基于腸道菌群探討粗壯女貞總苷對高脂血癥金黃倉鼠的降脂作用機制

徐晨曦,潘瑞樂,董夢晨,楊志宏,李曉亞,金 文,楊潤梅

[中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所中藥(天然藥物)創新藥物研發平臺北京市重點實驗室,北京 100193 ]

高脂血癥又稱血脂異常,是指由各種原因導致的血漿中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)及低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)中一種或多種脂質水平升高或高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)降低的一種代謝性疾病,是動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的重要危險因素[1]?！吨袊用駹I養與慢性病調查報告(2020)》顯示,我國18歲及以上居民高脂血癥總體患病率高達35.6%,約5億人[2]。

引起血脂異常的原因有很多,遺傳、不良生活方式和全身性疾病等都會造成疾病的發生。而隨著國人生活水平的提升,以高糖、高鹽、高脂肪等飲食為代表的不良生活方式成為高脂血癥發病的主要原因?，F代醫學治療高脂血癥的藥物主要有他汀、貝特以及煙酸類藥物等,長期使用對患者肝臟、肌肉和胃腸道副作用大[3]。中藥具有多途徑、多靶點、整合調節機體功能的特點[3],從傳統中藥中開發降脂藥物現已成為研究熱點。

苦丁茶是我國民間一種應用廣泛的純天然保健飲品,《本草再新》中記載苦丁茶消食化痰,除煩止渴,利二便,去油膩?？喽〔柙参镏饕▋深?一類是以冬青科(Aquifoliaceae)大葉冬青(IlexlatifoliaThunb.)和苦丁茶冬青(llexkudingchaC.J.Tseng)等葉片制作的大葉苦丁茶;另一類是以木犀科(Oleaceae)粗壯女貞[Ligustrumrobustum(Roxb.) Blume]等葉片加工制作的小葉苦丁茶?，F代研究證實,粗壯女貞葉具有良好的降脂減肥、降壓降糖、抗氧化、保肝護肝、鎮痛消炎、抗菌抗病毒、調節腸道菌群等功效[4]。本課題組前期研究發現,粗壯女貞葉降脂活性成分主要為苯丙素苷類化合物,即粗壯女貞總苷(total phenylpropanoid glycosides extracted fromLigustrumrobustum(Roxb.) Blume,LRTPG);并發現LRTPG能夠明顯降低高脂血癥倉鼠的TG、TC、LDL-C水平以及肥胖小鼠的體質量和李氏指數,主要通過激活AMPK-SREBP-1c和JAK/STAT-SREBP1通路,抑制下游脂肪酸和TG合成酶的表達,從而抑制TG合成,并加速膽固醇分解代謝,達到調節脂質代謝的效果[5-7]。

近年來腸道菌群被認為是降脂的新機制,已有大量研究表明,很多具有降脂功效的中藥成分如小檗堿、白藜蘆醇等具有調節腸道菌群的作用[8]。同時腸道菌群與高脂血癥等心腦血管疾病聯系密切,其相關性日益受到重視[9]。由此我們在已有研究基礎上,以高脂飼料誘導建立金黃倉鼠高脂血癥模型,并對模型倉鼠灌胃LRTPG 4周,收集結直腸部位成形糞便,采用16S rDNA 高通量測序技術測定對照組、模型組、LRTPG-H組倉鼠腸道菌群,分析LRTPG對高脂血癥倉鼠腸道菌群的影響,基于腸道菌群角度研究LRTPG的降脂作用機制,為粗壯女貞開發降脂藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級敘利亞金黃倉鼠60只,♂,體質量80～110 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2021-0011。金黃倉鼠飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所SPF級動物房,使用許可證編號：SYXK(京)2017-0020,晝夜交替光照,溫度(25±2)℃,濕度50%～70%。普通飼料由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供,許可證：蘇飼證(2019)01008,高脂飼料(15%豬油,0.2%膽固醇,84.8%基礎飼料)由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號：SCXK(京)2020-0004。

1.2 藥物LRTPG是從苦丁茶基原植物粗壯女貞的干燥葉片中提取的總苯丙素苷類物質,由深圳技術大學賀震旦教授課題組制備提供。批號是202109,經HPLC定量分析本批次LRTPG中苯丙素苷類物質含量為87.7%。

