UPLC-MS/MS 法測定苯磺酸氯吡格雷中5 種遺傳毒性雜質

喬敏莎，鄭秋瑩，蘭為環，張綠茵，唐海，潘曉男，喬曉娜

（天士力醫藥集團股份有限公司研究院，天津 300410）

苯磺酸氯吡格雷（Clopidogrel besilate）是第二代二磷酸腺苷受體拮抗藥[1]。目前有文獻報道了苯磺酸氯吡格雷的有關物質和溶劑殘留研究[2-3]，但對于其遺傳毒性雜質研究尚未有報道。近年來，法規對于藥物遺傳毒性雜質控制的要求越來越嚴格[4-5]。本文根據2020 年版《中國藥典》四部通則〈0512〉、〈0431〉以及人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）M7 規定[6-7]，并結合苯磺酸氯吡格雷仿制藥生產工藝，建立苯磺酸氯吡格雷中5 種苯磺酸酯類遺傳毒性雜質（對硝基苯磺酸、對硝基苯磺酰氯、對硝基苯磺酸甲酯、對硝基苯磺酸乙酯和對硝基苯磺酸異丙酯）的UPLC-MS/MS 檢測方法，以期為本品基因毒性雜質質量控制提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：超高效液相色譜儀，LC 30 AD 型，日本島津公司；三重四級桿質譜儀，QTrap 5500 型，美國AB Sciex 公司；電子天平，XS105DU 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

試劑：乙腈，質譜級，美國默克公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；標準品：對硝基苯磺酸水合物，純度83.9%，阿拉丁試劑（上海）有限公司；對硝基苯磺酰氯，純度98.2%，阿拉丁試劑（上海）有限公司；對硝基苯磺酸甲酯，純度99.3%，阿拉丁試劑（上海）有限公司；對硝基苯磺酸乙酯，純度99.5%，自制，批號yz 220813；對硝基苯磺酸異丙酯，純度99.2%，自制，批號bz 230205；苯磺酸氯吡格雷，自制，批號20210711、20210719、20210720。

1.2 儀器方法

色譜方法：色譜柱為沃特世 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（10 cm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫箱溫度30 ℃；樣品室溫度4 ℃；進樣量2 μL；流動相A 為水，流動相B 為乙腈，程序洗脫為：0～ 0.5 min，20%B；0.5～ 1.5 min，20% B～ 65% B；1.5～ 9 min，65% B；9～ 10 min，65% B～ 20% B；10～ 13 min，20% B；流速0.3 mL/min。

質譜方法：離子源為電噴霧（ESI）源，負離子掃描，多反應監測（MRM）模式，離子化電壓（IS）為-4 500 V；霧化溫度（TEM）為450 ℃；氣簾氣（CUR）為35 L/min；霧化器（Gas1）為45 L/ min；輔助加熱氣為45 L/ min；碰撞氣壓力（CAD）為medium。監測離子對為m/z 202 →138，去簇電壓DP 為-100 V，射入電壓EP 為-10 V，碰撞能量CE為-25 V，碰撞室射出電壓GXP 為-10 V。

1.3 實驗步驟

1.3.1溶液的配制

混合對照品溶液：稱取對硝基苯磺酸甲酯、對硝基苯磺酸乙酯、對硝基苯磺酸異丙酯各約15 mg、對硝基苯磺酸水合物約18.9 mg（按對硝基苯磺酸計約為15 mg）置于100 mL 量瓶中，精密稱定，并用乙腈定容，得混合對照品溶液一級儲備液。精密移取對照品溶液一級儲備液1.0 mL 置于200 mL 量瓶中，用乙腈定容，得混合對照品溶液二級儲備液。精密移取對照品溶液二級儲備液1.0 mL 置100 mL 量瓶中，乙腈定容，即得對照品溶液，濃度約為7.5 ng/mL。

對硝基苯磺酰氯對照品溶液：稱取對硝基苯磺酸酰氯約15 mg 置于100 mL 量瓶中，精密稱定，并用乙腈定容，得對硝基苯磺酰氯對照品溶液一級儲備液。精密移取對硝基苯磺酰氯溶液一級儲備液1.0 mL，置于200 mL 量瓶中，用乙腈定容，得對硝基苯磺酰氯溶液二級儲備液。精密移取對硝基苯磺酰氯對照品溶液二級儲備液1.0 mL 置于100 mL 量瓶中，用乙腈定容，即得對硝基苯磺酰氯對照品溶液，濃度約為7.5 ng/mL。

標準曲線溶液：分別精密移取混合對照品溶液二級儲備液0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 置于100 mL 量瓶中，分別用乙腈定容，即得濃度為0.75、2.25、3.7、7.50、11.25、15.00 ng/mL 的系列標準溶液。

供試品溶液：稱取原料藥約25 mg，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，用乙腈定容，即得，濃度為0.5 mg/ mL。

