發酵黨參黃酒的營養及功效成分分析

王 楠，高穎瑞，徐巧紅，胡芳弟*

（1.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學 甘肅省黨參產業技術工程研究中心，甘肅 蘭州 730000）

黨參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf）是一種治療脾胃虛寒、貧血和疲勞的中藥[1]，富含豐富的糖類物質，是良好的發酵基質。多糖是黨參中重要的活性成分之一，具有良好的抗氧化及免疫調節等作用。黨參經過發酵后，其多糖的含量顯著提高，體外抗氧化明顯增強[1-2]。黃酒作為我國最古老的酒種，富含氨基酸、γ-氨基丁酸、多酚、多肽、糖類等成分?！侗静菥V目》中詳載的藥酒多數也以黃酒制成。黃酒可以促進中藥中有效成分的溶出并降低毒副作用，達到減毒增效、矯臭去腥等作用[3]。本課題組前期研究已證實，黨參黃酒（Codonopsis pilosula Huangjiu，CHJ）比普通黃酒具有更豐富的營養價值及更強的抗氧化活性，發酵黨參中多糖、三萜、黨參炔苷、氨基酸、黃酮等成分及抗氧化活性均高于普通黨參[4-5]。目前國內外尚未有人對黨參黃酒進行系統研究，通過對黨參黃酒的成分及營養價值分析，全面闡述黨參黃酒的營養價值，證明其保健養生功效。

本研究以發酵黨參為原料，制備發酵黨參黃酒（fermentedCodonopsis pilosula Huangjiu，FCHJ）。以黨參黃酒（CHJ）為對照，測定FCHJ中的總酚、總黃酮、氨基酸及礦物元素含量及體外抗氧化活性，并采用小鼠脾淋巴細胞增殖實驗、RAW264.7細胞的增殖和吞噬作用及NO的釋放量探討發酵黨參黃酒多糖（fermentedCodonopsis pilosula Huangjiupolysaccharide，FCHJ-CP）體外免疫調節活性。旨在對發酵黨參黃酒的生物活性研究及產業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

新鮮白條黨參（Codonopsis pilosula）：甘肅岷縣；黍米、麥曲、酒藥：甘肅省五山池黃酒廠；高活性安琪酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、酵母膏：北京奧博星生物科技有限公司；瓊脂、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）、臺盼藍及紅細胞裂解液：北京索萊寶生物科技有限公司；葡萄糖：中國藥品生物制品檢定所；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：美國Sigma-Aldrich公司；中性紅染液：北京Solarbio科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、青鏈霉素溶液0.25%、胎牛血清：美國HyClone公司；NO測定試劑盒（A013-2-1）：南京建成生物工程研究所。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

多元素混標液（Ca、Fe、Na、Zn）（質量濃度為10 g/mL），質量濃度為K、Mg單標液（質量濃度為10 g/mL）：美國Inorganic Ventures公司；冬氨酸（aspartic acid，Asp）、蘇氨酸（threonine，Thr）、絲氨酸（serine，Ser）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、脯氨酸（proline，Pro）、甘氨酸（glycine，Gly）、丙氨酸（alanine，Ala）、胱氨酸（cystinol，Cys）、纈氨酸（valine，Val）、蛋氨酸（methionine，Met）、異亮氨酸（isoleucine，Ile）、亮氨酸（leucine，Leu）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、組氨酸（histidine，His）、賴氨酸（lysine，Lys）、精氨酸（arginine，Arg）等氨基酸標準品（純度均＞98%）：美國Sigma-Aldrich公司；糖化酶（酶活10萬U/g）：甘肅省五山池黃酒廠。

1.1.3 培養基

RPMI1640培養基：美國Gibco公司；DMEM高糖完全培養基：美國HyClone公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖1%。固體培養基在此基礎上添加瓊脂2%，121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

2030型四極桿電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀：日本SHIMADZU公司；MMULTIWAVE型微波消解儀：奧地利安東帕公司；LS-35LD滅菌鍋：美國致徽儀器有限公司；JP39V-1300破壁機：浙江蘇泊爾股份有限公司；XSP-36倒置顯微鏡：江西鳳凰光學控股有限公司；IS-RDD3臺式恒溫振蕩器：美國精騏公司；3110系列水套二氧化碳培養箱：美國Thermo Fisher Scientific公司；infiniteF50酶標儀：上海博源生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵黨參黃酒的加工工藝流程及操作要點

