乳酸菌固態發酵過程中麥麩組分的動態變化

陳蒙慧， 江 迪， 關二旗， 李萌萌， 劉遠曉， 張凱歌， 卞 科

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

小麥是我國的傳統糧食之一，我國小麥產量居世界前列。 據國家統計局數據顯示，2021 年小麥總產量高達13694.45 萬t。 麥麩是小麥制粉過程中的主要副產物，產量約占小麥加工量的20%，年產量超2000 萬t[1]。 麥麩中含有豐富的膳食纖維、蛋白質、B 族維生素及多酚類物質， 其中膳食纖維作為“第七類營養素”，具有調節血糖水平、預防高血壓、促進腸道蠕動、防治便秘、預防結腸癌等功能[2-3]，因此在全麥食品及功能性食品開發方面具有很好的應用潛力。 然而，麥麩中的纖維成分占麥麩的40%～50%，其中90%以上為不溶性膳食纖維，這類纖維既不能很好與淀粉和蛋白質結合，也不易被人體吸收利用，直接添加會導致制品口感粗糙，降低消費者的接受度。 同時，麥麩中的抗營養因子植酸能夠螯合金屬離子，易與鈣、鎂、鋅、鐵、鉀等離子形成植酸鹽[4]，導致礦物質的生物利用度顯著降低[5]；且麥麩表面易附著真菌毒素、農藥殘留、重金屬等有毒有害物質，對食品安全也存在潛在威脅[6]。 過去麥麩常應用于釀造行業及飼料業中， 在食品中應用較少。近年來，隨著膳食結構日益多樣化，全谷物類粗纖維制品開始受到人們的關注， 成為目前研究的熱點。 不少研究人員通過對麥麩進行改性處理以提高麥麩的食用性及加工適應性，進而擴大其在食品中的應用范圍。

目前國內外對麥麩的改性處理分為物理法、化學法和生物技術法[7]。 其中生物技術法是利用酵母菌、乳酸菌、霉菌等微生物的發酵作用或添加纖維素酶、木聚糖酶等酶制劑處理麥麩[8]，使麥麩的內部結構發生改變，是目前常用的一種方法，因其安全、高效的特點而受到了廣泛關注。 其中，乳酸菌是一類可利用碳水化合物產乳酸的益生菌，具有調節腸道菌群平衡、調節免疫力的功能特性[9]。 乳酸菌發酵過程分泌的酶可以破壞麥麩的細胞壁結構，打破分子間的化學鍵，從而使各種物質游離出來[10]。 Zhao等采用乳酸菌發酵麥麩后，麥麩可溶性膳食纖維及水溶性阿拉伯木聚糖（SAX）質量分數顯著增加，同時抗營養因子植酸降解率顯著提高[11]。 王太軍的研究表明，植物乳桿菌發酵麥麩后SAX、可溶性膳食纖維及總酚質量分數顯著增加，此外，麥麩的持水力和保水性指數增加可改善其加工適應性[12]。Spaggiari 等利用鼠李糖乳桿菌固態發酵麥麩， 發酵后植酸質量分數顯著降低、SAX 質量分數增加近3倍，且游離酚酸質量分數顯著增加、抗氧化活性增強[13]。由此可見，乳酸菌發酵麥麩是一種極具潛力的麥麩改性方法。 但目前多針對單一乳酸菌的發酵效果進行研究，且對發酵過程中麥麩組分的影響尚不明確。 因此，作者選用植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌及布氏乳桿菌4 株常見乳酸菌對麥麩進行固態發酵處理，探究發酵過程中不同乳酸菌對麥麩組分的影響，為提高麥麩的利用率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩：益海嘉里集團；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，KM005155）、 戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，KM005149）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri，KY828224）： 由中國農業大學工學院飼料調制與加工實驗室分離純化保藏； 鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，CGMCC 1.8882）： 中國普通微生物種保藏管理中心。

熱穩定α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、福林酚、沒食子酸標準品、植酸標準品：北京索萊寶科技有限公司；碳酸鈉、三氯乙酸、磺基水楊酸、三氯化鐵：阿拉丁試劑有限公司；DPPH 試劑：TCI 試劑公司。

