,調節巨噬細胞M1/M2極化平衡,從而減輕炎癥反應,有效改善腎小球系膜基質的增厚,腎間質纖維化和糖原的沉積[50]。研究發現,梓醇能夠抑制RAGE/RhoA/ROCK信號通路的激活,減少VEGF的分泌,增加Occludin和VE鈣黏蛋白的表達,從而改善內皮功能障礙和炎癥反應[51-52]。

4.1.5 山柰酚山柰酚是中藥山奈的有效成分,來源于葡萄、草莓、銀杏葉和十字花科的蔬菜,發揮著抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗糖尿病活性,具有增強機體免疫、神經保護和心臟保護作用[53]。研究表明,山柰酚抑制RhoA/ROCK活性,從而導致RhoA膜易位,ROCK2表達受抑制。與此同時,可以降低IL-1β的表達,展示其抗炎的特征?？傊?山柰酚抑制RhoA的激活,抑制氧化應激、促炎細胞因子(IL-1β和腫瘤壞死因子α)以及纖維化(轉化生長因子-β1和細胞外基質的表達)[54-55]。

4.1.6 桉油醇桉油醇是桉樹果實中提取的化合物,具有抗菌、抗炎、殺菌止痛等藥理作用。研究表明,桉油醇可通過抑制RhoA介導的GSK3β下游通路的激活,從而改善屏障功能障礙和蛋白尿。GSK3β是足細胞局灶性黏附中Rho/ROCK信號通路的下游介質,桉油醇可以阻斷RhoA和GSK3β二者之間的激活。桉油醇可減弱葡萄糖暴露的足細胞和糖尿病腎臟中RhoA、Rac1和Cdc42的誘導,通過調節這些分子開關,改善肌動蛋白細胞骨架,并且保持強大的局灶黏附組裝,從而抑制足細胞的屏障功能障礙以及由此所產生的蛋白尿[56]。

4.1.7 蘆丁蘆丁是中藥蕓香、蕎麥的主要有效成分,具有降低氧化應激,抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗心肌損傷、抗腫瘤和保護腎臟免受損傷的作用[57]。研究表明,蘆丁可通過激活Nrf2抑制RhoA/ROCK信號通路,減輕葡萄糖誘導的腎小球內皮屏障功能的破壞,主要用于DN血管病變的治療,減少氧化應激,減輕腎臟的損傷[58]。

4.1.8 白藜蘆醇藜蘆醇是中藥虎杖的有效成分,具有抗炎、抗感染、心血管保護、神經保護和肝臟保護的作用[59]。研究表明,白藜蘆醇可通過調節血管生成延緩DN的進展。腎小球中的膠原沉積主要通過RhoA/ROCK信號通路,因此早期DN腎小球硬化主要途徑可能是RhoA/ROCK信號通路,通過抑制RhoA/ROCK信號通路可顯著減輕DN相關的腎小球硬化[60]。

4.1.9 丹酚酸A丹酚酸A是中藥丹參的有效成分,發揮抗氧化、抗血栓、抗肝纖維化、心肌缺血保護、神經保護和防治糖尿病及其并發癥的作用[61]。研究表明,丹酚酸A對腎小球微血管內皮細胞的保護作用可能與抑制AGEs激活的RhoA-ROCK和隨后MLC調節的細胞骨架紊亂有關,可通過減輕足細胞損傷,抑制氧化應激和炎癥反應,發揮腎臟保護作用[62]。

4.1.10 黃連素黃連素是中藥黃連的有效成分,具有控制血壓、控制血糖、抗炎、抗心肌缺血、抗心律失常、抗病原微生物、調節免疫和抗腫瘤的藥理作用[63]。研究表明,黃連素可通過抑制RhoA/ROCK信號通路來抑制纖連蛋白(fibronectin,FN)的積聚,減少細胞間黏附分子-1、轉化生長因子-β1和FN的過度產生,抑制RhoA/ROCK信號通路,發揮抗氧化應激作用[64]。

4.1.11 青藤堿青藤堿是中藥青風藤的有效成分,具有抗炎、免疫調節、抗腫瘤和抗制移植物排斥等作用[65]。研究表明,青藤堿具有抗炎和腎臟保護作用,可治療HG誘導的DN血管高通透性,通過激活核因子相關因子2(nuclear factor correlation factor 2,Nrf2),保護腎內皮屏障功能,阻斷ROS的產生,抑制RhoA/ROCK信號通路,從而激活Nrf2介導的防御反應,達到預防HG誘導的氧化損傷的目的[66]。

