燕麥米酒發酵工藝優化及其抗氧化活性研究

楊 州，曹露露，劉邱陽，張增明，董良君，鎮 達*

（1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室 工業發酵省部共建協同創新中心工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.孝感親親生物科技有限公司，湖北 孝感 432100）

燕麥作為一種全價營養谷物，不僅富含蛋白質、膳食纖維、多種氨基酸及硒、鉬、錳等微量元素，而且含有多種生物活性成分，如β-葡聚糖、黃酮和皂苷等[1]，同時其含有豐富的多酚化合物，主要有阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、香草酸等[2]。常年食用燕麥具有降血脂、增強免疫力、美容、減肥等保健作用[3-6]，符合現代我國居民對膳食的更高追求。

米酒作為我國傳統發酵型食品，以糯米為主要原材料，經過蒸煮糊化后接種酒曲發酵等工藝制得，其富含多種氨基酸、維生素、生物活性肽，成為消費者青睞的功能性飲品[7-9]。目前，復合型米酒的研究是新型米酒發展趨勢之一。杜亞飛等[10]將黑青稞與糯米按質量比2∶1混合發酵，釀造出具有黑青稞獨特香味的米酒。賀祺涵等[11]將黑米、蕎麥、糯米混合發酵，釀造出口感醇厚，風味成分豐富，具有抗氧化能力的米酒。燕麥用于米酒的開發研究較少，傳統工藝為將燕麥和糯米按一定比例混合，經過浸泡、蒸煮發酵后制成醪糟[12]。部分地區直接采用燕麥仁浸泡蒸煮，接種甜酒曲發酵為“甜醅”。而燕麥仁種皮較厚，發酵過程中微生物較難利用，影響其原料利用率[13]，此外，燕麥的粒度不同使得發酵時蛋白質、脂肪、碳水化合物和灰分等營養成分的轉化率有所差別，進而影響醪糟的口感和香味[14]。

本研究以糯米和燕麥為原料制備燕麥米酒，為了充分利用燕麥原料營養價值和功能特性，通過改變燕麥原料使用方法，將燕麥粉液化后添加到米酒的發酵過程，同時以酒精度及感官評分為評價指標，通過單因素試驗及響應面試驗優化燕麥米酒發酵工藝，并對其品質指標及抗氧化活性進行分析，旨在解決其傳統工藝中出酒率低和風味不佳的問題。燕麥米酒的研發不僅增加復合型米酒的種類和保健功效，同時可使燕麥的深加工得到進一步應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥：張家口建軍燕麥食品有限公司；糯米：孝感市售；甜酒曲、黃酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、葡萄糖、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；中溫淀粉酶（4 000 U/g）：天津市大茂化學試劑廠；沒食子酸、福林酚試劑（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）（均為分析純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PAL-102/104手持酒度計：杭州齊威儀器有限公司；DK-8D恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；ZWY-2102C恒溫培養器：上海智城分析儀器制造有限公司；TGL-16M立式冷凍離心機：常州市金壇高科儀器廠；VWRUV-1600PC紫外可見分光光度計：美國VWR公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥米酒的發酵工藝流程及操作要點

（1）燕麥米酒液化發酵工藝流程及操作要點[15]

操作要點：

燕麥汁的制備：挑選無霉變燕麥，利用粉碎機將燕麥粉碎后，過40目篩備用。將粉碎得到燕麥粉與純水按1∶8（g∶mL）的比例混合，于90 ℃水浴加熱30 min糊化。取出，待燕麥粉漿冷卻至65 ℃時，以15 U/g加酶量加入中溫淀粉酶（4 000 U/g），液化15 min，得到燕麥汁，冷卻至30 ℃備用。

糯米清洗浸泡：選取優質糯米，清洗3次后，于室溫下浸泡12 h，待手可捻碾碎籽粒停止浸泡。

蒸飯：將浸泡好的糯米使用蒸鍋常壓蒸汽20 min，使米中淀粉充分糊化，至米粒通透不軟爛且無白心的程度。

攤涼：將蒸煮好的糯米放置通風處，攤涼使米飯溫度降至30 ℃左右。

接種甜酒曲：向攤涼后的米飯中接種7‰甜酒曲（以干糯米質量計），從邊緣向中心堆砌，當糯米剩余1/3時，只添加邊緣，讓中間低于外邊緣，即四周高，中心低，呈窩狀。

糖化：拌曲均勻后裝入燒杯中，于恒溫培養箱中30 ℃糖化2 d，得到糖化醪。

接種酵母：以糯米干質量計，稱取0.1%的活性干酵母溶于10倍質量體積的2%葡萄糖溶液中，于37 ℃水浴活化20 min，將活化后的活性干酵母按0.10%的接種量接種于糯米糖化醪。