發酵黨參制備：選取優質新鮮兩年生白條黨參，洗干凈后用破壁機多次打漿直至成勻漿即得黨參樣品。將用溫水活化后的高活性干釀酒酵母菌接種于YEPD固體培養基中。30 ℃培養72 h后挑取單個菌落于YEPD液體培養基中，30 ℃、220 r/min振蕩培養，使菌落數達到1×107CFU/mL。取上述黨參樣品適量，高壓蒸汽滅菌后，加入10%體積的酵母菌菌液30 ℃培養48 h，即得發酵黨參。

黍米飯的制備：選取顆粒飽滿、無霉變蟲蝕的黍米洗凈按照料液比1∶0.75（g∶mL）浸泡8 h，蒸米30 min。

糖化：待黍米飯的溫度降至60 ℃左右時，分別加入發酵黨參、黨參樣品，按照0.2%添加量加入糖化酶攪拌均勻，60 ℃糖化12 h。

前發酵：將糖化結束后的黍米冷卻至30 ℃左右，分別按照0.1%、1%和15%添加量加入酵母、酒藥及麥曲，充分攪拌均勻，于30 ℃恒溫條件下進行前發酵7 d，待發酵醪液中幾乎無氣泡產生時轉入后發酵。

后發酵：前發酵結束后密封，于18 ℃恒溫發酵25 d。壓榨、過濾：將黃酒進行壓濾，取濾液在6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。

滅菌、裝瓶：90℃滅菌10min后裝瓶即得黨參黃酒（CHJ）和發酵黨參黃酒（FCHJ）。

1.3.2 發酵黨參黃酒多糖的制備

FCHJ-CP的制備[6]：取酒樣適量，加入無水乙醇至體系中乙醇體積分數至80%，4 ℃靜置24 h，收集沉淀后用木瓜蛋白酶及Sevage法去除蛋白質，將多糖溶液于截留分子質量為3 500 Da透析袋中透析48 h旋轉蒸發濃縮（70 ℃），冷凍干燥（-60 ℃，24 h）后即得發酵黨參黃酒多糖（FCHJ-CP）。

1.3.3 分析檢測

氨基酸含量測定：參照國標GB5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》；總酚、總黃酮的測定：參考文獻[7-8]中的方法；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子及羥基自由基清除活性：參考文獻[9-12]中的方法；礦物元素含量測定：參照文獻[5]的方法。

FCHJ-CP對小鼠脾淋巴細胞的免疫調節作用：參照參考文獻[13]分離脾淋巴細胞，以CHJ-CP作為最佳給藥濃度篩選的樣品，設置Control組（陰性對照）、多糖樣品組、ConA組、LPS組，參照文獻[14]進行實驗，測OD470nm值并計算刺激指數（stimulate index，SI）。

FCHJ-CP對RAW264.7細胞的免疫調節作用：參照參考文獻[15]進行小鼠巨噬細胞RAW264.7培養，設置陰性對照組（Control組）、陽性對照組（LPS組）以及樣品組，通過MTT實驗評價其增殖作用。細胞增殖率=樣品組OD570nm值/陰性對照組OD570nm值；采用中性紅實驗[16]測定其吞噬活力。細胞吞噬率=樣品組OD540nm值/陰性對照組OD540nm值；NO的抑制率：采用NO測定試劑盒[17]。

1.3.4 氨基酸營養及呈味分析

氨基酸營養評價方法通過計算必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）占氨基酸總量（total amino acid，TAA）的比例，與世界衛生組織（world healthorganization，WHO）/聯合國糧農組織（food and agriculture organization of the united nations，FAO）修訂的人體必需氨基酸含量模式譜比較，計算氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系數（ratio coefficientof aminoacid，RCAA）、氨基酸比值系數評分（score of ratio coefficient of amino acid，SRCAA）、化學評分（chemical score，CS）、必需氨基酸指數（essential amino acid index，EAAI）進行評價，其計算公式如下：

氨基酸呈味評價方法通過計算劑量比閾因子（doseover-threshold factors，DOT）和味道指數（taste index，TI）進行評價，其計算公式如下：