4.1.12 燈盞花乙素燈盞花乙素是燈盞花中提取的黃酮苷,能夠有效預防糖尿病心肌病和視網膜病變,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化和改善心腦缺血等作用[67]。研究表明,燈盞花乙素能夠通過下調RhoA/ROCK介導的炎癥反應和纖維化發揮腎臟保護作用[68]。

4.2 中藥組方及制劑對RhoA信號通路的影響

4.2.1 益腎化濕顆粒益腎化濕顆粒的藥物組成包括茯苓、澤瀉、柴胡、黃連、人參、黃芪、陳皮、白術、白芍、羌活、獨活、防風、半夏、炙甘草、大棗和生姜。藥理作用主要是增強免疫力。其中,黃芪可以提升網狀內皮細胞的吞噬功能,茯苓可通過激活腺苷酸激活蛋白激酶,從而減弱成纖維細胞的激活,減少異常細胞外基質的沉積,降低蛋白尿。研究表明益腎化濕顆?？梢愿纳艱N患者的炎癥狀態,降低蛋白尿,改善腎功能,其作用機制是部分抑制RhoA/ROCK1/NF-κB信號通路,調控下游炎癥因子 IL-6、TNF-α的表達,抑制AGEs損傷足細胞,還可以降低早期DN患者的C反應蛋白和IL-8的表達,從而抑制炎癥反應,保護早期DN[69]。

4.2.2 六味地黃丸六味地黃丸由熟地黃、山萸肉、茯苓、澤瀉、山藥和牡丹皮組成,現代藥理研究表明此方可以抗氧化,延緩衰老,調節血糖、血脂、血壓、免疫,保護血管內皮,抑制腫瘤細胞生長等[70]。研究表明,六味地黃丸可以明顯抑制RhoA、ROCK1 的表達,減輕患者的腎損害,其機制是顯著降低RhoA、ROCK1的表達,抑制腎臟的肥大,改善病理,潛在的藥理機制主要是和炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡以及免疫的調節有關,通過減輕腎小管上皮細胞的氧化損傷以及細胞凋亡從而延緩間質纖維化的進程[71]。

4.2.3 自擬益氣養陰活血方自擬益氣養陰活血方的藥物組成是生地黃、生黃芪、積雪草、菟絲子、水蛭和大黃,擬方依據是久病虛瘀入絡,治以活血化瘀,益氣養陰。研究表明,此方可通過抑制TRPC6和RhoA的表達,減少24小時尿蛋白定量,改善腎臟病理,保護足細胞,同時改善生化血脂血糖的情況[72]。

4.2.4 腎康注射液腎康注射液由大黃、丹參、紅花、黃芪組成,研究表明腎康注射液可顯著改善DN患者的胰島素抵抗、糖脂代謝和腎功能,改善腎小球硬化和局灶性足突的消失,主要是通過有效控制糖腎大鼠的血清總膽固醇和三酰甘油水平,進而抑制大鼠的內皮損傷程度和氧化應激反應實現的。與此同時,該注射液可通過調節IL-6、TGF-β1、VCAM-1、ICAM-1、α-SMA,改善炎癥反應和腎間質纖維化,調控RhoA、ROCK1的表達,保護腎臟組織[73]。

4.2.5 腎康丸腎康丸的藥物組成是黃芪、刺五加、刺蒺藜、玉米須、白頭翁、益母草、蟬蛻、山楂8種藥物,具有補腎健脾、活血利濕的功效。研究表明,腎康丸可通過增加neparin和podocin的表達來保護足細胞免受損傷,抑制AURKB、racGAP1和RhoA的表達,發揮腎臟保護作用[74]。

表2 中藥組方及制劑通過靶向RhoA改善糖尿病腎病的作用機制

5 總結與展望

RhoA信號通路在DN的發生發展中發揮著關鍵作用,可作為DN的治療靶點。中醫藥治療DN具有多組分、多靶點、副作用小的優勢。國內外的相關實驗研究表明,RhoA信號通路參與了DN的氧化應激、炎癥反應、腎臟纖維化、內皮功能障礙和足細胞損傷?，F有研究仍存在不足之處:(1)RhoA在DN中作用機制比較復雜,涉及氧化應激、炎癥、自噬等,后期多是腎臟纖維化,尚未明確是通過單一靶點還是多靶點調控RhoA干預DN。(2)針對中藥組方及其制劑和中藥單體作用于RhoA的研究,下游通路主要集中于ROCK,缺少對其他通路的研究。(3)RhoA信號通路和DN之間的關系研究相對較少,多集中在炎癥反應的研究。以后可以進一步拓展炎癥方向的研究,進一步明確中藥單體及復方的作用機制,為實驗提供理論支撐。