新型稀奶油-大豆分離蛋白香基的制備

彭雨露， 吳淑蒙， 金亞美， 徐學明， 徐 丹

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

稀奶油因其風味價值廣受人們喜愛， 在菜式、甜點和烘焙食品中應用廣泛，但成本較高，蛋白源物質匱乏，風味物質的種類和含量還具有改善的潛力， 同時過多食用稀奶油也會引起膽固醇攝入過量、肥胖等問題。 因此在豐富奶油蛋白源物質的同時，需對奶油進行進一步增香處理，減少奶油用量并在提高營養價值的同時獲得更好的風味。

目前奶味香基的制備大多采用乳脂作為原料或底物，近年來也有研究者嘗試添加乳清和奶粉的方法來提高蛋白質含量[1]，但仍存在著成本相對較高和蛋白質種類單一的缺點。 大豆分離蛋白（soy protein isolate， SPI） 是以大豆為原料生產的一種優質植物蛋白，營養全面，脂肪含量低，氨基酸種類全面、含量豐富，并具有增鈣、降膽固醇等功效[2-3]。 將SPI 作為蛋白質底物添加到奶油中是一種創新嘗試，具有制備新型奶味香基的潛力。

隨著消費者對天然健康食品的日益青睞及國家監管部門對香精等食品添加劑的控制日趨嚴格，在奶味香基的制備方法中，生物法是改善香基品質及風味的一條可靠途徑。 生物法主要包括發酵工程技術和酶工程技術[4]，微生物發酵法除了豐富和提高基質香味之外，還可以帶來一些有益的健康屬性（如降低膽固醇）[5]。 而蛋白酶、脂肪酶的酶解作用可以降解底物獲得更多的肽、 氨基酸和脂肪酸等，不僅提高了食品的營養價值， 還可以提供呈味組分、風味物質以及風味前體物質，尤其中短鏈脂肪酸可以賦予食品更好的感官特性[6]；此外，蛋白酶解物還可以有效促進乳酸菌生長， 大大縮短發酵時間，促進產酸產香[7]。 目前大多用單一的發酵工程技術或酶工程技術來制備奶味香基，兩者單獨使用時都存在著各自的不足， 前者的缺點在于香氣強度不高，香氣產率較低； 而后者的不足在于香氣類型單一，易產生不良風味。

作者將SPI 加入稀奶油中作為蛋白源底物，將植物蛋白與動物蛋白相結合，構建全新復合底物體系，豐富稀奶油的蛋白質組成，提高蛋白質含量，拓展奶味香基的營養價值以及風味和口感類型。 SPI部分替代稀奶油能夠進一步降低香基的生產成本，并且拓寬SPI 的利用渠道，延伸產業鏈，提高經濟效益。 此外，SPI 的水解物還可以促進乳酸菌生長，產酸產香，節約時間成本。 在此基礎上，作者將兩種最為常見的酶法：一步法（底物中同時添加蛋白酶和脂肪酶進行酶解獲得最終產品）和兩步法（底物先經蛋白酶作用，再經脂肪酶作用獲得最終產品），與發酵法相結合制備得到兩種不同的稀奶油-SPI 復合風味香基，與目前用單一的發酵法或酶法所制備奶味香基相比，能夠兼具酶法和生物法的優點。 目前人們對奶味香基的研究主要集中在工藝的優化、菌酶種類的篩選、風味物質的測定和對比等方面[1，4]，并未對風味形成與主要代謝物變化建立系統的分析。 本研究旨在探究2 種酶法與發酵法結合所制備得到的香基其感官、 主要代謝物和風味物質的差異，并建立三者之間的聯系，以此來探討酶技術和發酵技術最優的結合。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稀奶油：雀巢（中國）有限公司；SPI：臨沂松山生物制品有限公司；風味蛋白酶（50000 U/g）：上海怡竹生物科技有限公司；Palatase 20000L（20000 U/g）脂肪酶：諾維信（中國）生物技術有限公司；所有其他化學品和分析標準品：國藥化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Primo R 型臺式離心機： 美國加利福尼亞州賽默飛世爾科技公司；超凈工作臺：上海博訊實業有限公司；PQX 型多段可編程恒溫培養箱： 浙江寧波東南儀器有限公司；DV3T 型黏度計： 美國Brookfield 公司；UltraScan Pro1166 型色差儀： 美國Hunter Lab 公司；FE20 型pH 計： 上海梅特勒儀器有限公司；DKZ 型電熱恒溫振蕩水浴鍋： 上海一恒科技有限公司；KQ-3OODE 型數控超聲波清洗器：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 1100 型高效液相色譜儀： 美國安捷倫科技有限公司；GC-2030AF 型氣相色譜儀、QP2010 Plus Ultra 系統氣相色譜-質譜聯用儀：日本島津公司。