添加燕麥汁：加入20%燕麥汁。

發酵：置于30 ℃恒溫培養箱中密封發酵4 d。

過濾、裝瓶滅菌：發酵完成后，醪液用雙層無菌尼龍布過濾，分裝至無菌玻璃瓶，巴氏滅菌（65 ℃、30 min），冷卻后即為燕麥米酒成品。

（2）燕麥米酒半固態發酵工藝流程及操作要點[16]

糯米和燕麥仁→清洗→浸泡→蒸飯→攤涼→接種甜酒曲→糖化→接種酵母→加水→發酵→過濾→裝瓶殺菌→燕麥米酒

操作要點：

清洗浸泡：挑選無霉變的糯米和燕麥仁，清洗干凈后，按質量比5∶1混合均勻后于室溫下浸泡12 h，待手可捻碾碎籽粒停止浸泡。

蒸飯：將上述充分浸泡的糯米和燕麥放入蒸鍋常壓蒸汽20 min，至米粒通透不軟爛且無白心，燕麥疏松而不糊的程度。

攤涼：將蒸煮好的糯米燕麥混合米飯放置通風處，攤涼使混合米飯溫度降至30 ℃左右。

接種甜酒曲：向攤涼后的混合米飯中接種7‰甜酒曲（以糯米和燕麥總干質量計），從邊緣向中心堆砌，當混合米飯剩余1/3時，只添加邊緣，讓中間低于外邊緣，即四周高，中心低，呈窩狀。

糖化：拌曲均勻后裝入燒杯中，于恒溫培養箱中30 ℃糖化2 d，得到糖化醪。

接種酵母：以糯米和燕麥仁干質量計，稱取0.1%的活性干酵母溶于10倍質量體積的2%葡萄糖溶液中，于37 ℃水浴活化20 min，將活化后的活性干酵母按0.10%的接種量接種于糯米和燕麥糖化醪。

加水：以糯米和燕麥仁干質量計，加入無菌水，料液比為1∶1（g∶mL）。

發酵：置于30 ℃恒溫培養箱中密封發酵4 d。

過濾、裝瓶滅菌：發酵完成后，醪液用雙層無菌尼龍布過濾，分裝至無菌玻璃瓶，巴氏滅菌（65 ℃、30 min），冷卻后即為燕麥米酒成品。

1.3.2 燕麥米酒發酵工藝優化單因素試驗

以感官評分及酒精度為評價指標，在酵母菌接種量0.10%，發酵溫度30 ℃，發酵時間4 d，燕麥汁添加量15%的基礎條件下，每次只改變4個因素中的一個因素，保持其他因素不變，分別考察酵母菌接種量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、發酵溫度（24 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、發酵時間（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）、燕麥汁添加量（10%、15%、20%、25%、30%）對燕麥米酒品質的影響。

1.3.3 燕麥米酒發酵工藝優化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以酵母接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）及燕麥汁添加量（D）為影響因素，燕麥米酒感官評分（Y）為響應值，利用響應面法優化燕麥米酒發酵工藝。響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 燕麥米酒發酵工藝優化響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of oat rice wine

1.3.4 檢測方法

出酒率的測定：參考張慧娟等[17]的方法。發酵原料的質量記為M原料，將發酵后的醪液過濾，用量筒測定其體積并記為V酒，計算出酒率，其計算公式如下：

酒精度的測定：參考GB/T 5009.225—2023《酒和食用酒精中乙醇濃度的測定》[18]；總酸含量的測定：參考GB/T 13662—2018《黃酒》[19]；還原糖含量的測定：參考劉浩[20]的方法；總多酚含量的測定：參考嚴莎莎等[21]的方法。

米酒稀釋操作：分別量取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL的兩種米酒樣品定容至20 mL，并對稀釋過的米酒樣品進行抗氧化能力測定。DPPH自由基的清除活性的測定：根據金海炎等[22]等的方法；ABTS自由基清除活性的測定：根據吳雙從等[23]的方法；鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing/antioxidant power，FRAP）測定：根據程宏楨等[24]的方法。

感官評分：由食品工程專業的師生共計10人組成的感官評價小組，根據NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》[25]要求，分別對燕麥米酒的色澤、香氣、口感和風格進行感官評分，具體評分標準見表2。

表2 燕麥米酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of oat rice wine

1.3.5 數據處理與分析

應用Origin2021軟件進行數據統計分析。采用Design-Expert 8.6.0.1進行響應面設計及試驗分析。使用SPSS26.0對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 兩種發酵工藝對出酒率的影響

兩種發酵工藝對出酒率的影響見圖1。

圖1 兩種發酵工藝對燕麥米酒出酒率的影響Fig.1 Effects of two kinds of fermentation process on the yield of oat rice wine