1.3.5 數據處理

使用SPSS25.0對數據進行顯著性差異分析。每個實驗均重復3次，數據以“平均值±標準差”表示。使用OrignPro 2023版及GraphPad Prism 8進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵黨參黃酒的氨基酸分析

以黨參黃酒（CHJ）為對照，測定發酵黨參黃酒（FCHJ）的游離氨基酸含量，結果見表1。

表1 發酵黨參黃酒中氨基酸含量測定結果Table 1 Determination results of amino acid contents in fermented Codonopsis pilosula Huangjiu mg/L

由表1可知，發酵黨參黃酒（FCHJ）、黨參黃酒（CHJ）分別共檢出17種氨基酸，包含8種必需氨基酸。FCHJ的TAA為7 571.43 mg/L，CHJ的TAA為6 932.82 mg/L，說明發酵黨參加入后可顯著提高黨參黃酒中氨基酸的含量（P＜0.05）；FCHJ和CHJ的EAA/TAA高于或接近WHO/FAO提出的理想蛋白模式（EAA/TAA=0.4），說明二者均具有良好的營養價值。

Glu、Asp、Arg、Gly、Phe、Tyr、Met、Leu、Lys 9種氨基酸被稱為藥用氨基酸，是指人體不能自身合成，但對維持氮平衡有重要作用的氨基酸[18]。由表1可知，FCHJ中藥用氨基酸占總氨基酸比例顯著高于CHJ（P＜0.05），其中Glu、Asp和Lys的含量最高，總占比占藥用氨基酸的50%以上；且FCHJ中Glu的平均含量（1 333.80 mg/L）顯著高于CHJ中Glu的平均含量（924.07 mg/L）（P＜0.05）。Glu可以作為中樞及大腦的補劑，同時對治療肝病也有極大的作用[19]；Asp對增強肝功能，緩解疲勞，預防心臟病等有重要作用，Lys可促進人體發育，對免疫及中樞功能的增強，均有重要作用[20]。

發酵黨參加入后可顯著提升黨參黃酒中氨基酸總量、藥用氨基酸及必需氨基酸含量，尤其是Glu，且添加發酵黨參后可顯著提升黨參黃酒中藥用氨基酸的占比（P＜0.05）。FCHJ的EAA/TAA接近WHO/FAO的理想模式，說明發酵黨參黃酒具有較好的營養價值，可作為日常保健及食補之用。

2.1.1 氨基酸的營養評價分析

必需氨基酸占總氨基酸的含量百分比與WHO/FAO模式越接近，表明其蛋白質質量越好[21]。兩種黃酒必需氨基酸占總氨基酸的含量百分比見表2。RAA和CS的值越接近1，說明蛋白質的營養價值越高[22]，低于1的為限制性氨基酸，其中最小的為第一限制性氨基酸[23]。兩種黃酒必需氨基酸的評分值見表3。兩種黃酒必需氨基酸比值系數、比值系數評分及指數值見表4。

表2 必需氨基酸占總氨基酸的含量百分比Table 2 Percentage of essential amino acids in total amino acids%

表3 必需氨基酸的評分值Table 3 Score values of essential amino acids

表4 必需氨基酸比值系數、比值系數評分及指數值Table 4 Ratio coefficient, score of ratio coefficient and indexes values of essential amino acids

由表2可知，2個樣品的必需氨基酸占總氨基酸的含量百分比均高于根據WHO/FAO模式而低于卵清蛋白模式，說明2種樣品均具有很好的營養價值，其中，FCHJ的必需氨基酸占總氨基酸的含量百分比低于CHJ。從單個必需氨基酸分析，除Met+Cys外，其他氨基酸占總氨基酸的含量百分比均高于WHO/FAO提出的理想蛋白模式。與FCHJ相比，CHJ中Val、Ile、Leu和Met+Cys的必需氨基酸占總氨基酸的含量百分比較高。綜上，2種樣品均有較好的營養價值。

由表3可知，2種樣品的第一限制性氨基酸均為Met+Cys，除Met+Cys外，在CHJ中，限制性氨基酸為Val，在FCHJ中Val、Ile、Leu均為其限制性氨基酸。綜上，CHJ的氨基酸的營養價值略優于FCHJ。