1.2 儀器與設備

LRH-800 生化培養箱： 韶關泰宏公司；5810R高速離心機： 德國Eppendorf 儀器有限公司；UV-2000 紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；WZZ-2S 旋光儀：上海申光儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌培養 將菌株凍存液接種至5 mL MRS 液體培養基中，37 ℃培養24 h，培養2 代后轉入50 mL MRS 液體培養基中，37 ℃下培養24 h，梯度稀釋確定乳酸菌濃度，進而確定添加量。

1.3.2 麥麩發酵 取50 g 麥麩，調節水分質量分數至60%，分別設置植物乳桿菌（T1）、鼠李糖乳桿菌（T2）、戊糖片球菌（T3）、布氏乳桿菌（T4）處理組以及添加等量無菌水的對照組（CK）， 菌種接種量為1×108CFU/g。將混勻后的麥麩裝入10 cm×15 cm 聚乙烯袋中，每袋60 g，用真空包裝機抽成真空并封口，于37 ℃生化培養箱中進行厭氧發酵，分別于8、16、24、32、40、48 h 開封取樣分析。 發酵后的麥麩于45 ℃恒溫干燥箱中干燥至質量恒定， 粉碎后過80目篩備用。

1.3.3 麥麩發酵過程中乳酸菌菌落總數的測定發酵麥麩開封后取1 g 樣品于玻璃試管中，加入9 mL 無菌水混勻并進行梯度稀釋。選取合適的稀釋樣品液0.06 mL 于MRS 平板上， 用涂布棒涂勻，每個梯度設置3 個平行。

1.3.4 發酵麥麩可溶性膳食纖維質量分數的測定稱取5.0 g 干燥后麥麩，加入50 mL 去離子水，混勻后加入質量分數1%的熱穩定α-淀粉酶，90 ℃恒溫水浴30 min 后加入質量分數2%蛋白酶， 混合均勻后于60 ℃恒溫水浴30 min；調節pH 至4.5，加入質量分數2%的淀粉葡萄糖苷酶于60 ℃恒溫水浴30 min。冷卻至室溫，5000 g 離心10 min，上清液中加入4 倍體積預熱至60 ℃的體積分數95%乙醇溶液，沉淀2 h 后過濾，并分別用體積分數78%的乙醇溶液、體積分數95%乙醇溶液沖洗沉淀2 次，沉淀于105 ℃烘干至質量恒定。

式中：FS為可溶性膳食纖維質量分數，%；m 為恒定質量后的沉淀質量，g；M 為質量恒定后的麥麩質量，g。

1.3.5 發酵麥麩淀粉質量分數的測定 發酵麥麩淀粉質量分數按照GB/T 20378—2006 測定。

1.3.6 發酵麥麩粗蛋白質量分數的測定 發酵麥麩蛋白質質量分數按照GB 5009.5—2016 測定。

1.3.7 發酵麥麩總酚質量分數的測定

1）提取 準確稱取2.0 g 干燥麥麩于100 mL離心管中，加入50 mL 體積分數為80%的甲醇溶液后于45 ℃恒溫磁力攪拌器中提取1 h。 冷卻至室溫后4000 g 離心10 min， 收集上清液并于4 ℃冰箱保存待測。

2）測定 采用福林酚比色法。將提取液稀釋3 倍后吸取1 mL 于10 mL 容量瓶中， 加入0.5 mL福林酚試劑， 混勻后加入1.5 mL 質量分數15%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容后搖勻，避光靜置1 h，在765 nm 處測定反應液的吸光度， 以體積分數80%的甲醇溶液作為空白對照。 以沒食子酸作為標品， 繪制沒食子酸質量分數和吸光度的標準曲線，根據標準曲線進行計算。 總酚質量分數（mg/g）以每克麥麩干質量含沒食子酸質量計。

1.3.8 發酵麥麩DPPH 自由基清除能力的測定準確稱取19.716 mg DPPH 溶于無水乙醇， 定容至250 mL 配成濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 溶液。吸取2 mL 稀釋3 倍后的多酚提取液于5 mL 離心管中，加入2 mL DPPH 溶液混勻， 避光靜置30 min 后通過0.22 μm 的濾膜， 在517 nm 處測定吸光度。 同時，測定對照組（2.0 mL 樣品溶液+2.0 mL 無水乙醇）及空白組（2.0 mL DPPH 溶液+2.0 mL 無水乙醇）的吸光度，并根據下式計算樣品DPPH 自由基清除率：

