白酒釀造中丙酸菌及應用的研究進展

張 維，牟飛燕，陳 玫，董孝元，常 煦，方尚玲，陳茂彬*

（1.湖北工業大學 生命科學與健康工程學院 工業發酵省部共建協同創新中心 發酵工程教育部重點實驗室 工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.黃鶴樓酒業有限公司，湖北 武漢 430068；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

中國白酒是以谷物（高粱、大麥、大米、玉米、糯米等）為主要原料，經蒸煮、糖化發酵（特制的糖化發酵劑如大曲、小曲、麩曲等中微生物與酶作用）生成糖、酸和醇等物質，再經蒸餾、陳釀、勾兌制成傳統蒸餾酒[1-3]。白酒中水和乙醇約占98%，微量成分物質占2%左右[4-5]，中國白酒十二大香型之間的差異主要由這2%的微量成分決定。微量成分主要由酯類、醇類、酸類、醛酮類等組成[1]，其中酸類物質占總量的14%～16%[6]，主要包含乙酸、乳酸、己酸和丁酸[7]。白酒中的酸類物質主要作為呈味物質，與乙醇酯化成酯類物質，進一步影響白酒的風味。

相較于乙酸、乳酸、己酸和丁酸在白酒中的含量，丙酸的含量偏低，但對不同香型白酒的風味形成都具有不同程度的作用。作為微量成分中有機酸之一，丙酸及丙酸乙酯對白酒的風味組成具有一定的貢獻。白酒風味中，丙酸與丙酸乙酯分別呈現出酸性氣味和菠蘿香香味、味略澀、似芝麻香。徐軍[8]利用氣質聯用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）技術在濃香型白酒中檢測到丙酸及丙酸乙酯。趙文武等[9]利用氣相色譜法在醬香型白酒中檢出丙酸及丙酸乙酯。郝俊光等[10]利用高效液相法在米香型白酒中檢測到丙酸及丙酸乙酯。丙酸及丙酸乙酯其含量在閾值范圍內其作用與釀造過程中丙酸菌的產酸能力具有正相關關系，丙酸乙酯以丙酸為基礎合成物質，所以丙酸菌的產酸能力關乎著丙酸乙酯的合成量。

在國外，丙酸菌的首次重要出現可以追溯到1828年，對于丙酸菌的研究大多數集中于乳制品生產中丙酸菌的作用以及分類學的問題，而在白酒行業中報道較少[11]；在國內，對于丙酸菌的研究較早于20世紀90年代后期白酒行業從業者提出利用丙酸菌降低濃香型白酒釀造中的乳酸含量[12]。辛秀明[13]研究發現，丙酸乙酯作為特香型白酒的主體物質，丙酸菌對特香型白酒風味的形成有著重要作用，然而，近幾年在白酒釀造中相關學者有所觸及到丙酸菌與產酯霉、己酸菌、乳酸菌共培養以增加丙酸乙酯的含量，降低乳酸含量，但是對丙酸菌在白酒釀造中的代謝途徑及對不同香型白酒風味的貢獻相關報道較少。

本文從白酒釀造中產酸微生物、丙酸菌的代謝途徑以及在白酒釀造中的應用3個方面綜述了丙酸菌應用于白酒釀造中的研究進展，旨在為今后丙酸菌應用于生產實踐、提高白酒品質起到一定的借鑒作用。

1 白酒釀造中產酸微生物

在白酒釀造中，四大酸（己酸、乙酸、乳酸、丁酸）產生菌被相關學者絡繹不絕的研究，其種類及形態特征總結見表1。侯小歌等[14]從宋河中高溫大曲和中溫大曲中進行醋酸菌的分離得到6株醋酸菌，分別為氧化葡糖桿菌（Gluconobacter oxydans）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）和醋化醋桿菌（Acetobacter aceti），并篩選出產酸較快且產酸量最大的醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）AAB4。趙皓靜等[15]從濃香型白酒酒醅中篩選出一株耐酸產酸特性較好的耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）FBKL1.0204，耐酸特性研究表明，在乳酸、乙酸和鹽酸酸化的酸性發酵環境中，菌株FBKL1.0204能耐受pH 4的酸性環境，極端生存pH值為3；產酸特性研究表明，菌株FBKL1.0204為異型乳酸發酵，主要代謝生成乳酸和乙酸。李霄霄[16]從醬香型白酒酒醅和大曲中分離得到25株乳酸菌，并篩選出了耐乳酸、耐酒精、耐高溫的高產L-乳酸植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），對其產L/D-乳酸以及代謝產物進行研究，結果表明，植物乳桿菌GT-L-22的乳酸產量最高為65.12 g/L，乳酸片球菌GT-L-56的乳酸產量為62.28 g/L。衡文[17]在厭氧條件下，通過傳統培養技術從濃香型白酒窖泥富集液內分離篩選得到32株高產丁酸的功能菌，通過響應面法對菌株AB2RH05-2發酵產丁酸進行了培養基優化，并在此基礎上采用單因素法對其發酵產丁酸的培養條件進行了優化，最終丁酸產量為15.5 g/L，相比優化前（3.32 g/L）提高了3.7倍。彭志云等[18]從濃香型白酒窖泥中分離出丁酸產量高達14.23 g/L的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）。彭兵等[19]從優質窖泥中分離得到己酸產量可達4.36 g/L的克氏梭菌（Clostridium kluyveri）。晉湘宜等[20]從湖北某酒廠優質窖中篩選出了己酸產量高達9.4 g/L的速生梭菌（Clostridium celerecrescens）。辛秀明[13]從特香型白酒窖泥及大曲中分離得到4株丙酸菌，并篩選出了耐酸性強、乳酸利用率高、丙酸產量高的詹氏丙酸桿菌（Propionibacterium jensenii）。

