捻轉血矛線蟲LAMP-LFD檢測方法的建立

段 鈺,湯洪寧,項繼忠,吳 飛,馬光旭,杜愛芳,楊 怡*

(1.浙江大學動物科學學院,浙江省動物預防醫學重點實驗室,浙江杭州 310058;2.湖州咩咩羊牧業有限公司,浙江湖州 313023)

捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)寄生于反芻動物皺胃,靠吸食血液為生,可引起宿主貧血、發育不良,感染嚴重時死亡,給畜牧業帶來嚴重影響。捻轉血矛線蟲繁殖能力強,感染宿主體內可攜帶上萬條蟲,一條雌性成蟲每天可產卵5 000～15 000個[1]。捻轉血矛線蟲在自由生活階段和具有感染性的L3期生存能力強,在適宜環境中能迅速增多,增加了感染率[2]。為了解捻轉血矛線蟲感染分布情況,國內外進行了大量流行病學調查。如英國的感染率高達66%[3],澳大利亞為37.18%[4],瑞典為25%[5],西非部分地區達到85%[6],中非盧旺達地區為75.7%[7],非洲東北部埃塞俄比亞部分地區達到68.75%[8]。我國捻轉血矛線蟲病在東北、西北、內蒙古等地多發。吉林省西北地區的感染率為34.99%[9],內蒙古烏審旗地區為44.5%[10],赤峰市為82.5%[11],通遼市為80.4%[12],甘肅南部地區的平均感染率為14.30%[13],其他地區如福建總體感染率為67.9%[14],湖南岳陽為63.33%[15],貴州雷山為18.18%[16]。

羊感染捻轉血矛線蟲后可能導致死亡,因此快速、準確診斷捻轉血矛線蟲病對實際生產意義重大。近年來該病的臨床診斷主要依靠糞便蟲卵檢測和死尸臨床剖檢。糞便蟲卵檢測法操作簡單,但蟲卵數量較少時易造成漏檢;線蟲混合感染時,因蟲卵形態較相似,不能確診。臨床剖檢則只能針對死尸,通過挑取皺胃內的成蟲進行確診。分子診斷技術檢測速度相對較快、靈敏性高,聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等技術已廣泛應用于寄生蟲檢測中。LAMP相對于其他核酸分子檢測技術,具有試驗裝置簡單、耗時短、結果判定簡單、特異性強、靈敏度高的特點。LAMP利用Bst(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的鏈置換活性在等溫條件下擴增DNA,與PCR中使用的聚合酶相比,BstDNA聚合酶對糞便樣品中常見的抑制因子具有更好的耐受性,可以從粗獷樣品中成功擴增DNA,最大限度減少DNA的提取步驟[17]。而橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)可以通過對LAMP產物進行生物素和熒光素標記,與試紙條上包被生物素抗體的檢測線結合,使結果可視化,判讀更為方便,更具有特異性。

本研究針對捻轉血矛線蟲線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(mitochondrial cytochrome oxidase subunit Ⅰ,mt-COⅠ)基因的保守區段設計1組引物和1條探針,將LAMP技術與LFD技術有機結合并優化,建立了捻轉血矛線蟲的 LAMP-LFD檢測方法,旨在為捻轉血矛線蟲病的快速鑒別診斷提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株及樣品 捻轉血矛線蟲蟲卵及成蟲由浙江大學動物科學學院寄生蟲研究室保存;夏伯特線蟲成蟲、奧斯特線蟲成蟲、毛首線蟲成蟲由四川省畜牧科學研究院惠贈。50份湖羊糞便樣品采自湖州咩咩羊牧業有限公司。

1.1.2 主要試劑 血液/細胞/組織DNA基因組提取試劑盒(DP304),天根生物技術(北京)有限公司產品;Fluorescent Dye(FD)、10×LAMP buffer、BstⅡ DNA聚合酶、100 mmol/L MgSO4,NEB(北京)生物技術有限公司產品;甜菜堿,Sigma(美國)公司產品;10 mmol/L dNTP Mix,生工生物工程(上海)股份有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 水浴鍋,上海精宏實驗設備有限公司產品;NanoDrop超微量分光光度計,賽默飛世爾(美國)公司產品;恒溫金屬浴干式恒溫器,大龍興創實驗儀器(北京)股份公司產品;核酸電泳儀,北京六一科技有限公司產品;凝膠成像儀,杭州亞旭科技有限公司產品;T100TMThermalCycler、CFX96TMReal-Time System,Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 用北京天根公司生產的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取捻轉血矛線蟲、夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、毛首線蟲基因組DNA,按說明書操作。提取完成測定DNA濃度,保存于-80℃備用。

1.2.2 引物的設計與篩選 從GenBank中獲得捻轉血矛線蟲mt-COⅠ基因序列(登錄號:LS997568),針對其保守片段,根據LAMP引物的設計原則,用Primer ExplorerV5設計1組引物,每組包括2條外引物F3和B3,2條內引物FIP和BIP。其中,BIP的5′端用生物素標記。同時設計合成一條5′端標記6-FAM的特異性探針。引物和探針均由上海生工股份有限公司合成(表1)。

