基于PINK1-Parkin線粒體自噬通路探討海昆腎喜含藥血清對N2a/APP695細胞的神經保護作用

孫妍華,季 敬, 彭 嬌, 何 珊,, 付先軍

(1.山東中醫藥大學藥學院,2.海洋中藥研究中心,山東省高等學校海洋中藥重點實驗室,山東中醫藥組學工程技術研究中心,山東中醫藥大學,山東 濟南 250355)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種起病隱匿、進行性發展,伴隨著學習、記憶和認知能力嚴重下降的慢性中樞神經系統退行性疾病。AD的發病機制尚不完全清楚,目前主要的病理特征是腦內聚集的淀粉樣蛋白-β(amyloid β-protein,Aβ)多肽組成的淀粉樣斑塊,以及過度磷酸化的Tau蛋白組成的神經原纖維纏結,另一個早期和突出特征是線粒體的結構和功能受損[1]。線粒體自噬作為清除受損線粒體的主要途徑,與AD的發病進程存在著密切聯系。增強線粒體自噬可以保持線粒體的質量和功能,抑制Aβ和Tau蛋白的聚集,并逆轉認知缺陷,提示靶向線粒體自噬可能是AD治療的重要途徑[2]。特別是,PINK1-Parkin信號通路是介導線粒體自噬的重要途徑,在調節線粒體功能完整性中發揮重要作用[3]。

相關研究表明,一些具有化濁/祛瘀作用的中藥可以增強線粒體自噬,促進Aβ的清除,抑制Tau蛋白的過度磷酸化,從而達到治療AD的效果,如中藥提取物三七皂苷[4]、復方當歸芍藥散[5]等。海昆腎喜(haikun shenxi,HKSX)的有效成分為昆布中提取的褐藻多糖硫酸酯(fucoidan,FPS),是主要由α-L-巖藻糖-4-硫酸酯形成的水溶性雜多糖,具有化濁排毒之效。從中醫藥角度分析,HKSX善利水化痰,適用于癥瘕痰瘀膠結之證,推測其可以調節線粒體自噬干預AD。

課題組前期動物實驗表明,HKSX能夠調節自噬,改善SAMP8小鼠學習和認知障礙[6],但是否與線粒體自噬相關尚不明確。轉染人APP695Swedish突變基因的N2a/App695細胞,可以自身產生淀粉樣蛋白Aβ沉積,為國際認可的AD細胞模型,為了進一步探討HKSX干預AD的作用機制,我們以N2a/APP695細胞為模型,探索HKSX含藥血清在細胞水平的神經保護功能及線粒體自噬相關的作用機制,并通過抑制劑Mdivi-1抑制線粒體自噬,進一步驗證PINK1-Parkin介導的線粒體自噬通路是否在HKSX干預AD中發揮關鍵性作用。

1 材料與儀器

1.1 細胞株與動物小鼠神經母細胞瘤Neuro-2a(N2a)細胞、轉染人APP695Swedish突變基因的N2a/App695細胞,均由廈門大學孟健老師贈予。

24只SPF級雄性SD大鼠,體質量220±20 g,購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證編號：SCXK(京)2021-0006,動物實驗設施許可證編號：SYXK(魯)20220009。本研究中涉及動物的實驗均經山東中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(倫理號SDUTCM20230331001)。

1.2 藥物與主要實驗試劑HKSX膠囊購自于長龍生化藥業股份有限公司(貨號015221007);高效薄層色譜(high performance thin layer chromatography,HPTLC)硅膠板購自Millipore Sigma(貨號105554);Aβ1-42ELISA試劑盒購自上海酶聯生物(貨號m1002201);β-actin(貨號4967)、PINK1(貨號6946)、Parkin(貨號2132)、LC3(貨號2775)、p62(貨號5114)購自CST公司;Tau[EPR2731](phospho S396)(貨號ab109390)購自于Abcam;辣根酶標記山羊抗兔IgG(貨號ZB-2301)購自中杉金橋;ATP檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒購自碧云天生物(貨號S0026、C2006);活性氧(ROS)測定試劑盒購自南京建成(貨號E004-1-1);線粒體自噬抑制劑Mdivi-1購自Millipore Sigma(貨號M0199-5MG)。