1.3 主要試劑和儀器非諾貝特膠囊,法國利博福尼制藥公司生產,批號31055;TC測定試劑盒,批號221851;TG測定試劑盒,批號221152;LDL-C測定試劑盒,批號231771;LDL-H測定試劑盒,批號231721,均購于中生北控生物科技股份有限公司。AU480 全自動生化分析系統(中國貝克曼庫爾特商貿有限公司),TGL-160aR型高速低溫離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.4 分組及干預方法60只金黃倉鼠適應性喂養3 d后根據體質量隨機分為對照組、模型組、陽性藥組(非諾貝特50 mg·kg-1)、LRTPG-L組(0.3 g·kg-1)、LRTPG-M組(0.6 g·kg-1)、LRTPG-H組(1.2 g·kg-1),每組10只。對照組倉鼠飼喂基礎維持飼料,其他5組倉鼠飼喂高脂飼料,1周后眼球后靜脈叢取血檢測血脂4項(TG、TC、HDL-C、LDL-C),確定造模成功。根據血脂水平將模型組、陽性藥組、LRTPG-L組、LRTPG-M組、LRTPG-H組調整分組,使組間無差異。陽性藥組倉鼠灌胃給予濃度為5 g·L-1的非諾貝特水溶液,LRTPG-L組、LRTPG-M組、LRTPG-H組倉鼠分別給予濃度為30 g·L-1、60 g·L-1、120 g·L-1的LRTPG水溶液,灌胃量為10 mL·kg-1,對照組和模型組倉鼠灌胃給予等量的去離子水。每日1次,連續4周。末次灌胃后禁食不禁水12 h,麻醉后眼球后靜脈叢取血,用于血脂4項檢測,之后頸椎脫臼處死,取肝臟組織及結直腸成形糞便,放入液氮速凍,轉移至-80 ℃冰箱保存,用于肝脂檢測以及糞便16S rDNA測序。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1體質量、血脂及肝脂檢測 每日觀察倉鼠精神狀態,每周記錄體質量。造模1周后及給藥4周后禁食不禁水12 h,眼球后靜脈叢取血,分離血清(15 min,7 500 r·min-1,4 ℃),測定血脂含量(TG、TC、HDL-C、LDL-C)。取部分肝臟組織勻漿后取上清,測定肝臟TG、TC含量。

1.5.2腸道微生物數據處理與分析 每組隨機挑選6個樣品,利用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals,Santa Ana, US)試劑盒提取糞便細菌基因組DNA,根據目標測序區域合成barcode 特異引物,PCR擴增后,采用Qubit熒光定量系統對PCR產物的電泳結果進行定量檢測,結合每個樣品的測序數量要求和定量結果進行相應比例混合。Paired-end測序在北京奧維森基因科技有限公司的Illumina平臺(MiSeq)上完成。為得到高質量的reads,利用內部編寫程序去除tags兩端的barcode序列及引物序列,運用Usearch (vertion 8.0.1623)軟件去除嵌合體及其短序列等后得到clean_tags。拼接過濾后的clean_tags,用QIIME(v1.8.0)軟件將其聚類為用于物種分類的操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),根據獲得的OTUs進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析及各水平(門、綱、目、科、屬)物種組成分析。

2 結果

2.1 LRTPG對高脂血癥倉鼠體質量、血脂及肝脂的影響實驗期間倉鼠狀況良好,大小便及自主活動未見異常,體質量穩定增長。造模1周后,與對照組相比,高脂喂養的5組倉鼠體型肥胖,體質量有所升高,但差異不具有統計學意義(Fig 1A)。造模1周后,與對照組比較,飼喂高脂飼料的模型組、陽性藥組、LRTPG-L組、LRTPG-M組、LRTPG-H組倉鼠血清TG、TC和LDL-C水平均明顯升高,表明混合型高脂血癥模型成功建立(Fig 1B)。給藥4周即造模5周后,與對照組比,模型組倉鼠血清TG、TC、LDL-C水平和肝臟TG、TC含量均明顯升高;與模型組相比,LRTPG 0.6 g·kg-1、1.2 g·kg-1劑量給藥4周能明顯降低倉鼠血清TG、TC、LDL-C水平和肝臟TG、TC含量,差異有統計學意義(Fig 1C-D)。

Fig 1 Effects of LRTPG on body weight, blood lipid and liver lipid in hyperlipidemia

2.2 LRTPG對高脂血癥倉鼠腸道菌群的影響

2.2.1Shannon-Wiener曲線及物種積累曲線 Shannon-Wiener曲線是反應樣本微生物多樣性的指數,物種累積曲線是用于描述隨著樣本量的增加物種種類增多的狀況。當曲線的走勢趨向平坦時,說明測序的數據量已足夠多,可以進行數據分析,能夠反映樣本中絕大多數的微生物信息。

由Fig 2可知,隨著測序深度的增加,本次實驗Shannon-Wiener曲線及物種累積曲線趨向平坦,表明實驗數據能夠反應物種真實性,可進行后續結果分析。

2.2.2OTU及Alpha多樣性分析結果 OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度,Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析,基于OTU的結果,分別運用Chao1 index(豐富度指數)、 observed number of species、PD whole tree(豐富度與均勻度指標) 和Shannon index(多樣性指數)共4個指數來測算腸道微生物的豐富度和多樣性。