表1 mt-COⅠ引物和探針

1.2.3 實時熒光LAMP反應體系的優化

1.2.3.1 最佳反應溫度的確定 按下列體系加樣:2.5 μL 10×LAMP buffer,2.5 μL dNTP Mix(10 mmol/L),1.0 μLBstⅡ DNA聚合酶(8 U),0.75 μL MgSO4(100 mmol/L),2.0 μL 甜菜堿(5 mol/L),FIP/BIP(10 μmol/L)各4.0 μL,F3/B3(10 μmol/L)各0.5 μL,1.0 μL DNA模板,0.5 μL FD,ddH2O補至25 μL。將以上混合物分別于61、62、63、64、65、66℃反應1 h,通過CFX96TMreal-time system實時熒光曲線出峰時間和峰值高度判定結果。

1.2.3.2 最佳反應時間的確定 保持體系中其他成分不變,設置多組陰性對照,判斷陰性組中非特異性擴增的出峰時間點,以此確定最佳反應時間。

1.2.3.3 Mg2+最佳反應濃度的確定 保持體系中其他成分不變,分別加入MgSO4使其終濃度為2、4、6、8、10 mmol/L,同時設置陰性對照。最佳溫度下反應1 h,通過CFX96TMreal-time system判定結果。

1.2.3.4 dNTP最佳反應濃度的確定 保持體系中其他成分不變,分別加入dNTP使其終濃度為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L。通過CFX96TMReal-Time System判定結果。

1.2.4 LAMP-LFD檢測方法的建立 基于優化后的LAMP體系,將LAMP產物與20 pmoL帶有FAM標簽的探針于原條件下雜交5 min,取10 μL反應產物加入190 μL PBS溶液進行LFD檢測。同時設置實時熒光LAMP反應,反應產物分別通過CFX96TMreal-time system和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 LAMP、LAMP-LFD方法的特異性試驗 分別以夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、毛首線蟲、捻轉血矛線蟲DNA為模板,進行LAMP-LFD檢測,同時設置實時熒光LAMP反應,反應產物分別通過CFX96TMreal-time system和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 LAMP、LAMP-LFD靈敏度試驗 將捻轉血矛線蟲基因組DNA分別稀釋成10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL,進行LAMP-LFD檢測,同時設置實時熒光LAMP反應,反應產物分別通過CFX96TMReal-Time System和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 臨床樣品的檢測 將采集的50份臨床樣品提取DNA,分別進行LAMP-LFD試紙條檢測和糞便蟲卵鏡檢,使用SPSS Statistics v.23.0分析比對兩種方法的檢測結果。

2 結果

2.1 LAMP體系的優化

當反應溫度為63℃時擴增曲線出峰較早,且峰值最高(圖1A),因此本LAMP反應體系的最佳反應溫度為63℃。設置多組陰性對照,經過多次重復LAMP擴增,發現陰性組中非特異性擴增的出峰時間點為110 cycles即55 min(圖1B),因此本LAMP反應體系的陽性判斷時間點為55 min內。對Mg2+、dNTP的反應濃度進行優化(圖1C和圖1D),Mg2+最佳反應濃度為4 mmol/L,dNTP最佳反應濃度為1.0 mmol/L。

A.最佳反應溫度,1～6.63℃、61℃、62℃、64℃、65℃、66℃;7～12.陰性對照;B.最佳反應時間,1.捻轉血矛線蟲;2～5.陰性對照;C.Mg2+最佳反應濃度,1～5.4、6、8、10、2 mmol/L;6.陰性對照;D.dNTP最佳反應濃度,1～5.1.0、1.2、0.8、0.6、0.4 mmol/L;6.陰性對照

優化后的LAMP反應體系為:2.5 μL 10×LAMP buffer,2.5 μL dNTP Mix(10 mmol/L),1.0 μLBstⅡ DNA聚合酶(8 U),0.5 μL MgSO4(100 mmol/L),2.0 μL甜菜堿(5 mol/L),FIP/BIP(10 μmol/L)各4.0 μL,F3/B3(10 μmol/L)各0.5 μL,1.0 μL DNA模板,ddH2O補至25 μL。LAMP反應的最佳溫度為63℃,最佳反應時間為55 min。

2.2 LAMP-LFD方法的建立

陽性模板的LAMP-LFD檢測結果為質控線和檢測線均顯色,陰性對照僅出現一條藍色質控線(圖2C),與實時熒光LAMP檢測結果(圖2A)以及瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖2B)相符合,表明LAMP-LFD檢測方法可行。