由圖1可知，燕麥粉液化后發酵的出酒率顯著高于燕麥仁半固態發酵的出酒率（P＜0.05），且在發酵4 d時的出酒率（187%）比燕麥仁半固態發酵提高了40.6%。分析其原因可能為：燕麥種皮較厚，發酵過程中微生物較難利用其中淀粉，醪液中的總糖含量相對較低，導致其酒精發酵過程變慢，出酒率較低；而將燕麥粉碎進行酶解后，解決了燕麥種皮影響其原料利用率的問題，同時酶解后加入，為醪液提供大量糖類，酒精發酵過程加快，出酒率提高。

2.2 燕麥米酒發酵工藝優化單因素試驗

2.2.1 燕麥汁添加量對燕麥米酒品質的影響

不同的燕麥汁添加量對燕麥米酒品質的影響見圖2。

圖2 燕麥汁添加量對燕麥米酒品質的影響Fig.2 Effect of oat juice addition on the quality of oat rice wine

由圖2可知，隨著燕麥汁添加量的增加，由于酒樣的稀釋導致燕麥米酒的酒精度逐漸下降。當燕麥汁添加量為10%～20%時，感官評分隨燕麥汁的添加而增加，燕麥米酒的香氣逐漸顯現以及風格逐漸突出；當燕麥汁添加量為20%時，燕麥米酒的感官評分達到最大值83分。隨著繼續添加燕麥汁，酒樣酸甜比失調，酒香不足，口感寡淡，米酒渾濁，色澤較差，燕麥米酒的感官評分有所下降。因此，確定燕麥汁添加量為15%、20%、25%，用于響應面試驗設計。

2.2.2 酵母菌接種量對燕麥米酒品質的影響

酵母接種量對酒精度和發酵產物影響很大，酵母接種量的多少決定著酵母菌生長速率、發酵速率[26]。因此，考察酵母菌接種量對燕麥米酒品質的影響，結果見圖3。

圖3 酵母菌接種量對燕麥米酒品質的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of oat rice wine

由圖3可知，酵母接種量的多少決定著酵母菌生長速率、發酵速率和呼吸產能等變量的大小[27]。隨著酵母菌接種量的增加，燕麥米酒的酒精度逐漸增加。當酵母菌接種量為0.05%時發酵力較低，燕麥米酒的甜味突出，酒味和香氣不足，感官評分較低；當酵母菌添加量達到0.15%時，燕麥米酒的感官評分達到最大值82分。而酵母接種量繼續增大，對酒的風味產生不良影響，米酒酒味過重并帶有苦澀味，氣味較刺鼻，導致燕麥米酒酒體不協調，感官評分下降。因此，確定酵母菌接種量為0.10%、0.15%、0.20%，用于響應面試驗設計。

2.2.3 發酵時間對燕麥米酒品質的影響

發酵時間的長短對酒精發酵和風味也可能產生影響。為此，考察發酵時間對燕麥米酒品質的影響，結果見圖4。

圖4 發酵時間對燕麥米酒品質的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of oat rice wine

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，酵母菌不斷將糖分轉化成酒精，酒精度不斷上升。并在發酵10 d后，酒精度達到最大值，為10.2%vol。然而感官評分呈現先上升后下降的趨勢，當發酵4 d時，酒味和香氣開始凸顯，燕麥米酒的酒體更加協調，感官評分達到最大值85分。分析原因可能是，發酵前期，由于還原糖含量偏高，導致甜味突出，酒味不足；發酵時間過長，米酒口感欠佳，出現酸味和苦澀味，感官評分下降。因此，確定發酵時間為2 d、4 d、6 d，用于響應面試驗設計。

2.2.4 發酵溫度對燕麥米酒品質的影響

發酵溫度對燕麥米酒品質的影響見圖5。

圖5 發酵溫度對燕麥米酒品質的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the quality of oat rice wine

由圖5可知，較低的溫度會影響發酵過程，同時不利于燕麥米酒感官品質，隨著發酵溫度升高，燕麥米酒的酒精度逐漸上升，感官評分逐漸增加。當發酵溫度達到30 ℃時，感官評分達到最大值82分。此時酒體柔和清爽，風味協調，醇香和麥香兼具。發酵溫度超過30 ℃時，感官評分下降，分析原因可能為發酵速度過快，發酵產物不利于米酒整體風味[28]，其酒體摻雜異味，苦澀味明顯，口味偏酸，酒體不協調。因此，確定發酵溫度為28 ℃、30 ℃、32 ℃，用于響應面試驗設計。