1.3 實驗菌種、培養基與菌種生長條件

本研究使用的乳酸菌菌株是從傳統奶酪中分離的干酪乳桿菌Lactobacillus casei， 由江南大學食品學院提供。 該菌株在30 ℃于MRS 培養基中厭氧培養，在接種到樣品中之前，以接種體積分數2%在MRS 液體培養基中進行2 次16～20 h 的傳代培養。

1.4 實驗方法

1.4.1 兩種不同酶解方法與發酵結合得到的稀奶油-SPI 復合風味香基的制備 稀奶油和SPI 以質量比7∶1 混合，充分攪拌，90 ℃滅菌15 min，然后冷卻至室溫得到底物。 如圖1 所示，一步酶法結合發酵得到的香基制備時在底物中同時加入1.5×107CFU/g（稀奶油-SPI 混合底物）的干酪乳桿菌、質量分數0.1%的蛋白酶（風味蛋白酶）和質量分數0.1%的脂肪酶 （Palatase 20000L），30 ℃恒溫培養6 h，90 ℃滅菌15 min 得到最終樣品。 在制備兩步酶法結合發酵得到的香基時，首先在底物中接種濃度為1.5×107CFU/g 的干酪乳桿菌，同時加入質量分數為0.1%的蛋白酶，30 ℃培養12 h，90 ℃滅菌15 min，冷卻至45 ℃后再加入質量分數為0.1%的脂肪酶，45 ℃水解3 h，90 ℃滅菌15 min，得到最終樣品。 其中，奶油與SPI 添加比例、酶制劑的選擇、菌、酶添加量、發酵與酶解的時間和溫度均基于生產商指南與實驗室前期感官評價工作確定。 尤其是兩種不同酶法與發酵法結合制備香基時溫度、 時間的不同，即分別為6 h（30 ℃）和12 h（30 ℃）+3 h（45 ℃），均基于感官評價選擇經優化后的最佳工藝條件。 兩種不同方法均選擇最佳風味條件下的樣品進行進一步主要代謝物和風味的測定與探討。

圖1 2 種不同酶法與發酵法結合制備稀奶油-SPI 復合風味香基流程圖Fig. 1 Process flow chart for the preparation of cream -SPI mixed flavor by fermentation in combination with two different enzymatic hydrolysis methods

1.4.2 黏度測定 使用黏度計測定樣品黏度，測定溫度為25 ℃，測定時間為180 s。

1.4.3 色度測定 色差儀進行測定。

1.4.4 可滴定酸和pH 測定 滴定酸度（以乳酸百分比計） 根據官方分析化學家協會（AOAC）920.124測定， 以酚酞作為指示劑，0.1 mol/L 的氫氧化鈉標準溶液用于中和滴定，用pH 計測定。

1.4.5 感官評定 參考Xu 等的方法， 對樣品進行感官評價[8]。 感官評價小組由20 名經過培訓的成員（10 位男性和10 位女性，年齡20～25 歲）組成。 以10 分制對每種感官屬性進行打分。

1.4.6 有機酸測定 取1 g 奶油樣品并用超純水稀釋至25 mL，25 ℃振蕩1 h，10000 g 離心30 min，收集上清液過0.22 μm 微孔濾膜，使用高效液相色譜儀進行測定。色譜柱：Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm×9 μm）； 流動相：0.008 mol/L 的H2SO4；流量：0.6 mL/min；檢測器波長：210 nm；柱溫：50 ℃；進樣量：10 μL。

1.4.7 多肽相對分子質量測定 取1 g 奶油樣品并用超純水定容至25 mL，25 ℃振蕩1 h，10000 g 離心30 min 后收集上清液并用0.22 μm 濾膜過濾，采用凝膠排阻高效液相色譜法測定。 色譜柱：TSKgel 2000 SWXL（300.0 mm×7.8 mm）；柱溫：30 ℃；檢測波長：220 nm；流動相：乙腈-水-三氟乙酸，體積比為40∶60∶0.1；流量：0.5 mL/min。