1.3 主要實驗儀器酶標儀(Bio Tek,Epoch2)、全自動化學發光/熒光圖像分析系統(上海天能,Tanon 4800Multi)、高級正置熒光顯微鏡(蔡司,Axio Examiner.A1)、微孔板恒溫振蕩器(杭州佑寧儀器有限公司,WZ80-2)。

2 方法

2.1 HKSX含藥血清制備24只SD大鼠適應性喂養一周后,按隨機數字法分為4組：空白血清組、HKSX低劑量組(L)、HKSX中劑量組(M)、HKSX高劑量組(H)。HKSX灌胃劑量按照成人(60 kg)與大鼠體表面積折算的等效劑量比值為6.2進行換算,計算出低、中、高劑量大鼠的灌胃劑量分別為0.15、0.3、0.6 g·kg-1,空白血清組大鼠給予相同體積的蒸餾水,灌胃持續7 d,每天2次。末次給藥1 h后,經10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主動脈取血。取血后,血液常溫靜置0.5 h,3 000 r·min-1離心15 min,取上層血清,56 ℃水浴滅活30 min,經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,將同組大鼠的血清合并后分裝于2 mL的凍存管,于-80 ℃保存備用。

2.2 HKSX含藥血清中糖類成分的HPTLC分析HKSX中FPS的多糖重均分子量為96.9 ku,這一分子量的多糖類成分以原型入血的可能性極小,因此通過HPTLC對HKSX含藥血清的糖類成分進行分析。將HKSX、空白血清、含藥血清樣品點樣于HPTLC硅膠板[7],用正丙醇 ∶水 ∶氨水(50 ∶25 ∶2.4)展開2次,苯胺-二苯胺顯色。

2.3 細胞培養與給藥將N2a細胞復蘇后培養于含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中,N2a/App695細胞復蘇后培養于含終濃度為0.2 g·L-1G418的N2a細胞完全培養基中,置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

取對數生長期的細胞按一定的密度鋪板,在37 ℃、5%CO2培養箱孵育24 h后,進行分組給藥。N2a細胞(正常對照組,NC)、N2a/App695細胞分為模型對照(MC)組、HKSX低中高3個劑量組,NC組和MC組給予15%的空白血清[8],HKSX給藥組分別給予15%的低、中、高劑量含藥血清。在研究線粒體自噬抑制劑的影響時,增加一個H+M-1組,即提前給予25 μmol·L-1Mdivi-1[9]干預2 h,再給予HKSX含藥血清,所有組別給藥24 h后,進行如下指標檢測。

2.4 MTT法檢測含藥血清對細胞增殖的影響取對數生長期的N2a、N2a/App695細胞接種于96孔板中,每孔5×103個細胞,設6個復孔。給藥結束后,在避光條件下向每孔中加入20 μL MTT試劑(5 g·L-1)[4],4 h取出,吸棄各孔的培養基,并加入150 μL DMSO,置于37 ℃微孔板恒溫振蕩器中振蕩10 min,使結晶物充分融解,用酶標儀測量490 nm處各孔的A值。

2.5 ELISA檢測Aβ1-42的表達將N2a、N2a/APP695細胞按3×108L-1的密度接種于6孔板中,給藥結束后,吸出上清液,按試劑盒說明書測定Aβ1-42的含量[6],下層細胞用裂解液裂解,BCA測定蛋白濃度,單位以每克蛋白質中Aβ1-42的含量計算。