Fig 2 Shannon-Wiener curve and Species accumulation curve

結果表明,模型組OTU數量平均值5 521低于對照組平均值6 189,LRTPG-H組OTU數量平均值7 223明顯高于模型組;模型組chao1、observed species、PD whole tree、shannon數量低于對照組,LRTPG-H組chao1、observed species、PD whole tree、shannon數量高于模型組。說明高脂血癥倉鼠的腸道菌群多樣性降低,而給予LRTPG干預后能夠改善其腸道菌群的多樣性(Fig 3)。

Fig 3 Effects of LRTPG on OTU and alpha diversity of intestinal flora in hamsters

2.2.3Beta多樣性分析 主成分分析(principal component analysis,PCA)能夠反應樣品群落組成的相似程度,樣品距離越近則表示物種群落結構越相似。

PCA分析比較不同組別倉鼠腸道菌群結構,結果由Fig 4可知,對照組與模型組菌群結構具有明顯差異,表明高脂飲食會造成腸道微生物群落結構發生明顯變化。與模型組比較,LRTPG引起了倉鼠腸道微生物群落結構的偏移,表明LRTPG干預改變了倉鼠的腸道菌群組成。

Fig 4 Effect of LRTPG on beta diversity of intestinalflora in hyperlipidemia hamsters

2.3 組間菌群組成及差異分析將對照組、模型組、LRTPG-H組倉鼠結直腸成形糞便中的菌群組成進行分析,結果顯示,3組在門水平優勢物種相同,但相對豐度不同。門水平上,與對照組相比,模型組厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度由51.4%增加到60%,擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度由45.2%降低到36.4%,厚壁菌門/擬桿菌門升高幅度為44.9%,差異菌群為迷蹤菌門(Elusimicrobia)(P<0.05);而與模型組比較,LRTPG組則呈相反趨勢,厚壁菌門相對豐度由60%降低到50.6%,擬桿菌門相對豐度由36.4%增加到40%,厚壁菌門/擬桿菌門降低幅度為25.4%,差異菌群為疣微菌門(Verrucomicrobia)(P<0.01)和藍菌門(Cyanobacteria)(P<0.05)(Fig 5A)。

科水平上,與對照組相比,高脂飲食降低了模型組倉鼠腸道克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、Elusimicrobiaceae的相對豐度,升高了雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、紅蝽菌科(Coriobacteriaceae)、優桿菌科(Eubacteriaceae)的相對豐度;與模型組比較,LRTPG-H組升高了倉鼠腸道克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、疣微菌科 (Verrucomicrobiaceae)相對豐度,降低了乳酸菌科(Lactobacillaceae)相對豐度(Fig 5B)。

屬水平組間比較結果顯示,與對照組相比,模型組上調厚壁菌門醋桿菌屬(Acetobacterium)相對豐度(P<0.01);下調厚壁菌門厭氧菌屬(Anaerovorax)(P<0.01)、孢桿菌屬(Sporobacter)(P<0.05)、顫桿菌克屬(Oscillibacter)(P<0.01)、顫螺菌屬(Oscillospira)(P<0.05)、乳頭桿菌屬(Papillibacter)(P<0.05)、解黃酮菌屬(Flavonifractor) (P<0.05)、腸桿菌屬(Intestinimonas)(P<0.01)、消化球菌屬(Peptococcus)(P<0.01)此8個屬的相對豐度;下調變形菌門海旋菌屬(Thalassospira)相對豐度(P<0.05),差異菌群共10個。藥物干預4周后,與模型組比較,LRTPG-H組逆轉了高脂飲食導致的上述厚壁菌門中9個屬水平菌群的相對豐度及疣微菌門阿克曼氏菌屬(Akkermansia)(P<0.01)的相對豐度變化,下調乳酸菌屬(Lactobacillus)(P<0.01)、臭味桿菌屬(Odoribacter)(P<0.05)相對豐度以及上調厭氧孢桿菌屬(Anaerosporobacter)(P<0.05)的相對豐度,差異菌群共13個(Fig 5C-D)。

Fig 5 Effect of LRTPG on intestinal flora of hyperlipidemia hamsters

3 討論

本研究結果顯示,給予高脂飲食5周的模型組金黃倉鼠血清TG、TC、LDL-C水平及肝臟TG、TC含量均明顯高于對照組,表明高脂飲食能夠誘導倉鼠高脂血癥以及肝臟脂質蓄積的發生。而給予LRTPG干預4周后,倉鼠血清TG、TC、LDL-C水平及肝臟TG、TC含量明顯降低,表明LRTPG具有較好的降脂功效,與課題組前期研究結果一致[5-6]。