表1 產酸微生物種類及形態特征Table 1 Species and morphological characteristics of acid-producing microorganisms

白酒釀造過程中，醋酸菌、乳酸菌、丁酸菌和己酸菌在發酵過程中產生的酸類物質（己酸、乙酸、乳酸、丁酸）是白酒風味物質的主要成分之一，由丙酸菌所產丙酸雖不是白酒風味中主要成分之一，但是在醬香型白酒中有檢測出含量在100 mg/L以上的丙酸[9]、通過GC-MS儀器于濃香型白酒中檢測到丙酸乙酯[8]，丙酸菌低于四大酸菌于白酒風味的貢獻，但是丙酸菌的存在可一定程度上解決四大酸比例失調的問題，乳酸菌較其他三大酸菌適應性更強，生長繁殖代謝突出使其在白酒釀造中處于優勢地位，尤其在濃香型白酒釀造中，因此，丙酸菌利用乳酸發酵特性可得以發揮重要作用；而且，丙酸菌所產丙酸為丙酸乙酯的前體物質，其含量直接影響著丙酸乙酯的合成，丙酸乙酯作為白酒風味物質的成分之一，對白酒的品質起著不容小覷的作用，可見丙酸菌在白酒釀造中的存在不可忽視。

2 丙酸菌簡介

丙酸產生菌株主要集中在丙酸桿菌屬，1928年VAN NIEL C B[24]對丙酸菌作了比較詳細的研究。丙酸桿菌屬多數為厭氧菌，有多個種和亞種，但是不同種間對氧的耐受性不同[23]。樂華愛等[25]于1986年從沼氣發酵液中分離得一個新種，并命名為北京丙酸桿菌（Propionibacterium beijingense）；程志娟等[26]于1988年分離得到一株丙酸菌，并命名為丙酸菌津輕-10，且將其應用在濃香型白酒釀造中降低了酒中乳酸及酯類含量；張付旺等[27]將丙酸菌津輕-10應用在濃香型白酒發酵中發現，丙酸菌津輕-10可以起到“增己降乳”的作用。

2.1 丙酸菌的生理特性

丙酸菌是一種厭氧菌，需要在缺氧或微氧環境下生長，革蘭氏陽性，不運動，適宜的生長溫度為30～37 ℃、pH值為6.5～7.5，含有丙酸鹽的培養基有利于發酵產生丙酸[28-29]。丙酸菌具有較強的抗氧化特性，可以降低細胞內游離基的含量，減輕細胞對氧化應激的反應[30]。在高濃度滲透壓環境下，水分子會從細胞內向外移動，導致細胞脫水，進而影響生理過程和代謝產物，丙酸菌具有較強的滲透適應性，能夠在高濃度溶液中生存和繁殖[31-32]。

2.2 丙酸菌的代謝途徑及產物

丙酸菌的代謝途徑中，以乳酸或葡萄糖為發酵底物的發酵產物分別有丙酸、乙酸、琥珀酸及少量的CO2。如圖1所示，乳酸在乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）的作用下生成丙酮酸；葡萄糖在細胞中通過糖降解途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvic acid，PEP），其中糖降解包括己糖二磷酸途徑（embden-meyerhof-parnas pathway，EMP）和磷酸戊糖途徑（hexose monophosphate pathway，HMP）[33]。磷酸烯醇式丙酮酸作為一種高能中間化合物可以轉化生成丙酮酸和草酰乙酸[34-35]。草酰乙酸經過琥珀酸途徑生成琥珀酸；少量的參與到乙酸途徑生成乙酸，部分丙酮酸參與到Wood-Werkman循環生成丙酸，另一較少的部分作為碳源生成菌體的組成部分[36]。

圖1 丙酸菌的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways of propionic acid bacteria