2.6 線粒體功能檢測

2.6.1JC-1法檢測線粒體膜電位 細胞按3×108L-1的密度接種于直徑為3.5 cm的小皿中,給藥結束后,每孔加入1 mL JC-1染色工作液,置于細胞培養箱中孵育,按照試劑盒說明書[9]在熒光顯微鏡激發光490 nm、發射光530 nm處檢測JC-1單體綠色熒光,激發光525 nm、發射光590 nm處檢測JC-1聚合體紅色熒光。在正常情況下,線粒體膜電位較高,JC-1為聚合物呈紅色熒光;而在線粒體膜電位水平降低時,JC-1形成單體產生綠色熒光,通過綠色到紅色熒光的轉變,指示線粒體膜電位的恢復程度。

2.6.2DCFH-DA法檢測ROS 細胞按3×108L-1的密度接種于6孔板中,給藥結束后,每孔加入1 mL DCFH-DA探針溶液,37 ℃培養箱中孵育,按照試劑盒說明書在激發波長488 nm,發射波長525 nm檢測條件,用熒光酶標儀進行檢測,結果以各組濃度/正常對照組平均濃度(fold chang)表示。

2.6.3ATP檢測 細胞按3×108L-1的密度接種于6孔板中,給藥結束后,吸棄上清,PBS清洗后加入裂解液,置于冰上充分裂解,離心取上清。按試劑盒說明書向檢測孔中加入100 μL ATP檢測工作液,室溫放置5 min,再分別加入20 μL標準品和樣品,迅速用槍混勻,用化學發光酶標儀檢測,根據標準曲線計算樣品中的ATP濃度,結果以各組濃度/正常對照組平均濃度(fold change)表示。

2.7 Western blot法檢測線粒體自噬相關蛋白的表達細胞按3×108L-1的密度接種于6孔板中,給藥結束后,吸棄上清,用預冷的PBS輕洗3次,每孔加入150 μL裂解液,置于冰上裂解15 min,用刮刀刮至一側,吸至EP管中,4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min取上清,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,調至統一濃度后,加入5× Loading Buffer 混勻,金屬浴96 ℃、10 min進行蛋白變性。

配制丙烯酰胺凝膠,每孔上樣30 μg[5],按80 V 30 min,120 V 60 min 進行電泳;甲醇激活PVDF膜,260 mA轉膜2 h,用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h,按1 ∶1 000稀釋β-actin、PINK1、Parkin、LC3、p62、p-Tau S396一抗,4℃搖床孵育過夜;次日,將膜用TBST洗5次,每次5 min,室溫孵二抗2 h,用TBST洗5次,每次5 min,配制顯影液,用凝膠成像儀成像分析。

3 結果

Fig 1 HPTLC chart of carbohydrate componentsin HKSX medicated serum

3.2 HKSX含藥血清對N2a/App695細胞活力無影響如Fig 2所示,通過MTT檢測HKSX含藥血清對細胞的毒性,與NC組相比,15%的HKSX低、中、高3個劑量的含藥血清對細胞活力均無明顯影響,表明HKSX含藥血清無細胞毒性,可以進行后續實驗。

Fig 2 Effect of HKSX medicated serum

3.3 HKSX含藥血清能夠降低N2a/App695細胞中Aβ1-42的沉積ELISA實驗顯示,與NC組相比,MC組細胞Aβ1-42水平明顯升高(P<0.01),給予HKSX含藥血清干預后,Aβ1-42的水平呈劑量依賴性下降,高劑量組的清除效果尤為明顯(P<0.01),見Fig 3。結果表明,HKSX能夠清除Aβ1-42在神經細胞中的沉積,降低其神經毒性的損傷,發揮神經保護作用。

Fig 3 HKSX medicated serum reduced level of Aβ1-42

3.4 HKSX含藥血清改善N2a/App695細胞的線粒體功能AD發生時常伴隨著線粒體功能障礙,如Fig 4A所示,與NC組相比,MC組綠色熒光明顯,表明線粒體膜電位Δψm降低,而HKSX含藥血清處理后,紅色熒光明顯增多,表明線粒體膜電位Δψm明顯升高。此外,如Fig 4B-C所示,MC組ROS水平明顯升高以及ATP含量降低,HKSX處理后可以降低ROS水平并明顯提高ATP的含量,以高劑量組療效更為明顯(P<0.01),說明HKSX含藥血清能夠改善線粒體功能障礙。