式中：K 為DPPH 自由基清除率，%；A1為2 mL 樣品溶液與2 mL DPPH 溶液混合液的吸光度；A2為2 mL 樣品溶液與2 mL 無水乙醇混合溶液的吸光度；A0為2 mL 無水乙醇與2 mL DPPH 溶液的混合溶液的吸光度。

1.3.9 發酵麥麩植酸質量分數的測定

1）提取 準確稱取0.5 g 干燥麥麩于100 mL離心管中，加入50 mL 含有體積分數1.3% 的HCl、質量分數為10%的Na2SO4溶液，磁力攪拌提取1 h，提取液在5000 g 離心10 min，上清液于4 ℃冰箱保存待測。

2）測定 參照嚴靜等的方法[14]。

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Statistics for Windows（Version 16.0）軟件進行單因素方差分析，并做Duncan 多重比較，顯著水平設置為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 麥麩發酵過程中乳酸菌菌落總數

由圖1 可知，乳酸菌數量隨著發酵時間的延長顯著增加，4 株乳酸菌在麥麩基質中生長趨勢基本一致。 在厭氧條件下，乳酸菌能夠利用麥麩中的淀粉等碳水化合物生成乳酸降低基質的pH 進而抑制雜菌的生長。麥麩初始乳酸菌數量達到1×106以上，對照組與處理組菌落總數在24 h 內顯著增加 （P＜0.05），24 h 后菌落總數無顯著差異（P>0.05），其中對照組乳酸菌菌落總數在整個發酵期間略低于處理組。

圖1 發酵過程中乳酸菌菌落總數Fig. 1 Dynamic changes of lactic acid bacteria count during anaerobic fermentation of wheat bran

2.2 發酵過程中可溶性膳食纖維質量分數的變化

由圖2 可知，麥麩膳食纖維的質量分數隨著發酵時間的延長而顯著增加，乳酸菌發酵可顯著增加麥麩可溶性膳食纖維的質量分數（P＜0.05）。 Zhao 等用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌復合菌發酵麥麩，發現麥麩中可溶性膳食纖維質量分數由4.43%增加至8.36%[11]， 認為可溶性膳食纖維質量分數增加可能是因為乳酸菌發酵可產生降解大分子纖維的水解酶。 乳酸菌在生長過程中產生的纖維素水解酶如β-葡聚糖酶和木聚糖酶可以水解麥麩纖維素成分的β-糖苷鍵，破壞麥麩的細胞壁[15]，從而增加麥麩可溶性膳食纖維的質量分數；其次，麥麩自身的微生物體系較為復雜，發酵過程中麥麩基質的變化也可激活麥麩中存在的酶，促進麥麩的降解[16]。 此外，乳酸菌產乳酸后基質pH 降低， 在酸性環境下糖苷鍵可斷裂產生新的還原性末端，降低了纖維類大分子的聚合度，同時也提高了水溶性膳食纖維的質量分數[17]。 與對照相比，T1、T2 處理組對膳食纖維質量分數提高效果較為顯著（P＜0.01），發酵48 h 后分別達到6.53%和6.58%。 張書慶等分別采用短乳桿菌及植物乳桿菌發酵麥麩，發酵麥麩中可溶性膳食纖維的質量分數隨著發酵時間的增加而增加[18]，與本研究結果一致。

圖2 麥麩發酵過程中可溶性膳食纖維質量分數的變化Fig. 2 Dynamic changes of soluble dietary fiber mass concentration during anaerobic fermentation of wheat bran