由表4可知，除了Met+Cys外，其他氨基酸的RCAA值均接近于1，說明FCHJ中蛋白質與模式蛋白中EAA推薦之接近為人體吸收的概率較大，其中Thr、Lys以及Phe+Tyr的RCAA＞1，說明這幾種氨基酸超過標準模式，相對過?！，F代營養學認為，食品中氨基酸含量過高會降低蛋白質的營養價值，SRCAA值越小，蛋白質的營養價值越低，當評價蛋白質與模式值接近一致時，SRCAA值越接近于100。由表4可知，CHJ的SRCAA最大，達到73.09，FCHJ的SRCAA為70.34，與CHJ無明顯差異（P＞0.05）。說明發酵黨參黃酒及黨參黃酒的氨基酸組成比例合理，營養均衡，其蛋白質的利用率較高。

2.1.2 氨基酸的呈味分析

以黨參黃酒（CHJ）為對照，對發酵黨參黃酒（FCHJ）進行呈味分析，結果見表5。

表5 發酵黨參黃酒氨基酸的呈味分析結果Table 5 Taste analysis results of amino acids in fermented Codonopsis pilosula Huangjiu

將氨基酸分為鮮味、甜味、苦味、鹽味氨基酸，將鮮味及甜味氨基酸劃為優味氨基酸，將苦味及鹽味氨基酸劃分為劣味氨基酸[22-23]。由表4可知，黨參發酵后，Glu和Asp的含量會成倍增加，這也解釋了黨參加入后其優味氨基酸的增加。劑量比域因子（DOT）為各呈味物質的含量與其閾值的比值，當DOT＞1時，認為該物質對呈味有貢獻，由此可以確定主要呈味的氨基酸。在FCHJ中呈味氨基酸主要是組氨酸，組氨酸是苦味氨基酸，組氨酸的引入使黃酒的口感更豐富，而CHJ中呈味氨基酸主要是脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，是鮮味以及甜味氨基酸。味道指數（TI）是優味氨基酸的味道強度之和與劣味氨基酸的味道強度之和，是一個總的風味的評價指標，如果味道指數＞1，說明口感和風味良好。結果表明，2種樣品的TI值均＞1，說明兩種樣品的口味均較好且各具特色。

2.2 發酵黨參黃酒中人體必需礦物元素含量分析

以黨參黃酒（CHJ）為對照，對發酵黨參黃酒的礦物元素進行含量測定，結果見表6。

表6 發酵黨參黃酒礦物元素含量測定結果Table 6 Determination results of mineral elements contents in fermented Codonopsis pilosula Huangjiu μg/L

由表6可知，FCHJ與CHJ樣品均富含K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn等人體必需礦物元素，兩種黃酒各礦物元素含量并未有明顯的差異。

2.3 發酵黨參黃酒抗氧化活性分析

以黨參黃酒（CHJ）為對照，對發酵黨參黃酒的抗氧化活性進行測定，結果見圖1。由圖1A可知，發酵黨參黃酒DPPH自由基清除率隨其添加量增加而增大，最大DPPH自由基清除率為97%，與黨參黃酒最大清除率接近。由圖1B可知，發酵黨參黃酒超氧陰離子自由基清除率隨其添加量增加而增大，最大超氧陰離子自由基清除率為98%，遠高于黨參黃酒最大清除率。由圖1C可知，發酵黨參黃酒羥基自由基清除率隨其添加量增加而增大，最大羥基自由基清除率為100%，與黨參黃酒最大清除率接近。

圖1 發酵黨參黃酒抗氧化活性測定結果Fig.1 Determination results of antioxidant activities of fermented Codonopsis pilosula Huangjiu

經檢測，發酵黨參黃酒的總多酚含量（599.17±2.74）mg/L，顯著高于黨參黃酒[（452.09±3.24）mg/L]（P＜0.05），增加了32.53%。發酵黨參黃酒總黃酮含量為（65.24±3.92）mg/L，較黨參黃酒增加了60.79%。發酵黨參黃酒中總多酚、總黃酮含量增加是其抗氧化活性提高的主要原因[24-25]。

2.4 發酵黨參黃酒多糖對小鼠脾淋巴細胞的免疫調節作用

淋巴細胞是機體主要的免疫細胞，包含T細胞和B細胞。LPS是多糖復合物，可以激活免疫細胞的增殖能力，從而提高免疫作用，ConA可促進有絲分裂，增加免疫細胞的增殖。發酵黨參黃酒多糖對小鼠脾淋巴細胞的免疫調節作用結果見圖2。