2.3 燕麥米酒發酵工藝優化響應面試驗結果與分析

在單因素試驗結果的基礎上，以酵母接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）及燕麥汁添加量（D）為影響因素，燕麥米酒感官評分（Y）為響應值，利用響應面法優化燕麥米酒發酵工藝，試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表3 燕麥米酒發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization of oat rice wine

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.6.0.1對表3結果進行多元回歸擬合分析，獲得響應值感官評分（Y）的回歸模型方程式：

由表4可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明試驗結果與回歸模型之間具有良好的擬合度。決定系數R2為0.950 7，校正決定系數R2adj為0.901 5，說明該模型擬合度較高。由F值可知，各因素對燕麥米酒感官評分的影響程度由大到小依次為C（發酵時間）＞B（發酵溫度）＞A（酵母菌接種量）＞D（燕麥汁添加量），由P值可知，一次項A、B、C，交互項BC，二次項B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＜0.05）。

響應面圖可以比較直觀地表現出兩變量對因變量的影響關系，進一步分析發酵時間及發酵溫度間交互作用對燕麥米酒感官評分的影響，繪制響應面及等高線，結果見圖6。

圖6 發酵溫度及發酵時間交互作用對燕麥米酒感官評分影響的響應曲面與等高線Fig.6 Response surface plot and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature and time on sensory score of oat rice wine

響應面坡度越陡，等高線越接近橢圓，表明二者相互作用越顯著[29]。由圖6可知，交互項BC響應面坡度較陡，等高線密集且呈橢圓，說明發酵時間和發酵溫度之間的交互作用對感官評分有極顯著影響，與表4方差分析結果一致。

采用Design-Expert8.6.0.1軟件對二次多元回歸模型進行分析并求解，得到燕麥米酒的最佳發酵工藝條件為：酵母菌接種量0.14%，發酵溫度30.7 ℃，發酵時間4.6 d，燕麥汁添加量21.02%。在此條件下，感官評分預測值為88.17分。為便于實際操作，將最優發酵工藝條件修正為酵母菌接種量0.15%，發酵溫度31 ℃，發酵時間4.5 d，燕麥汁添加量21%，在此優化條件下進行3次平行驗證試驗，得到燕麥米酒的感官評分實際值為（89±1）分，與模型預測基本吻合。

2.4 燕麥米酒抗氧化活性研究

多酚作為米酒中較為常見的抗氧化活性物質，可清除自由基，具有抗炎、抗糖尿病等多種健康功效[30]。以純糯米米酒為對照，測定燕麥米酒DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率以及鐵原子還原能力，結果見圖7。

圖7 燕麥米酒的DPPH（a）、ABTS（b）自由基清除率及鐵原子還原/抗氧化能力（c）Fig.7 DPPH (a), ABTS (b) radicals scavenging rate and ferric ion reducing/antioxidant power (c) of oat rice wine

由圖7a和圖7b可知，當米酒添加量為1.2 mL時，燕麥米酒和純糯米酒的DPPH自由基清除率分別為55.20%和51.02%，ABTS自由基清除率分別為85.29%和65.21%，即燕麥米酒的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力分別是純糯米酒的1.08倍、1.31倍。由圖7c可知，燕麥米酒鐵離子還原能力顯著高于純糯米酒（P＜0.05），當米酒添加量為1.8 mL時，燕麥米酒的FRAP值為0.61 mmol/L，是純糯米酒FRAP值（0.36 mmol/L）的1.69倍。結果表明，燕麥米酒的抗氧化能力優于純糯米米酒。

2.5 燕麥米酒的理化指標

通過理化指標的測定發現，燕麥米酒的酒精度為8.00%vol，還原糖含量為37.40 g/L，總酸含量為5.92 g/L，非糖固形物含量為13.70 g/L，同時總多酚含量達到0.69 g/L，其各項理化指標均符合NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》的要求。

3 結論

本研究通過改變燕麥原料使用方法，將燕麥進行酶解處理后加入甜酒糟參與酒精發酵，比燕麥仁半固態發酵出酒率提高40.6%。在此基礎上，通過單因素及響應面試驗確定了燕麥米酒最佳發酵條件為發酵時間4.5 d、燕麥汁添加量21%、酵母菌接種量0.15%，發酵溫度31 ℃。在此條件下所得的燕麥米酒質地均一，口感醇和，風味俱佳，具有獨特的燕麥香，感官評分為89分，酒精度為8.00%vol，還原糖含量為37.40 g/L，總酸含量為5.92 g/L，非糖固形物含量為13.70 g/L，總多酚含量為0.69 g/L，其各項理化指標均符合NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》的要求?？寡趸芯拷Y果表明，燕麥米酒1,1二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除率，鐵離子還原能力（FRAP）分別為純糯米酒的1.08倍、1.31倍、1.69倍，其抗氧化能力優于純糯米酒。