1.4.8 游離氨基酸測定 取1 g 奶油樣品并用質量分數5%的三氯乙酸定容至25 mL， 常溫超聲20 min后靜置2 h，10000 g 離心30 min 后進行微孔過濾，色譜條件按照Zhou 等設定[9]。

1.4.9 游離脂肪酸測定 參照Bao 等的方法進行游離脂肪酸的測定[6]，略有改動。 取5 g 奶油樣品與1 mL 2.5 mol/L 的H2SO4和5 mL 內標物（質量濃度500.0 mg/L 的C19∶0乙醚溶液）振蕩混合1 min，0 ℃下10000 g，離心10 min，靜置1 h，收集上清液并轉移至含有3 g 無水Na2SO4的離心管中， 加入10 mL 正己烷，同樣條件下離心后取上清液。用3 mL正己烷-乙醚（體積比1∶1）平衡氨丙基分離小柱，將1 mL 上清液過柱，再用2 mL 正己烷-乙醚（體積比1∶1）過柱2 次以洗脫三?；视王?，然后用2 mL 含有質量分數2%甲酸的乙醚溶液過柱并收集濾液，氮氣吹掃濃縮樣品。 之后加入3 mL BF3-乙醚和甲醇（體積比1∶3），置于70 ℃水浴回流反應5 min，冷卻后加入3 mL 正己烷萃取，振蕩，吸取上層正己烷相并用氣相色譜分析。 載氣為氦氣，流量為1.2 mL/min。程序升溫條件如下：165 ℃保持10 min，以7.4 ℃/min升溫至200 ℃，保持22 min。

1.4.10 揮發性風味物質測定 采用固相微萃?。⊿PME）與氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對揮發性化合物進行測定。 取5 g 樣品于20 mL 頂空小瓶中，60 ℃水浴平衡20 min。 將老化后的萃取頭（PDMS/DVB） 插入小瓶頂部空間吸附萃取40 min，之后將其插入氣相色譜進樣口，解吸9 min。按照Xi等的方法進行色譜和質譜條件的設定[10]。 揮發性化合物通過與NIST 圖庫中的質譜進行比較并根據Vandendool 等的方法[11]計算保留指數（RI）來進行鑒定，同時，以2-辛醇為內標采用半定量的方式計算揮發性化合物的含量。

1.4.11 數據分析 所有實驗均至少重復3 次，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS 19.0 進行統計分析，運用方差分析法（ANOVA）的Duncan’s 法評估顯著性差異， 顯著性水平設為P＜0.05。 采用Origin 2018 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 風味香基的基本特性與感官評價

如表1 所示，與對照組相比，一步酶法組和兩步酶法組的黏度都顯著上升，但兩者之間無顯著性差異。 在色度方面，L*代表亮度指數，0 為黑色，100為白色；a*表示紅綠的顏色指數， 正值越大代表顏色越紅， 負值越小代表顏色越綠；b*表示黃藍的顏色指數，正值越大代表色澤越黃，負值越小表明色澤越藍。 可以看出，對照組與處理組在色度上皆無顯著性差異。

表1 奶油樣品的基本特性Table 1 Characteristics of cream samples

可滴定酸度和pH 可以反映樣品的性質， 并且與產品的發酵、蛋白水解和脂解水平有關。 處理組中的可滴定酸度明顯高于空白對照，這一方面歸因于從蛋白質中降解的肽和氨基酸的積累，它們可以作為干酪乳桿菌的營養物質，從而促進其生長和產酸[12]；另一方面是由于脂肪分解形成游離脂肪酸。與兩步酶法組相比，一步酶法組的酸度較低，這主要是因為乳酸菌、蛋白酶和脂肪酶共同添加時，脂肪水解生成的大量游離脂肪酸抑制干酪乳桿菌生長產酸[13]。pH 降低的趨勢與滴定酸增加的趨勢是一致的，這主要是由乳酸濃度和溶解在水相中的離解型脂肪酸的濃度決定的。 兩步酶法組的pH 較一步酶法組低的原因可能是前者實驗中乳酸菌生長代謝更為旺盛，積累了更高質量濃度的乳酸，而乳酸電離生成H+能力比游離脂肪酸強；并且脂肪酶酶解產生的脂肪酸多溶于乳脂中，只有少數中短鏈脂肪酸會溶于水相[13]。

圖2 顯示了3 組樣品的感官評價結果。 兩組處理組的干酪味顯著高于對照組且差異較小，而兩步酶法組表現出較高的酸味和發酵香味屬性，一步酶法組的刺激性酸敗味最為明顯。 總體來說，兩步酶法組的感官評價最佳。