供試品添加混合對照品溶液（加標溶液 ①）：稱取原料藥約25 mg，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，用混合對照品溶液定容。

供試品添加對硝基苯磺酰氯對照品溶液（加標溶液②）：稱取原料藥約25 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，用對硝基苯磺酰氯對照品溶液定容。

空白溶液：乙腈。

1.3.2方法學考察步驟

專屬性：取“1.3.1 項”的空白溶液、混合對照品溶液、對硝基苯磺酰氯對照品溶液，分別上機測定，儀器條件如“1.2 項”所示。記錄各雜質的保留時間，并考察空白溶劑和供試品溶液是否對各雜質的檢測有干擾。

系統適用性：取“1.3.1 項”的混合對照品溶液、對硝基苯磺酰氯對照品溶液，分別上機測定6 次，記錄各雜質保留時間和峰面積的RSD 值。

檢出限、定量限：取“1.3.1 項”的空白溶液、逐級稀釋后的混合對照品溶液、對硝基苯磺酰氯對照品溶液，分別上機測試。信噪比（S/N）大于3 時對應的遺傳毒性雜質濃度即為該雜質的檢出限，信噪比（S/N）大于10 時對應的遺傳毒性雜質濃度即為該雜質的定量限。

線性和范圍：取“1.3.2 項”的定量限溶液和“1.3.1項”的標準曲線溶液，分別上機測試。然后分別以各雜質的質量濃度（ng/mL）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并得到線性方程和線性系數。

重復性：按“1.3.1 項”分別配制6 份加標溶液①和加標溶液 ②，上機測試，采用外標法計算各雜質的濃度，得到測定濃度，然后計算測定濃度RSD 值，即為方法的重復性。

中間精密度：不同實驗人員于不同日期配制6份“1.3.1 項”混合對照品溶液、對硝基苯磺酰氯對照品溶液、加標溶液 ①和加標溶液 ②，上機測試，計算各雜質測定濃度的RSD 值及加標回收率的RSD值，即為方法的中間精密度。

準確度：按“1.3.1 項”分別配制3 份加標溶液①和加標溶液 ②，上機測試，按以下公式計算各雜質的加標回收率，即為方法的準確度。

式中C測定值——加標溶液測定濃度；

C原有值——供試品溶液測定濃度；

C加入量——添加的各雜質的濃度。

耐用性：依次改變一項儀器參數（具體見表1），按順序測定“1.3.1 項”的空白溶液、供試品溶液、混合對照品溶液、對硝基苯磺酰氯對照品溶液、加標溶液 ①、加標溶液 ②，記錄峰面積，計算各條件下供試品中雜質含量、和供試品加標溶液的回收率及回收率的RSD 值。

表1 耐用性實驗條件改變表Tab.1 Variation of parameters in durability experiments

溶液穩定性：按“1.3.1 項”配制供試品溶液、混合對照品溶液、對硝基苯磺酰氯對照品溶液、加標溶液①、加標溶液②，將上述溶液置于4 ℃樣品室中，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣分析，記錄各雜質的峰面積，分別計算其RSD 值，RSD 值小于15%則表示溶液穩定。

2 結果與討論

2.1 方法驗證結果

2.1.1專屬性

空白溶液、標準溶液及供試品溶液的檢測譜圖如圖1 所示。結果可知，對硝基苯磺酰氯保留時間為0.79 min、對硝基苯磺酸保留時間為0.78 min、對硝基苯磺酸甲酯保留時間為2.99 min、對硝基苯磺酸乙酯保留時間為3.24 min、對硝基苯磺酸異丙酯保留時間為3.52 min，空白溶劑和供試品中不存在干擾目標雜質的成分，說明方法的專屬性良好。由于對硝基苯磺酰氯和對硝基苯磺酸保留時間一致，質譜的子離子、母離子和碰撞電壓也完全相同，不能對兩個雜質進行良好的區分。因此，本實驗建立的方法對兩個雜質進行合并計算及定量。

圖1 專屬性溶液總離子流圖（TIC 圖）Fig.1 Total ion flow chromatogram（TIC）of the proprietary solution

2.1.2系統適應性

系統適應性結果如表2 所示。從表中可以看出，對硝基苯磺酰氯、對硝基苯磺酸、對硝基苯磺酸甲酯、對硝基苯磺酸乙酯、對硝基苯磺酸異丙酯的峰面積RSD 值在0.77%～ 2.00%之間，保留時間的RSD 值在0.73%～ 1.96%之間。5 種雜質的峰面積和保留時間的RSD 值均遠小于15%，說明方法的系統適用性良好。