Fig 4 HKSX medicated serum improved mitochondrial

3.5 HKSX含藥血清調節線粒體自噬相關蛋白表達通過Western blot檢測PINK1-Parkin線粒體自噬通路中相關蛋白的表達水平,結果如Fig 5所示,與NC組相比,MC組PINK1、Parkin及LC3II的表達明顯降低,而p62表達量明顯升高;HKSX含藥血清給藥處理后,與MC組相比,PINK1、Parkin及LC3Ⅱ的表達提升,同時下調p62水平,以高劑量組效果明顯。這表明通過HKSX含藥血清的干預,能夠劑量依賴性激活線粒體自噬,加快對磷酸化Tau蛋白的清除,減弱其神經毒性,改善神經功能。

3.6 線粒體自噬抑制劑Mdivi-1對HKSX神經保護作用的影響

Fig 5 HKSX medicated serum regulated expression of mitophagy-related proteins and reduced expression of p-Tau Ser396 protein in N2a/App695

3.6.1線粒體自噬抑制劑干擾了HKSX對p-Tau蛋白的清除 由Fig 6可以看出,與HKSX組相比,HKSX+Mdivi-1組PINK1、Parkin蛋白表達明顯降低(P<0.01),說明加入Mdivi-1后,PINK1/Parkin通路確實受到了抑制。與此同時,Tau蛋白Ser396位點的磷酸化程度增多(P<0.01),這一結果表明,HKSX對p-TauSer396的清除作用與PINK1-Parkin通路密切相關。

Fig 6 Mitophagy inhibitor inhibited clearance of p-Tau Ser396 protein by

3.6.2線粒體自噬抑制劑干擾了HKSX對Aβ1-42的降低 ELISA結果同樣顯示,與H-HKSX組相比,加入線粒體自噬抑制劑Mdivi-1后,再給予高劑量含藥血清,Aβ1-42水平明顯升高(P<0.01),見Fig 7,表明HKSX主要是通過線粒體自噬途徑清除Aβ1-42在神經細胞中的沉積,降低其神經毒性的損傷,從而起到防治AD的效果。

Fig 7 Mitophagy inhibitor inhibited clearance of Aβ1-42

4 討論

大量研究表明,AD患者大腦中普遍存在線粒體異常,線粒體形態和功能障礙是神經元細胞損傷和積累的重要因素。神經元內受損的線粒體主要通過線粒體自噬途徑進行清理,是線粒體質量控制的重要機制,在維持神經細胞的功能、保護腦內神經元細胞和神經信號的傳導中發揮著重要作用[10]。

PINK1-Parkin信號通路是介導線粒體自噬的重要途徑,在調節線粒體功能完整性中發揮重要作用[3]。線粒體受損時,PINK1大量聚集于線粒體外膜,積累并招募Parkin,繼而對線粒體外膜的蛋白進行泛素化,誘導線粒體自噬,隨后,包括p62在內的受體蛋白在線粒體外膜上積累,導致泛素化的產物與LC3結合被招募到自噬體中,成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,受損的線粒體就能夠被降解[2]。在AD樣本中,PINK1的表達量降低,其介導的線粒體自噬受阻,小鼠表現出Aβ積聚的增加,線粒體的異常,學習記憶功能和突觸可塑性的損傷;而提高PINK1的表達可以降低Aβ的水平,改善線粒體功能,緩解認知功能損害[11]。所以,PINK1-Parkin信號通路的調控對于減輕AD中神經元損傷十分重要,是神經保護作用的關鍵機制之一。