圖2 奶油樣品感官評價Fig. 2 Sensory evaluation of cream samples

2.2 有機酸

有機酸可以作為風味物質或風味前體物質參與代謝活動。 由表2 可以看出，兩步酶法組的乳酸濃度較一步酶法組更高，這與pH 的結果一致，進一步證明脂肪酶和蛋白酶、乳酸菌共同添加，抑制了蛋白酶的水解和乳酸菌的增殖代謝活動。 一步酶法組中的乙酸質量分數高于兩步酶法組，這是因為乙酸不僅可以由糖酵解和檸檬酸代謝途徑產生， 還可以通過酮類和醛類的氧化生成[14]，而一步酶法組由于較長的脂肪酶解時間可能積累了更為豐富的游離脂肪酸并被代謝生成醛類、酮類等。 兩步酶法組的檸檬酸質量分數較低，可能是由于更多地代謝轉化為3-羥基-2-丁酮等揮發性風味化合物[14]。 與對照組相比，兩組處理組中均可以觀察到蘋果酸的消耗以及丁二酸的積累。

表2 奶油樣品的有機酸質量分數Table 2 Mass Concentration of organic acids in cream samples單位：mg/g

2.3 多肽相對分子質量

蛋白降解為肽類和氨基酸不僅可以增強營養價值也可以提高香基的風味品質。 為了解香基的蛋白質水解情況，作者對其的多肽相對分子質量進行了測定。 色譜圖主要分為4 個峰區：相對分子質量大于10000 的蛋白質區（I 區），相對分子質量為1000～10000 的大相對分子質量肽和多肽區（II區），相對分子質量為180～1000 的小肽區（III 區）和相對分子質量小于180 的氨基酸區（IV 區）。

如圖3 所示，相較于對照組，兩組處理組在I 區的峰值明顯更低， 在II、III 和IV 區的峰值更高，表明處理組都能不同程度降解蛋白質并積累肽和氨基酸。 與一步酶法組相比， 兩步酶法組在I 區和II區前半部分的峰值更低，而在II 區后半部分以及III和IV 區的峰值更高， 這說明兩步酶法組降解蛋白質和大相對分子質量肽更為完全，積累多肽、小肽和氨基酸的效果也更為顯著。 這一方面是由于其蛋白質水解時間更長，另一方面也是因為蛋白酶和乳酸菌活性沒有受到脂肪酶共同添加時帶來的抑制影響，能夠更好代謝蛋白質形成肽和氨基酸[13]。

圖3 奶油樣品中多肽相對分子質量分布Fig. 3 Relative molecular weight distribution of peptides in cream samples

2.4 游離氨基酸

游離氨基酸既可以反映產品的蛋白質水解情況，同時也可以作為合成揮發性風味化合物的重要前體物質[13]。 由圖4 可知，相比于對照組，兩組處理組中谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸質量濃度顯著提高。 谷氨酸本身可以作為一種增味劑，它的增加可以減少苦味并影響甜味特性[15]。 兩步酶法組與一步酶法組相比，其天冬氨酸、組氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸質量濃度更高，而絲氨酸、甘氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸的質量濃度則相對較低，這主要是由于菌和酶在消耗代謝時，其特異性、綜合性和復雜性所決定的，各種氨基酸轉化并不是每個單一氨基酸轉化反應的簡單加成[16]，氨基酸也會轉化成大量的醛類、羧酸類、醇類、胺和吡嗪等化合物[17-18]。 同時，這也與兩步酶法組在感官上具有較高的發酵香味屬性以及總體評價相符合，因為高濃度的天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸對其乳脂味和甜味有著積極影響[19]。

圖4 奶油樣品中游離氨基酸質量濃度Fig. 4 Free amino acids mass concentration of cream samples

2.5 游離脂肪酸

乳脂是乳香氣最重要的來源，乳脂水解生成的游離脂肪酸能與蛋白質水解以及其他反應的產物形成一定范圍的恰當的平衡關系，可獲得香基的特征風味[20]。 由圖5 可以看出，C16∶0、C18∶1、C18∶0和C14∶0是所有樣品中最豐富的游離脂肪酸，這與先前報道的研究結果一致[21]。雖然乳酸菌、蛋白酶和脂肪酶共同添加時脂肪酶會被蛋白酶水解，較低的酶解溫度一定程度上也會抑制脂肪酶的活性，但是一步酶法組由于酶解時間較長， 仍舊積累了豐富的游離脂肪酸。 然而，在脂肪酶長時間酶解高脂肪體系產生的大量游離脂肪酸中，中短鏈酸濃度過高會帶來刺激性酸味[14]，而具有蠟味、苦味的長鏈脂肪酸的大量積累，也會對風味有不良影響[22]。這可能是導致一步酶法組感官評價中刺激性酸敗味較高，總體評價也較低的原因。