在乙酸生成途徑中，經酶復合體的作用下，丙酮酸生成乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）且反應過程中輔酶A（CoA）轉化生成CO2；乙酰輔酶A具有高能硫酯鍵經酶的催化易生成乙酰磷酸；最后，在乙?；福╝cetylase，Ace）的作用下生成乙酸[37-39]。

在Wood-Werkman循環途徑中，丙酮酸在草酰乙酸轉羧基酶（oxaloacetic transcarboxylase，OTC）的作用下生成草酰乙酸，經蘋果酸脫氫酶（malic dehydrogenase，MDH）作用下草酰乙酸生成蘋果酸，蘋果酸在富馬酸酶（fumarase，Fas）的作用下生成富馬酸，在琥珀酸酶（succinase，Scs）的作用下富馬酸生成琥珀酸。琥珀酸進一步轉化生成琥珀酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A，甲基丙二酰輔酶A在草酰乙酸轉羧基酶的作用下生成甲?；o酶A。最后，在丙酰輔酶A和琥珀酸經過丙酰輔酶A、琥珀酸輔酶A轉移酶催化作用后，生成了丙酸和琥珀酸輔酶A[40-42]。

據相關報道，理論上以乳酸為底物發酵過程中，3 mol乳酸生成2 mol丙酸、1 mol乙酸、1 mol CO2、1 mol H2O和能量；在EMP途徑中1 mol葡萄糖生成2 mol丙酮酸、2 mol還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和能量；HMP途徑中，3 mol葡萄糖生成5 mol丙酮酸、6 mol二氧化碳、12 mol NADH和6 mol H+；乙酸途徑中，1 mol丙酮酸生成1 mol乙酸、1 mol CO2、1 mol NADH和1 mol腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）；Wood-Werkman循環途徑中，1 mol丙酮酸生成1 mol丙酸、2 mol煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和1 molATP[13]。

綜上，在理論層面可得到丙酸菌在代謝過程中以葡萄糖和乳酸為發酵底物產丙酸的生化反應方程式：

3 丙酸菌在白酒釀造中的應用

由丙酸菌發酵生成的丙酸能抑制微生物合成丙氨酸，主要抑制酵母和霉菌的生長，從而起到抗菌作用，白酒釀造過程中可調控微生物區系分布，在存放過程中可防止腐敗菌的生長。丙酸乙酯的香味主要是菠蘿香香味，味略澀、似芝麻香，在不同香型白酒中都有檢測到，如醬香型白酒、濃香型白酒、清醬兼香酒、特香型白酒等，其中特香型白酒以丙酸乙酯為主體香[43]。

3.1 促進丙酸乙酯的合成

丙酸菌產生的丙酸與乙醇于酒醅中共存，在特異性酶的作用下合成的丙酸乙酯都是白酒風味成分組成部分，丙酸乙酯的合成是以丙酸為基礎物質，丙酸含量與丙酸乙酯的合成量具有正相關性，即丙酸菌的存在可促進丙酸乙酯的合成；且丙酸具有酸性氣味、丙酸乙酯有著菠蘿香香味、味略澀、似芝麻香。

以山西“汾酒”為代表的清香型白酒具有清香純正、諸味協調、余味爽凈等特點，主體香乙酸乙酯與乳酸乙酯配比協調[42]。四川“瀘州老窖”作為濃香型白酒的典型代表，其風味特征為窖香濃郁、綿甜爽凈和回味綿長，主體香是己酸乙酯[44]。以貴州“茅臺”為主要代表的醬香型白酒，風味特征主要為醬香細膩、醇厚柔和、回味長久，主要香氣成分未定，趙文武等[9]通過對醬香型白酒中風味物質的分析發現，檢測出58種風味物質中含量在100 mg/L以上的物質達10余種，其中有乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸、丙酸等，具體香氣成分有待研究。

以江西“四特酒”為代表的特香型白酒香氣幽雅舒適、諸香協調、柔綿醇甜回味悠長，主體香為丙酸乙酯[43]。特香型白酒釀造中，丙酸菌對醛類的影響呈現出不規律性、一定范圍內酸類物質的變化與菌液濃度呈正相關性、酯類物質中丙酸乙酯與乙酸乙酯隨著菌液濃度增加呈上升趨勢而乳酸乙酯反之、醇類物質幾乎無影響；以丙酸乙酯為主體香的特香型白酒，將丙酸菌應用在特香型白酒釀造中可提高特征風味物質丙酸乙酯含量，提高特型白酒品質[13]。

3.2 降低乳酸及乳酸乙酯的含量

乳酸乙酯于白酒香氣成分擔任著重要角色，尤其是作為清香型白酒中的主體香成分之一[45-46]，乳酸乙酯含量較高導致酯類物質配比不協調使白酒香氣單一，帶澀味且缺乏綿柔感[47-48]。李俊輝等[49]研究發現，濃香型白酒釀造中由曲或窖泥帶有乳酸菌在適宜的生長情況下迅速生長繁殖，代謝大量的乳酸在酶的催化下生成大量的乳酸乙酯導致濃香型白酒主體香（己酸乙酯）與乳酸乙酯的比例失調，造成酒的風味、口感較差。