A.LAMP擴增曲線;B.LAMP產物電泳圖;C.LAMP-LFD檢測結果;M.DNA標準DL 100;1.捻轉血矛線蟲;2.陰性對照

A.LAMP擴增曲線;B.LAMP產物電泳圖;C.LAMP-LFD檢測結果;M.DNA 標準DL 100;1.捻轉血矛線蟲;2.綿羊夏伯特線蟲;3.環紋奧斯特線蟲;4.毛首線蟲;5.陰性對照

A.LAMP擴增曲線;B.LAMP產物電泳圖;C.LAMP-LFD檢測結果;M.DNA 標準DL 100;1～7.10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg;8.陰性對照

2.3 LAMP、LAMP-LFD方法的特異性試驗

在同一條件下,分別以夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、毛首線蟲、捻轉血矛線蟲DNA為模板,進行LAMP以及LAMP-LFD檢測(圖3),除捻轉血矛線蟲的DNA為模板檢出陽性外,其他均為陰性。

2.4 LAMP、LAMP-LFD靈敏度試驗

結果顯示,建立的LAMP方法,實時熒光擴增曲線最低可以檢測到100 fg(圖4A),2%瓊脂糖凝膠電泳最低檢測量為1 pg(圖4B),LAMP-LFD能檢到捻轉血矛線蟲DNA的最低量為100 fg(圖4C)。

2.5 臨床樣本的檢測

對50份糞便樣品進行顯微鏡檢測陽性率為24%(12/50),LAMP-LFD檢測陽性率為20%(10/50),與糞便蟲卵檢測法的符合率為96%(48/50),Kappa值為0.884(P=0.001),說明兩種方法檢測結果一致性較高。

3 討論

捻轉血矛線蟲的檢測方法有病原學檢測、免疫學及分子生物學方法等。病原學檢測方法如常見的糞便蟲卵鏡檢及凝集素熒光標記技術[18],既耗時又不準確,不適合臨床檢測大量糞便樣本。捻轉血矛線蟲的免疫學診斷方法以抗體檢測為主。通過研究捻轉血矛線蟲的排泄分泌蛋白ES24,建立了血清IgG ELISA檢測方法[19];用捻轉血矛線蟲復合診斷抗原制備的膠體金試紙條使用較方便[20]。這些方法無法區分既往感染和現癥感染。分子學診斷技術近年來得到廣泛的應用,如 PCR 技術可有效解決相似寄生蟲蟲卵的鑒別問題[21],RT-qPCR推動了寄生線蟲發育各個階段診斷方法的發展且能對蟲卵進行定量[22],但這兩種方法需要昂貴的設備,常用于實驗室檢驗。

相比于PCR和qPCR技術,LAMP技術所需試驗裝置簡單、操作更為便捷,已被廣泛用于檢測病毒、細菌和寄生蟲[23]。犬貓剛地弓形蟲的LAMP-LFD檢測方法,靈敏度達到1 fg[24]。針對捻轉血矛線蟲核糖體DNA的ITS-2序列建立了LAMP方法,產物分別用凝膠電泳法和SYBR Green Ⅰ染料目測法檢測,靈敏度為1 pg[25]。ITS-2因其在種間高度特異,常被用作診斷靶標來檢測目標物種,其他基因如28S rRNA、COⅠ和COⅡ等也常用于鑒別反芻動物胃腸道內線蟲[26-28]。有研究基于捻轉血矛線蟲mt-COⅠ 基因建立了一種 SYBR Green qPCR 方法,用于檢測和定量捻轉血矛線蟲,具有高度的特異性和敏感性[29],能夠區分出捻轉血矛線蟲和柏氏血矛線蟲。本研究基于mt-COⅠ基因的保守序列設計特異性引物,建立捻轉血矛線蟲的LAMP-LFD檢測,靈敏度達到100 fg,相較于傳統PCR法高出103倍[30],相較于楊新等建立的LAMP法高出10倍[25]。

LAMP反應產物檢測方法有多種,包括熒光曲線法、瓊脂糖電泳法、染料顯色法、LFD法等。本研究同時用幾種方法對LAMP產物進行檢測,瓊脂糖電泳法需要用到電泳儀、凝膠成像儀,耗費時間長,在臨床應用中推廣意義不大;染料法如SYBR Green Ⅰ染料、羥基萘酚藍(HNB)染料、鈣黃綠素染料,在微量擴增時肉眼難以辨別輕微的顏色變化。本研究將LAMP與LFD試紙條相結合,結果判讀更方便、準確。相比前兩種檢測方法,LFD特異性更高,靈敏度也更高。

本研究以mt-COⅠ基因保守區段為靶標設計引物及探針,建立了一種捻轉血矛線蟲的LAMP-LFD檢測方法。經檢驗,本研究建立的LAMP-LFD方法對捻轉血矛線蟲基因組DNA的最低檢測限為100 fg,與奧斯特線蟲、夏伯特線蟲、毛首線蟲基因組DNA不發生交叉反應。LAMP-LFD方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、結果可視化的優點,有望為捻轉血矛線蟲病的臨床防控提供新的技術支撐。