圖5 奶油樣品中游離脂肪酸質量濃度Fig. 5 Free fatty acids mass concentration of cream samples

2.6 揮發性風味化合物

奶味香基中的風味化合物是蛋白質、 脂類、糖類和檸檬酸代謝的生物和/或生化轉換的結果，它們之間的分解代謝構成復雜的代謝網絡，各個途徑又相輔相成，互相影響[23]。 采用SPME-GC-MS 法測定了3 組樣品中的揮發性化合物，空白對照組、一步酶法組、 兩步酶法組分別共檢出52、56、57 種揮發性物質。 圖6 顯示了樣品中揮發物的相對豐度和分布，顏色代碼表示相對豐度，范圍從藍色（低豐度）、白色到紅色（高豐度）。

圖6 奶油樣品中揮發性風味物質熱圖Fig. 6 Heat map of volatiles in cream samples

揮發性酸主要在脂解過程中釋放， 也通過酮、酯、醛的氧化和氨基酸的分解代謝產生[24]。一步酶法組的中長鏈揮發性酸質量濃度顯著提高，該組中大多數醇類、醛類的質量濃度降低，進一步證明它們更多地代謝轉化為揮發性羧酸類物質。 乙酸、丁酸和己酸這幾種短鏈揮發酸作為風味的重要貢獻者，它們在一步酶法組中的質量濃度顯著低于兩步酶法組，可能是由于基質和其他風味化合物的綜合作用[21]。

2，3-丁二酮和3-羥基-2-丁酮主要來自乳糖、檸檬酸和碳酸鹽代謝產生的丙酮酸，兩者都提供了奶油風味，3-羥基-2-丁酮更是奶酪產品中常見的強效氣味化合物[13]。 兩步酶法組中的3-羥基-2-丁酮含量更高，一方面和該組檸檬酸代謝旺盛的結果相一致，另一方面也說明干酪乳桿菌未受到大量游離脂肪酸的抑制作用，快速增殖，增強了乙偶姻脫氫酶的活性，使得2，3-丁二酮更多還原成3-羥基-2-丁酮[13]。己醛具有典型的豆腥味和草腥味，兩組處理組均可以顯著降低其濃度。 Li 等也研究發現發酵豆奶中己醛含量會顯著降低[25]。 苯甲醛、糠醛、δ-十二內酯作為幾種常見的重要芳香物質，可分別賦予產品焦糖杏仁香、杏仁堅果香、椰果香，它們在兩步酶法組中含量最高，這可能與該組中乳酸菌的生長代謝活動較為旺盛有關。 而兩步酶法組在感官評價中表現出較高的酸味和發酵香味屬性，這與它高含量的短鏈揮發性羧酸、3-羥基-2-丁酮、 苯甲醛、糠醛、δ-十二內酯等重要揮發性風味物質密切相關。

3 結語

作者采用一步酶法和兩步酶法結合發酵處理稀奶油-SPI 復合體系， 制備出兩款新型風味香基。SPI 部分替代稀奶油在降低香基成本的同時， 將動物蛋白與植物蛋白相結合，豐富了蛋白質來源的組成和含量， 提高了香基的營養價值和風味類型，此外，酶法與發酵法相結合的方式克服了單一法制備香基時的不足。 同時，目前針對奶味香基在風味與主要代謝物之間的聯系鮮有系統的分析。 而本研究結果表明， 不同酶法結合發酵制備的香基在感官、主要代謝物、 揮發性風味物質上都存在明顯不同。具體表現為，前者具有較高含量的游離脂肪酸和中長鏈揮發性酸，導致其刺激性酸敗味較高；而后者則積累了更高質量濃度的多肽和氨基酸、短鏈揮發性羧酸以及3-羥基-2-丁酮、苯甲醛、糠醛、δ-十二內酯等重要揮發性風味物質，這可能與其旺盛的乳酸菌代謝活動相關， 也使其獲得更高的風味評價?？傮w來說，兩步酶解法結合發酵法是制備新型稀奶油-SPI 復合風味香基的最佳方法。