AD 屬中醫“呆病”、“健忘”、“善忘”等范疇,是一種與年齡關系最為密切的神經退行性疾病,“濁毒損腦”是其中醫病機的重要方面。機體衰老,腎氣虛衰,腎虛水無所主,脾虛不運水濕,濕聚生痰濁,痰擾清靈則昏蒙呆鈍。如清·唐容川《血證論》云：“凡心有瘀血,亦令健忘”,《類證治裁》云：“若血瘀于內,而善忘如狂。所以,瘀濁痰是AD發病中最常見的病邪。中醫認為精微滯留蓄積而為濁,細胞中衰老的細胞器、錯誤合成或折疊錯誤的蛋白質,都屬于中醫的內生痰濁、瘀血之邪,是中醫痰瘀在細胞微觀層面上的體現[12]。AD的病理標志物Aβ沉積、過度磷酸化的Tau蛋白,包括受損的線粒體,都可以被看作是人體腎精虧虛,臟腑功能紊亂產生的痰濁瘀血[13]。研究表明,在AD的細胞,轉基因動物模型及人類大腦樣本中,均觀察到線粒體自噬功能受到損傷;而激活PINK1-Parkin介導的線粒體自噬,能夠及時清除受損線粒體,改善線粒體功能,進而加快對Aβ和磷酸化Tau蛋白等“痰濁瘀血”的清除,逆轉AD記憶喪失[14],所以線粒體自噬功能障礙可能為AD“濁毒損腦”的微觀機制。

HKSX的有效成分為中藥昆布中提取的FPS,研究表明FPS能夠通過抗炎、抗氧化、調節膽堿能系統,抑制Aβ的產生及Tau的過度磷酸化,改善AD[15]。其中部分研究發現,FPS可以通過維持線粒體功能來減少神經毒性損傷[16],但是其改善線粒體功能更深入的作用機制是什么?從中醫藥角度分析,HKSX化濁排毒,善利水化痰,適用于癥瘕痰瘀膠結之證,而線粒體自噬可以通過降解細胞內的受損線粒體,進而清除Aβ及p-Tau等“濁毒”,推測HKSX可以調節PINK1-Parkin介導的線粒體自噬干預AD。

實驗結果表明,給予HKSX干預后,能夠劑量依賴性地提高N2a/App695細胞中內線粒體自噬相關蛋白PINK1、Parkin的表達,激活線粒體自噬,改善細胞線粒體的功能,進而加快神經元細胞內Aβ及p-Tau S396蛋白的清除,減弱其神經毒性,改善神經功能,進而起到防治AD的作用。這些結果表明,HKSX可以通過激活PINK1-Parkin通路調節線粒體自噬,發揮神經保護作用;同時加入線粒體抑制劑后,對Aβ及p-Tau S396的清除能力被抑制,驗證了HKSX的神經保護作用與PINK1-Parkin介導的線粒體自噬密切相關。

關于HKSX含藥血清通過哪些成分激活線粒體自噬,目前還較難確定。HKSX的有效成分為分子量為96.9 ku 的FPS,這一分子量的多糖類成分以原型入血的可能性極小。Chen等[17]研究表明,FPS在胃內降解為分子量下降,鏈構象更加靈活的多糖,在腸道中進一步被腸道菌群降解。我們的研究也發現HKSX中的FPS入血后,主要被代謝為單糖或二糖。而且,FPS還可以調節腸道菌群,產生短鏈脂肪酸,進一步影響宿主代謝[17]。此外,研究亦發現,FPS可以調節膽汁酸,氨基酸等的代謝[18],這個過程比較復雜,后續我們會進行更深入的研究。

綜上所述,基于AD、化濁排毒及線粒體自噬三者之間的關系,我們創新性地從線粒體自噬的角度對具有化濁排毒作用的HKSX干預AD的作用及機制進行探討,在細胞水平探索了HKSX含藥血清的神經保護功能及線粒體自噬相關的作用機制。研究結果初步證實了HKSX通過激活PINK1-Parkin通路,增強線粒體自噬,發揮神經保護作用,為其防治AD的臨床應用提供科學依據。此外,也在一定程度上探討了化濁排毒與PINK1-Parkin線粒體自噬通路的關系,以期能夠為AD的中醫發病機制及其他化濁排毒中藥防治AD的作用機制研究提供思路。