乳酸菌根據其適應性強的特性，在開放的白酒釀造過程中利用底物發酵生成大量的乳酸[50]。乳酸、葡萄糖以及其他可作為碳源的物質共存的情況下，丙酸菌優先利用乳酸（見圖1），乳酸在乳酸脫氫酶（LDH）的作用下生成丙酮酸，再經Wood-Werkman循環途徑生成丙酸及相應的副產物使乳酸含量降低，從而使酒醅中的酸度得以調節；乳酸為乳酸乙酯合成的前體物質，其含量與乳酸乙酯合成量呈正相關關系，乳酸含量的降低將導致乳酸乙酯的合成量減少，使得釀造白酒中的酯類物質比例更協調、口感更佳[51]。

3.3 增加白酒微量成分

丙酸菌以乳酸、甘油、葡萄糖等物質為碳源作發酵底物，生成丙酸及副產物，如乙酸、琥珀酸、CO2等[52]。丙酸、乙酸和琥珀酸與乙醇共存于酒醅中時經特異性酶的催化分別生成丙酸乙酯、乙酸乙酯和琥珀酸乙酯。丙酸乙酯與乙酸乙酯分別為特香型和清香型白酒的主要風味物質，將丙酸菌發酵液置于兩種香型的酒醅或窖池中可改善白酒的風味，相較于清香型白酒，特香型白酒受丙酸菌影響更大，根據丙酸菌代謝過程得到的生化反應可知乙酸的產量小于丙酸，且丙酸乙酯在特香型白酒風味物質中相較于其他酯類物質占比較大[53]。

4 展望

國內外學者聚焦于丙酸菌代謝產物的應用或提取，如丙酸作為防腐劑、甜味劑應用于食品行業，維生素B12的合成路徑及提取工藝優化，較少報道丙酸菌在不同香型白酒釀造中的應用，這與丙酸對白酒風味形成的貢獻及丙酸菌在白酒釀造中的產量有一定關聯；同時，丙酸可作為甜味劑應用于食品行業，在白酒釀造過程中丙酸是否有對白酒風味中甜味具有貢獻，這需要相關學者進一步研究；但是，白酒作為中國傳統的蒸餾酒，國外學者對此的研究更甚微，因此，丙酸菌在白酒釀造中代謝機理及丙酸和丙酸乙酯對白酒風味的影響機理展開深入研究是非常必要的。

根據相關文獻報道，以白酒風味為出發點，考察白酒釀造中丙酸菌代謝途徑以及如何影響白酒風味，在這方面應該有更具體的措施。當前，已有相關學者將丙酸菌與產酯霉菌共培養應用在特香型白酒生產中有效提高了丙酸乙酯的含量，丙酸具有抑菌活性，在產酯霉菌與其他霉菌之間，丙酸是否能夠抑制其他霉菌的生長從而使得產酯霉菌能夠獲得更多的營養物質代謝，以及兩者在共培養過程中相互影響機制有待商榷[13]；濃香型白酒釀造中出現己酸乙酯產量不夠、乳酸乙酯含量超標頻頻報道，相關學者提出利用作為乳酸降解菌代表--丙酸菌將其于酒醅中與己酸菌、乳酸菌共培養發酵，實現“增己降乳”、“增乙降乳”和“增丙降乳”，以此來提升酒的品質，但是其對應機制還需更詳細、深入的探討。

據目前相關報道丙酸菌、己酸菌和乳酸菌于酒醅中共培養時，理論上乳酸菌利用葡萄糖作碳源發酵生成乳酸，丙酸菌利用乳酸生成丙酸及副產物乙酸等，使得環境pH得以調節更適宜于己酸菌利用乙醇發酵生成己酸，對應的乙酯類物質含量受到影響，從而實現“增己降乳”、“增乙降乳”和“增丙降乳”；但是，實際培養過程中丙酸菌與乳酸菌都能對葡萄糖進行代謝，兩者之間存在著“競爭關系”，誰對葡萄糖更具競爭力有待研究；部分含有活細胞丙酸菌（詹氏丙酸菌、特氏丙酸菌）具有較強的抑菌活性，其作用的體現來源于丙酸桿菌體內含有抗菌活性肽，主要是抑制霉菌和酵母的生長，這對于己酸發酵及己酸乙酯的合成是否有影響且影響機制是什么，需進一步探討。

綜上所述，以期在未來的研究中能夠將丙酸菌應用在不同香型白酒釀造中，且可利用代謝組學、蛋白質組學、基因組學、風味組學和轉錄組學等相關組學技術以及細胞模型研究對其產生的作用機制。