新型查爾酮衍生物MW-9抑制MAPK信號通路治療小鼠潰瘍性結腸炎

吳 招,鄒楠婷,張春菲,張浩洪,莫慶艷,巨鳴謙,胥興彩,毛澤偉,萬春平,

(云南中醫藥大學1.中藥學院、2.基礎醫學院、3.第三附屬醫院脾胃肝病科,云南 昆明 650500)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)臨床上將其歸類于慢性結腸黏膜炎癥性疾病,臨床表現主要為腸黏膜炎癥引起的腹瀉、腹痛及化膿性便血等。UC患者病情不穩定,常常復發交替[1]。對于UC的發病機制至今尚未明確,研究表明其主要與遺傳因素、環境變化、免疫系統失調紊亂和體內腸道菌群微生物失調相關[2]。目前臨床上治療UC的藥物主要為美沙拉嗪、柳氮磺吡啶、潑尼松以及單克隆抗體治療,但治療效果仍不理想。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路是細胞內信號轉導的重要途徑,廣泛存在于真核細胞中,參與細胞分化、增殖、分裂和凋亡的調控[3]。細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路是MAPK的一條經典信號通路,除ERK1/2外,MAPK家族還有另外兩個成員,即c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38,二者在促進細胞凋亡中起主要作用[4]。最新研究表明,MAPK信號通路與UC發病密切相關,其激活被認為是導致UC細胞因子和炎癥介質釋放的主要因素之一[5-6]。

查爾酮及其衍生物是一類存在于甘草、紅花等藥用植物中的天然有機化合物,表現出抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗菌和免疫調節等多種藥理活性[7],特別是對T、B淋巴細胞等免疫細胞具有明顯的作用[8]。為進一步提高查耳酮的抗炎免疫活性,基于構效關系研究,我們通過化學拼接的方法,將查耳酮和哌嗪環拼接合成一系列衍生物,并對這一系列衍生物進行抗炎、免疫活性篩選。前期研究發現,MW-9可明顯下調脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導巨噬細胞RAW264.7炎癥因子一氧化氮(nitric oxide,NO)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的水平,提示MW-9體外具有良好的抗炎作用[9]?；诖?本研究通過構建巨噬細胞炎癥模型和UC動物模型,以期揭示新型查耳酮衍生物MW-9抑制MAPK信號通路治療UC的效應機制,為將MW-9開發為治療UC的候選藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑新型查耳酮衍生物MW-9由云南中醫藥大學中藥學院毛澤偉教授提供,純度≥98%,黃色粉末,難溶于水。LPS(貨號：L2880),購自美國Sigma公司;γ干擾素(interferon γ,IFN-γ)(貨號：P01580),購自上海近岸蛋白質科技有限公司;葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt,DSS)(貨號：160110),購自上海安倍醫療器械貿易有限公司;IL-6(貨號：302971-003)、TNF-α(貨號：348105-005)、IL-1β(貨號：305457-003)的ELISA檢測試劑盒,均購自賽默飛世爾科技中國有限公司;p38(貨號：14064-1-AP)、p-p38(貨號：28796-1-AP)、ERK1/2(貨號：11257-1-AP)、p-ERK1/2(貨號：28733-1-AP)、JNK(貨號：51151-1-AP)、p-JNK抗體(貨號：80024-1-AP),均購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 儀器DMI3000倒置顯微鏡(德國Leica公司);SERIESⅡWATER JACKET細胞培養箱(德國Thermo公司);SepctraMax-i3X多功能酶標儀(美谷分子儀器上海有限公司);Chtmstudio多功能凝膠成像系統(美國UVP公司)。

1.3 細胞與實驗動物小鼠巨噬細胞株RAW264.7,購自昆明動物研究所。SPF級C57BL/6J小鼠,♂,8周齡,體質量(22±2)g,購自北京斯貝福實驗動物有限公司,動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0010。小鼠飼養于云南省中醫醫院中心實驗室屏障動物房,溫度(25±2)℃,濕度(55±5)%,自由飲水飲食。

1.4 方法

1.4.1細胞培養 用含10%胎牛血清的DMEM培養液,于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養RAW264.7細胞。

1.4.2MTT法檢測MW-9對細胞活性的影響 RAW264.7細胞培養至80%左右,PBS清洗,0.25%胰酶消化后,細胞濃度調至5×108·L-1,加至96孔細胞培養板中。設對照組與MW-9干預組(1.5、3、6 mg·L-1),繼續培養24 h后,每孔加入20 μL的MTT,于37 ℃繼續培養2 h,離心,棄上清,每孔加入150 μL DMSO,振蕩,酶標儀570 nm處檢測吸光度。