腸道菌群是生物體腸道功能的重要組成部分,參與調控宿主的多種代謝途徑。近年來許多研究表明,腸道菌群與高脂血癥之間也有著千絲萬縷的聯系。腸道菌群失衡會使機體糖類、脂肪等代謝紊亂,造成高脂血癥的發生[10]。本研究采用16S rDNA高通量測序技術測定高脂血癥模型倉鼠腸道菌群,分析LRTPG對高脂血癥倉鼠腸道微生物群落的影響。研究結果發現高脂飲食造成模型組倉鼠腸道菌群OTU及Alpha多樣性降低,而給予LRTPG后發生逆轉,提示LRTPG能夠改善高脂血癥模型倉鼠腸道菌群紊亂狀態,增加其腸道微生物的多樣性,使其向更為健康的方向發展。

測序結果顯示,與對照組比較,隨著高脂血癥的發生,模型組金黃倉鼠腸道厚壁菌門相對豐度升高,擬桿菌門、疣微菌門相對豐度降低,厚壁菌門/擬桿菌門比值升高;LRTPG干預后,與模型組比較上述菌群相對豐度趨勢發生了逆轉。有研究表明,腸道菌群占比最大的厚壁菌與擬桿菌是對血脂變化影響最大的主要菌門。厚壁菌門具有分解腸道飽和脂肪酸和調控宿主增強脂肪積累的功效,過量的能量攝入會導致厚壁菌門大量繁殖,造成腸道菌群失調以及肥胖的發生[10];而擬桿菌門則能夠通過降解飲食中的多糖,增加短鏈脂肪酸水平,調控宿主的能量和脂肪代謝[11],許多研究認為厚壁菌門/擬桿菌門比值與肥胖呈負相關[10]。結合本研究結果,提示LRTPG可能通過調節腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門的比例發揮降脂作用。而且我們還發現LRTPG給藥前后菌群豐度差異最顯著的是疣微菌門,已被證實疣微菌門有助于維持腸道屏障穩態,其豐度降低與肥胖、糖尿病、脂肪肝等多種代謝性疾病密切相關[12]。

研究證實,克里斯滕森菌科、瘤胃球菌科、消化球菌科、疣微菌科相對豐度與宿主體質量指數(body mass index,BMI)、血清TG水平呈負相關[8, 12-14]。瘤胃球菌科顫螺菌屬在瘦人中富集,與兒童和成人BMI下降相關,已被作為候選的益生菌之一[14]。Liu等[15]對中國人群進行隨機化分析,結果顯示喜樹科顫桿菌克屬相對豐度的增加與甘油三酯水平、BMI、腰臀比的降低呈因果關系;梭菌科解黃酮菌屬是腸道健康的重要菌群,其含量與肥胖呈負相關[16];疣微菌科阿克曼氏菌屬Akkermansiamuciniphila菌是一種潛在的益生菌,在腸道黏液層中生長,通過與結腸上皮細胞Toll受體結合及調節緊密連接蛋白的表達等來維持腸道穩態,可通過調節脂肪合成相關基因和肝臟不同炎癥性標志物的表達,進而改善高脂飲食誘導的高脂血癥、肥胖、胰島素抵抗和腸道炎癥等疾病[12, 17]。本研究結果顯示,LRTPG干預后,在科水平上可升高高脂血癥倉鼠腸道菌群中克里斯滕森菌科、消化球菌科、疣微菌科相對豐度,在屬水平上明顯升高顫螺菌屬、顫桿菌克屬、解黃酮菌屬和阿克曼氏菌屬的相對豐度。進一步說明LRTPG對高脂血癥倉鼠的降脂作用與其對腸道菌群的調節密切相關。

綜上所述,LRTPG能夠降低高脂飲食導致的金黃倉鼠血清脂質升高和減輕肝臟脂質蓄積,具有較好的降低血脂、肝脂作用,并且能夠改善高脂血癥金黃倉鼠腸道菌群紊亂狀態,調節厚壁菌門、擬桿菌門恢復至正常豐度,增加有益于降脂減肥的疣微菌門阿克曼氏菌屬、厚壁菌門顫螺菌屬、顫桿菌克屬、解黃酮菌屬相對豐度,從腸道菌群角度闡釋了LRTPG的降脂作用,為LRTPG開發降脂藥物提供參考。然而LRTPG對腸道菌群的調節作用在其治療高脂血癥作用中的貢獻度、以及總苷如何影響腸道菌群代謝物等都有待進一步研究。