2.3 發酵過程中淀粉質量分數的變化

由圖3 可知，隨著發酵時間的延長，麥麩淀粉質量分數顯著降低（P＜0.05）。 與對照組相比，發酵8 h 后，乳酸菌處理組中淀粉質量分數顯著降低（P＜0.05）。 發酵40 h 后各組中的淀粉質量分數變化無顯著差異，其變化趨勢與乳酸菌菌落總數變化趨勢保持一致。 乳酸菌在厭氧的條件下迅速增殖成為麥麩發酵過程中的優勢菌群[19]，在生長過程中消耗麥麩中的碳水化合物， 將碳水化合物轉化為乳酸、乙酸等有機酸。 在整個發酵組中，對照組的淀粉質量分數始終高于其他乳酸菌處理組，附生的乳酸菌是麥麩自然厭氧發酵過程中的重要微生物種群，其效果受到乳酸菌多樣性、 數量以及發酵活性的影響。本研究中，隨著發酵時間的延長，最終對照組乳酸菌濃度達到1×109CFU/g 以上，但其發酵活性較差，對淀粉的利用較低，其淀粉質量分數高于處理組。

2.4 發酵過程中粗蛋白質量分數的變化

由表1 可知，各組麥麩經發酵后蛋白質質量分數顯著增加（P＜0.05），這與Coda 等的研究結果一致[20]。隨著發酵時間的延長，發酵麥麩的粗蛋白質量分數在8 h 內顯著增加，8～16 h 呈下降趨勢，16～24 h 呈上升趨勢，24 h 后麥麩粗蛋白質量分數無顯著變化（P>0.05）。 麥麩發酵過程中粗蛋白質量分數的變化是微生物消耗蛋白質和菌體蛋白質的共同作用結果，在最初的8 h，乳酸菌處于生長初期，代謝較為旺盛，可消耗麥麩中的蛋白質，因此麥麩中的蛋白質質量分數顯著降低；發酵中期乳酸菌生長進入對數期，乳酸菌大量增殖，同時也可產生較多的菌體蛋白質[21]，從而增加了基質中蛋白質的質量分數；發酵后期乳酸菌生長進入穩定期，乳酸菌的生長及衰亡基本持平，因此蛋白質質量分數無顯著差異。 岳碧娥等在利用植物乳桿菌、乳酸片球菌和布氏乳桿菌進行全株玉米青貯時發現全株玉米中的粗蛋白質量分數出現小幅度下降，這是因為基質中存在的霉菌將蛋白質類物質轉化為了無機氨態氮[22]。 有研究者用自然發酵和細菌發酵麥麩，發現麥麩的蛋白質質量分數增加，但隨著發酵時間的增加，發酵麥麩的蛋白質質量分數呈降低趨勢[23]。因此，發酵麥麩蛋白質質量分數的變化可能與菌株的發酵類型有關，其具體機制有待進一步研究。

2.5 發酵過程中總酚質量分數及其抗氧化活性的變化

不少研究表明，麥麩發酵后可顯著增加其酚類物質質量分數[24-25]。 由圖4 可知，隨著發酵時間的延長，麥麩總酚質量分數顯著增加（P＜0.05）。發酵前麥麩中多酚質量分數為1.34 mg/g， 在發酵的0～24 h內乳酸菌生長較為迅速，更多的乳酸菌分泌酶作用于麥麩細胞壁結構，打破分子間的連接鍵，從而增加酚類物質的質量分數[26]，多酚質量分數增加速度較快；發酵48 h 后，麥麩中多酚類物質的質量分數增加約2 倍； 其中處理組中T1、T3、T4 組發酵麥麩中多酚質量分數略高于對照組及T2 組， 分別為3.86 mg/g、3.67 mg/g 及3.68 mg/g。此外，麥麩中的酚類化合物更多以結合態形式存在[27]，主要以共價鍵形式存在于膳食纖維基質中[28]，通過微生物的發酵作用可以有效地降解纖維素，并打破酚類物質與細胞壁多糖之間的聯系，從而增加酚類化合物的質量分數[29]。 也有研究表明，采用乳酸菌發酵全麥面團時，結合態酚類化合物轉化為游離態[30]，酚類物質的生物可利用度顯著增加[31]。由此可見，總酚或游離酚質量分數增加都可表明乳酸菌發酵對于改善麥麩酚類化合物的積極作用。

圖4 麥麩發酵過程中多酚質量分數的變化Fig. 4 Dynamic changes of polyphenol mass concentration during anaerobic fermentation of wheat bran