1.4.3Griess試劑法檢測MW-9對細胞培養上清中NO含量的影響 RAW264.7細胞濃度調為2×109·L-1,加至96孔細胞培養板,設不刺激對照組、刺激對照組(10 mg·L-1LPS+5 g·L-1IFN-γ)及藥物干預組(1.5、3、6 mg·L-1)。37 ℃繼續培養24 h,取細胞培養上清,檢測NO含量。將NaNO2標準品梯度稀釋,與待測培養上清液分別加至96孔板中,每孔100 μL,Griess試劑加至96孔板中,每孔100 μL,酶標儀540 nm處檢測吸光度,根據標準曲線計算NO的含量。

1.4.4ELISA法檢測細胞因子水平 細胞分組同“1.4.3”,在37 ℃、5 % CO2細胞培養箱培養48 h,收集培養上清。按照試劑盒說明書檢測細胞培養上清中IL-6、TNF-α、IL-1β的水平。

1.4.5實驗動物分組及UC小鼠模型的構建 小鼠適應性飼養1周后,根據體質量隨機將小鼠分為正常對照組、模型組、MW-9低劑量組(20 mg·kg-1)、MW-9高劑量組(40 mg·kg-1),每組8只。藥物溶于羧甲基纖維素鈉中,制備成混懸液,給藥劑量參照MW-9治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠的劑量[9]。本實驗方案通過云南省中醫醫院動物倫理委員會審查(編號：DW2022-015)。小鼠分組后,給予3% DSS溶液喂養,正常對照組給予等量純凈水,給藥組造模的同時給予MW-9藥物干預,造模持續10 d,造模d 1開始給藥。

1.4.6實驗動物數據的記錄與收集 造模給藥開始后,每天記錄小鼠體質量及飲水量變化。造模結束后,小鼠眼球取血,頸椎脫臼處死后,取結腸并進行評分,結腸評分標準參照：0分=結腸黏膜正常;1分=結腸黏膜局部充血,無潰瘍及壞死;2分=結腸黏膜充血并局部壞死;3分=結腸黏膜有多處充血和壞死;4分=沿腸壁多位點充血潰瘍范圍>1 cm,同時測量結腸長度和重量。

1.4.7HE染色 取結腸固定于10%福爾馬林固定液中,用不同濃度乙醇對標本進行脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切成4 μm薄片,蘇木精-伊紅染色,封邊觀察。病理評分標準如下：0分=正常,無炎癥跡象;1分=低白細胞浸潤;2分=中度白細胞浸潤;3分=高白細胞浸潤,中度纖維化,結腸壁增厚,中度杯狀細胞丟失,局灶性隱窩丟失;4分=白細胞透壁浸潤,杯狀細胞大量丟失,廣泛纖維化,彌漫性隱窩丟失。

1.4.8ELISA檢測血清細胞因子水平 末次給藥后,小鼠眼眶取血,離心吸取上清,按照試劑盒說明書測定IL-6、TNF-α和IL-1β水平。

1.4.9Western blot檢測蛋白表達 稱取50 mg結腸組織,加入RIPA組織裂解液和蛋白酶、磷酸酶抑制劑,離心取上清,BCA蛋白定量,變性后保存備用。電泳,轉膜,奶粉封閉后,加入p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK抗體孵育過夜,清洗后加入二抗孵育2 h,清洗后顯影。運用ImageJ軟件分析處理蛋白條帶。

1.4.10統計學分析 所有數據采用GraphPad Prism、SPSS 22.0軟件進行統計分析。采用兩個獨立樣本t檢驗來確定兩組之間的差異,以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MW-9對RAW264.7細胞產生NO的影響如Fig 1所示,查耳酮衍生物MW-9在6 mg·L-1濃度范圍內不影響RAW264.7細胞活性。與刺激模型組相比,MW-9干預后明顯抑制RAW264.7細胞NO的產生,其半數細胞抑制濃度(IC50)為20.47 mg·L-1。

Fig 1 Cytotoxicity and NO concentration of chalcone derivative MW-9 on RAW264.7 n=3)

2.2 MW-9對RAW264.7細胞炎癥因子產生的影響ELISA實驗結果表明(Fig 2),與刺激模型組比較,MW-9組TNF-α和IL-1β濃度明顯下降(P<0.01),MW-9(1.5、3 mg·L-1)還能明顯抑制IL-6的產生。提示查耳酮衍生物MW-9具有較好的抗炎活性。

Fig 2 Effects of MW-9 on TNF-α (A), IL-6 and IL-1β (B) levels in RAW264.7 cell culture n=3)

2.3 MW-9對UC小鼠體質量和結腸的影響Fig 3結果顯示,與正常對照組比較,模型組小鼠體質量下降明顯,結腸長度縮短、重量下降;MW-9干預后,延緩UC小鼠體質量下降和結腸縮短,差異均具有統計學意義。

Fig 3 Effects of MW-9 intervention on mice with ulcerative n=8)