圖2 發酵黨參黃酒多糖對脂多糖誘導（A）及刀豆蛋白A誘導（B）的小鼠脾淋巴細胞的免疫調節作用Fig.2 Immunomodulatory effect of polysaccharides from fermented Codonopsis pilosula Huangjiu on mouse splenic lymphocytes induced by LPS (A) and ConA (B)

由圖2A可知，不同質量濃度的FCHJ-CP對LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞均有增殖作用且呈現劑量依賴性，當多糖質量濃度為100 μg/mL時，其增殖效果最明顯（P＜0.05），且當FCHJ-CP質量濃度為25～200 μg/mL時，其增殖效果與陰性對照組相比，有顯著性差異（P＜0.05）；由圖2B可知，不同濃度FCHJ-CP對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞也具有增殖作用，除50 μg/mL外，FCHJ-CP質量濃度為25～800 μg/mL時，其增殖效果有顯著性差異（P＜0.05），且當FCHJ-CP質量濃度為100 μg/mL時，其增殖效果最顯著（P＜0.05）。結果表明，FCHJ-CP可使LPS或ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞的增殖，且當FCHJ-CP質量濃度為100 μgmL時，其增值效果最顯著（P＜0.05）。

2.5 發酵黨參黃酒多糖對RAW264.7細胞的增殖、吞噬及NO生成量的作用

巨噬細胞是評價免疫調節能力的重要載體，是多糖的關鍵靶標，負責呈遞抗原[26-27]。不同質量濃度的FCHJ-CP對巨噬細胞RAW264.7細胞增殖、吞噬及NO生成量的作用見圖3。

圖3 發酵黨參黃酒多糖對RAW264.7細胞的增殖（a）、吞噬（b）及NO生成量（c）作用Fig.3 Effect of polysaccharides from fermented Codonopsis pilosula Huangjiu on proliferation (a), phagocytosis (b) and NO production (c) of RAW264.7 cells

由圖3a可知，實驗組的細胞增殖率均高于陰性對照組，且FCHJ-CP對巨噬細胞RAW264.7的增殖效果更明顯，且當其質量濃度為200～400 μg/mL時，與陰性對照組比較，其增殖效果極顯著（P＜0.01）。

吞噬能力是巨噬細胞的基本防御能力，對保護人體免受病菌損害有重要作用[28]。由圖3b可知，FCHJ-CP與陰性對照組比較，質量濃度為100～800 μg/mL時，其吞噬效果極顯著（P＜0.01），說明發酵黨參黃酒多糖在一定的濃度范圍內對RAW264.7細胞的吞噬能力有上調作用，能夠提高巨噬細胞的非特異性免疫功能。

NO是一種具有氧化特性的自由基[29]，是活化巨噬細胞，殺滅病原微生物的主要效應分子，誘導型NO的合成在維持心血管系統平衡、防止動脈粥樣硬化的方面起重要的作用，同時也是免疫細胞被激活的重要指標之一。由圖3c可知，實驗組細胞的NO生成量均極顯著高于陰性對照組（P＜0.01），發酵黨參組黃酒多糖可以促進NO的分泌。

3 結論

本研究以發酵黨參為原料制備發酵黨參黃酒（FCHJ），測定FCHJ中的總酚、總黃酮及氨基酸含量、礦物元素及體外抗氧化活性，并對發酵黨參黃酒多糖（FCHJ-CP）體外免疫調節活性進行評價。結果表明，FCHJ共檢出17種氨基酸，其中必需氨基酸8種，必需氨基酸占總氨基酸含量35.53%；兩種黃酒營養豐富、呈味良好，均富含K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn等人體必需礦物元素。FCHJ對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、超氧陰離子、羥基自由基最大清除率分別為97%、98%、100%。FCHJ-CP質量濃度為200 μg/mL時，可顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖（P＜0.05）、極顯著促進RAW264.7細胞增殖和吞噬以及促進NO的釋放（P＜0.01）。發酵黨參黃酒不僅營養豐富、口味良好，具有良好的抗氧化及免疫調節活性，具有較好的開發應用前景。