樣品DPPH·清除率可以反映其抗氧化能力大小，樣品液可將DPPH·清除，降低紫色DPPH 溶液的吸光度，吸光度越低，表明其抗氧化能力越強[32]。由圖5 可知，麥麩經發酵后DPPH·清除率顯著增加（P＜0.05），且清除率隨著發酵時間的延長顯著增加。其中， 處理組DPPH·清除率在16～32 h 內迅速增加，這與多酚質量分數增加趨勢一致；0～16 h 內，T3組較其他組表現出較高的DPPH·清除能力，整體來講，T1、T3、T4 組比T2 組和對照組DPPH·清除能力高， 發酵48 h 后麥麩DPPH·清除率分別可達65.44%、61.91%及65.82%。 多酚類物質是麥麩中的具有抗氧化功能的生物活性物質，通過各種糖苷鍵及化學鍵鏈接在一起[33]，麥麩經過乳酸菌發酵后分子間的部分鏈接鍵斷裂，提高了酚類物質的質量分數，從而提高了麥麩的DPPH·清除率。 馬健通過復合乳酸菌發酵麥麩， 酚酸質量分數、DPPH·清除率顯著提高[34]。這些結果表明，乳酸菌發酵對提高麥麩多酚質量分數效果良好，與前人的結果一致，同時此結果也與發酵麥麩可溶性膳食纖維質量分數趨勢一致。

圖5 發酵麥麩DPPH 自由基清除率Fig. 5 DPPH radical scavenging capacity of fermented wheat bran

2.6 發酵對麥麩植酸質量分數的影響

由表2 可知，發酵后麥麩植酸質量分數顯著降低（P＜0.05），且隨著發酵時間的增加而呈現降低趨勢，曹偉超等也表明乳酸菌具有降解植酸的作用[35]。其中在發酵8～16 h 內植酸質量分數降低速度最快，發酵24 h 后乳酸菌處理組間植酸質量分數無顯著差異，這也與乳酸菌的生長趨勢基本一致。 在整個發酵期間，T3 組與T4 組發酵麥麩植酸質量分數無顯著差異（P>0.05）；發酵48 h 后，T2 組與對照組植酸質量分數無顯著差異。 麥麩中植酸質量分數降低有兩個方面的原因，麥麩糊粉層中含有內源性植酸酶[36]，其最適pH 為4.8～5.5[37]，乳酸菌發酵產生的乳酸可使麥麩基質pH 降低， 此時麥麩內源性植酸酶被激活促進植酸降解；同時，乳酸菌發酵過程中還可產生其他降解植酸的酶。 此外，乳酸菌細胞內含有低活性的植酸酶，但是細胞內的植酸酶可能不會參與到細胞外麥麩植酸的降解，因此麥麩中植酸可能會被乳酸菌細胞吸收進入到細胞內部[38]。 麥麩經乳酸菌發酵后植酸質量分數的降低對于麥麩中礦物質及蛋白質等營養物質的吸收具有積極作用。

表2 發酵過程中植酸質量分數的變化Table 2 Dynamic changes of phytic acid mass concentration during anaerobic fermentation of wheat bran

3 結語

乳酸菌作為食品工業中常見的益生菌，發酵麥麩對麥麩組分有一定的影響，且在改善麥麩的營養特性方面起到積極的效果，其增加麥麩可溶性膳食纖維的功能為麥麩在食品中的應用提供了理論依據，同時為提高麥麩的附加值提供了有效途徑。 作者以植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌及布氏乳桿菌為發酵菌種，設置不同的發酵時間，探究乳酸菌發酵作用對麥麩組分動態變化的影響。 麥麩經乳酸菌發酵后其可溶性膳食纖維質量分數、蛋白質質量分數、總酚質量分數及DPPH 自由基清除能力顯著增加，淀粉質量分數及植酸質量分數顯著降低；此外，麥麩經乳酸菌處理后其質地蓬松、呈金黃色。 在發酵期間，麥麩各項組分的變化在24 h 內較為顯著，這也與乳酸菌的生長趨勢一致。 就本實驗使用的4 株乳酸菌而言，植物乳桿菌與布氏乳桿菌在提高麥麩可溶性膳食纖維質量分數及總酚質量分數方面效果較好，在實際生產過程中可提高麥麩的利用率。