2.4 MW-9對UC小鼠結腸病理損傷的影響HE染色結果顯示(Fig 4),與正常對照組比較,模型組小鼠結腸黏膜局部充血,腸壁增厚,細胞排列混亂,有多處潰瘍及壞死。與模型組比較,MW-9組小鼠結腸黏膜細胞排列較為整齊,腸壁增厚不明顯,仍有局部充血、部分潰瘍以及壞死,其中MW-9高劑量組效果最佳。組織學評分顯示,與模型組比較,給藥組小鼠結腸病理組織學評分明顯降低(P<0.01)。

Fig 4 Effect of MW-9 on histopathological changes in colon of mice with ulcerative n=8)

2.5 MW-9對UC小鼠炎癥因子產生的影響ELISA結果顯示(Fig 5),與正常對照組比較,模型組小鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平明顯升高;與模型組比較,MW-9低、高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1 和IL-6水平均不同程度降低。

Fig 5 Changes in levels of TNF-α, IL-1β (A) and IL-6 (B) in mice after MW-9 n=8)

2.6 MW-9對UC小鼠結腸MAPK信號分子表達的影響如Fig 6所示,與正常對照組比較,模型組結腸p38 MAPK和ERK1/2蛋白表達水平明顯增加;MW-9干預后明顯抑制MAPK信號中p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化水平,而對JNK蛋白磷酸化水平無明顯的作用。

Fig 6 Effect of MW-9 on MAPK signaling pathway in mice with ulcerative n=3)

3 討論

天然的查耳酮化合物廣泛分布在自然界的植物中,其母核結構為1,3-二苯基丙烯酮。查耳酮母核是一類非常重要的有機合成和藥物合成結構,具有較大的分子柔性,可以結合不同的受體,因此查耳酮衍生物種類結構眾多且各有特點[10]。哌嗪環是重要的醫藥中間體,在藥物分子中是被廣泛應用的雜環結構之一,具有高活性、低毒性的特點,哌嗪環上的N原子可以參與生物體中氫鍵的形成,增加藥物與受體的親和力和選擇性,使得該類化合物在新藥研究方面具有重要的作用[11]?；诖?我們創新性地將查耳酮和哌嗪環進行化學拼接,得到一系列的新型查爾酮衍生物。經抗炎活性的篩選,這類衍生物體外表現出良好的抗炎活性。在MW-9干預RAW264.7細胞炎癥模型后,其對細胞NO的產生具有明顯的抑制作用,并明顯抑制TNF-α的產生。此外,數據表明MW-9給藥后可以通過抑制致病性Th17細胞,減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎,且明顯抑制IL-17在CD4+T細胞中的表達和Th17細胞的體外分化[9]。然而,MW-9對UC的療效尚不明確。

炎癥是一個復雜的過程,當機體受到感染、損傷或刺激時,免疫細胞受到刺激后,細胞膜上的受體與相應配體結合,觸發核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、MAPK等信號轉導反應,最終導致炎癥因子的基因轉錄和表達增加。RAW264.7細胞在LPS和IFN-γ的聯合刺激下,產生大量促炎介質和炎癥因子,主要的促炎介質為NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等,這些細胞因子參與了炎癥相關疾病的發病過程[12]?；诖?抑制這些促炎細胞因子的過度分泌可能是對抗炎癥反應的重要手段。本研究利用LPS和IFN-γ聯合刺激RAW264.7細胞,構建體外細胞炎癥模型,查爾酮衍生物MW-9干預后可明顯下調RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平,提示MW-9在治療炎癥性疾病方面具有一定應用前景。

炎癥反應和氧化應激是UC進展和惡化的主要原因[13]。近年來研究發現,MAPK信號通路在UC發病進程中具有關鍵作用,是與腸道損傷相關的主要信號轉導途徑[14]。MAPK途徑的激活涉及JNK、ERK和p38的磷酸化,進一步激活細胞核中的轉錄因子。ERK、JNK和p38被認為是MAPK的主要激酶,它們可以被多種細胞因子、激素和蛋白質誘導。p38是介導UC的重要通路,可被多種細胞因子激活,如激素、IL-1β、TNF-α等[15]。p38可使TATA結合蛋白在下游NF-κB復合體中磷酸化,調控NF-κB的轉錄活性,進而調控炎癥反應[16]。ERK被激活后,可調控下游靶標NF-κB、Bcl-2等,從而影響炎癥反應和細胞凋亡[17]。JNK在炎癥、氧化應激和其他過程中起調節作用,其中IL-1β可以激活JNK并參與炎癥反應[18]。Western blot檢測結果顯示,MW-9干預明顯抑制MAPK信號通路中p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化水平,提示MW-9可能通過抑制MAPK信號通路治療UC,確切的作用機制需要進一步確證。該研究為將新型查爾酮衍生物MW-9開發成治療炎癥性疾病的藥物奠定了實驗基礎。