表2 儀器系統適應性實驗結果Tab.2 Results of instrumentation system adaptation experiments

2.1.3標準曲線、線性范圍及檢出限、定量限

各雜質的線性、范圍及檢出限、定量限如表3所示。結果表明，5 種雜質的標準曲線的線性關系良好，相關系數在0.998 7～ 0.999 8 之間，對硝基苯磺酰氯、對硝基苯磺酸的檢出限和定量限分別為0.045 ng/mL 和0.150 ng/mL，對硝基苯磺酸甲酯、對硝基苯磺酸乙酯、對硝基苯磺酸異丙酯的檢出限和定量限分別為0.113 ng/mL 和0.375 ng/mL。各雜質的線性系數均大于0.99，且定量限和檢出限均低于折算限度（15 ng/mL），因此本方法滿足定量分析要 求。

表3 標準曲線、線性范圍、檢出限及定量限結果Tab.3 The result of standard curves,linear ranges,limit of detection and limit of quantitation

由于對硝基苯磺酰氯和對硝基苯磺酸的色譜保留時間一致，質譜的子離子、母離子和碰撞電壓也完全相同，不能對兩個雜質進行良好地區分。因此，本方法采用標準曲線法在定量限濃度（兩個雜質的定量限濃度相同）到200%限度濃度范圍內，以濃度對峰面積進行線性回歸，求出各自的曲線斜率，按照曲線斜率之比求出相對響應因子（RRF）。

根據上述公式，按照線性結果中曲線斜率計算雜質對硝基苯磺酰氯對雜質對硝基苯磺酸的相對響應因子是：609 522/649 834=0.94 ＜1。因此，在實際樣品測定時，本方法選用對硝基苯磺酰氯做對照品用于計算樣品中該保留時間處的雜質含量。

2.1.4重復性

5 種遺傳毒性雜質的重復性實驗結果如表4 所示?？梢钥闯?，所測5 種雜質的RSD 值在0.69%～ 1.85%之間，即在3.0%以內，說明該方法的重復性良好。

表4 方法的重復性實驗結果Tab.4 The results of repeatability test of the method

2.1.5準確度

表5 為5 種基因毒性雜質的準確度實驗結果。實驗表明，各雜質的回收率在82.98%～ 119.92%之間，即在70.0%～ 130.0%范圍內，且各雜質加標回收率的RSD 值小于15%，說明方法的準確度良好。

表5 加標回收率實驗結果Tab.5 Results of the recovery rate test

2.1.6中間精密度

中間精密度實驗結果見表6。結果表明，5 種遺傳毒性雜質的加標回收率均在70.0%～ 130.0%之間；5 種遺傳毒性雜質測定值的RSD 值及加標回收率的RSD 值均低于3.47%，這說明所建立方法的中間精密度良好，滿足分析要求。

表6 中間精密度實驗結果Tab.6 Results of intermediate precision test

2.1.7耐用性

5 種遺傳毒性雜質各耐用性條件下，測定濃度的RSD 值在0.53%～ 7.35%之間，RSD 值均小于15%，加標回收率在84.11%～ 114.85%之間，即滿足藥典中要求的70.0%～ 130.0%范圍，另外各雜質加標回收率的RSD 值均小于15%。具體實驗結果如表7 所示。

表7 耐用性實驗結果Tab.7 Results of durability experiments

2.1.8溶液穩定性

實驗結果表明，供試品溶液、混合對照品溶液、對硝基苯磺酰氯對照品溶液、加標溶液 ①和加標溶液 ② 5 種溶液在進樣室溫度4 ℃條件下，24 小時內峰面積RSD%均小于15%。對硝基苯磺酰氯、對硝基苯磺酸、對硝基苯磺酸甲酯、對硝基苯磺酸乙酯、對硝基苯磺酸異丙酯的峰面積RSD 值分別在3.33%～ 6.39%、3.33%～ 7.02%、2.15%～ 4.67%、5.76%～ 6.06%、6.41%～ 6.92%之間，這說明所有實驗溶液在4 ℃條件下穩定。

2.2 樣品測定

根據ICH M7 中規定的終身服藥時，單個雜質可接受攝入量為1.5 μg/天，按照本品每日最大服用計量為50 mg 計算時，各雜質限度值為30 μg/g。按照本實驗建立的方法，對三批苯磺酸酯氯吡格雷進行測定，結果如表8 所示。實驗結果表明，三批本品的定量結果遠遠低于法規要求的限度。

表8 樣品中各雜質含量Tab.8 Concentrations of the genotoxic impurities in samples

3 結語

本研究利用超高效液相色譜-三重四級桿質譜儀建立了苯磺酸氯吡格雷中5 種遺傳毒性雜質的含量測定方法，并進行了全面的方法學驗證。實驗表明，所建立方法的線性、重復性、加標回收率、中間精密度等均符合分析要求，測定的三批樣品中5 種雜質的含量均遠小于其限度值。該方法穩定、準確、可靠，可用于苯磺酸氯吡格雷中苯磺酸類遺傳毒性雜質的定量分析，也可為藥物的質量控制研究提供參考。