桃紅四物湯對大腦中動脈閉塞大鼠lncRNA表達的影響

張麗娟,費長義,余 超,薛蘇君,李雨朦,李靜靜,潘凌宇,段賢春,3,彭代銀

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥學部,安徽 合肥 230031;2.安徽中醫藥大學藥學院,3.中藥復方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

缺血性中風是一種突發的腦血液循環障礙疾病。缺血性中風后,信使RNA表達譜在血液或腦中發生變化,microRNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環狀RNA(circRNA)參與RNA介導的調控網絡[1],LncRNA為轉錄本長度大于200個核苷酸的長鏈非編碼RNA,已被證明是生長和疾病的關鍵基因調節因子[2]。LncRNA也可以與miRNA競爭性結合,被稱為“競爭性內源性RNA”(ceRNA)。研究表明,顯著差異表達的lncRNA(DEL)與缺血性中風的病理過程密切相關[3]。許多lncRNA已經通過平行測序技術進行了鑒定。然而,功能性RNA分子和RNA介導的調控網絡在中風中的具體作用機制尚不清楚。因此,通過研究lncRNAs與mRNAs之間的相互作用,我們可以更深入地了解缺血性中風的病理生理過程。桃紅四物湯(Tao Hong Si Wu decoction,THSWD)是一種傳統中藥(TCM)制劑,包含桃仁、當歸、紅花、地黃、芍藥和川芎六味草藥,可有效治療心肌損傷和產后血瘀等疾病[4]。課題組前期使用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)來鑒定THSWD的成分,從這項工作中,我們確定了5種主要活性成分：沒食子酸、原兒茶酸、羥基紅花黃A、苦杏仁苷和芍藥苷[5]。THSWD治療大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的機制在近幾年已經有了許多研究成果。例如,THSWD被證明可以通過調節腦細胞壞死和炎癥來治療腦缺血[6]。然而,THSWD治療后MCAO的lncRNA失調很少受到關注,我們旨在利用RNA測序揭示THSWD治療MCAO大鼠相關的lncRNA-mRNA網絡表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級Sprague-Dawley大鼠(200±20 g,7周)購自安徽醫科大學實驗動物中心,SCXK(安徽)2017-0004,所有動物實驗均經安徽中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(許可證號：LLSC20160336)。室溫25 ℃左右,60%±5%相對濕度,自然光暗周期和自由飲水條件下飼養1周,待其適應環境后進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器mirVanaTM miRNA Isolation kit(美國 Thermo Fisher Scientific,貨號：AM1561);TRIzol提取試劑(美國 Thermo Fisher Scientific,貨號：15596026);RNeasy試劑盒(德國 Qiagen,貨號：74104);RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(美國 Thermo Fisher Scientific,貨號：K1622)。

生物分析儀(美國 Agilent Technologies Inc);微量紫外分光光度計、熒光計、熒光定量PCR儀(美國 Thermo Fisher Scientific);Illumina Hiseq 2500(美國Illumina)。

1.3 主要數據庫與軟件Seqtk(https：//github.com/lh3/seqtk);Venny(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/);Cytoscape(https：//cytoscape.org/);GO(http：//geneontology.org/);KEGG(https：//www.genome.jp/kegg);Genome Browser(https：//genome.ucsc.edu/);PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/);AutoDockTools 1.5.7;Pymol 2.4。

1.4 方法

1.4.1動物實驗與分組 將大鼠隨機分為3組,每組10只：正常組,MCAO組和THSWD給藥組。經過一周的適應性飼養,建立MCAO模型[7]。在大鼠MCAO造模24 h后,使用ZeaLonga方法對神經功能進行評分,以確定造模是否成功。得分為1-3的大鼠被認為是成功的模型,并被納入實驗組進行后續實驗,模型組和對照組在沒有任何治療的情況下正常飼養。THSWD組灌胃THSWD煎劑,一天一次。灌胃7 d后,老鼠被安樂死。收集左半球并立即在液氮中冷凍。

1.4.2THSWD制備 THSWD購自安慶華仕中藥飲片有限公司(桃仁(批號 17033101)、紅花(批號 17041401)、熟地黃(批號 17042501)、白芍(批號 17050301)、當歸(批號 16070501)和川芎(批號 17061601)),根據所需的THSWD比例稱量所需的藥材,在10倍量水中浸泡0.5 h后煮沸2 h。然后,收集濾液,殘余物用8倍量的水煮沸2 h。將兩種濾液混合并通過旋轉蒸發濃縮至1.8 kg·L-1。

1.4.3RNA測序 使用TRIzol試劑從大腦梗死區域提取總RNA。然后,使用RNeasy試劑盒進行RNA純化和柱上DNase消化。分光光度計和生物分析儀進行序列質量分析,VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) Library Prep Kit for Illumina試劑盒構建文庫。純化的互補cDNA文庫通過熒光計和生物分析儀分析,然后根據制造商的說明,在 HiSeq 2500 平臺上進行簇生成和測序。由奧吉生物(中國上海)進行文庫構建和RNA測序,并使用計算機進行分析數據。

1.4.4DEL的注釋和篩選 原始數據由FastQC v0.11.3鑒定,并由seqtk進行修剪。使用Hisat2 v2.0.4將修剪后的讀數映射到大鼠基因組(Rn6)。應用Stringtie(version：1.3.0)對Hisat2比對后每個基因的Fragments數進行計數,然后用TMM(trimmed mean of M values)法進行歸一化,最后利用perl腳本計算出每個基因的FPKM值。根據lncRNA在基因組上與附近mRNA的位置關系,對lncRNA進行分類。應用Stringtie(version：1.3.0)對預測的novel lncRNA和NONCODE數據庫,以及Ensembl數據庫中的已知lncRNA進行表達定量。MCAO組和對照組之間差異表達的lncRNA被命名為mcDEL,由edgeR篩選(|log2(FC)|>1,P<0.05)。接下來,Venny用于識別上調mcDEL和上調mtDEL的交集DEL(上調iDEL,即THWSD逆轉MCAO異常上調lncRNA),下調mcDEL和下調mtDEL的交集DEL(下調iDEL,即THWSD逆轉MCAO異常下調lncRNA)。

1.4.5lncRNA-mRNA網絡構建 為了更進一步的了解lncRNA的功能,使用皮爾遜相關性計算了lncRNA和mRNA之間的相關性(|r|>0.95和P<0.000 1)。LncRNA-mRNA網絡由Cytoscape構建。在這個共表達網絡中,每個lncRNA或mRNA對應一個節點。通過clusterProfiler對lncRNA-mRNA網絡進行注釋,以識別與DEL相關的信號通路。Cytoscape中的MCODE插件用于識別lncRNA-mRNA網絡模塊。隨后,在Cytoscape中可視化得到兩個典型模塊的子網絡。此外,clusterProfiler還使用GO和KEGG數據庫分析了兩個典型模塊富集的生物功能和信號通路。

1.4.6iDEL的順反式調控分析 LncRNA可以通過順式調節附近的蛋白質編碼基因和反式調節遠端蛋白質編碼基因來調節其靶基因。因此,基于順式或反式作用算法預測lncRNA的潛在靶標。首先,使用Genome Browser來鑒定lncRNA的順式調控網絡,以lncRNA距離<10 kb的gene作為cis作用的靶基因。其次,分析lncRNA-mRNA的序列互補性和雙鏈能量,預測lncRNA的潛在反式作用靶基因。用BLASTN和RNAplex預測潛在的反式作用靶mRNA,相似性>95%、e<1e-50和RNAplex分析結合能<30。

1.4.7RT-qPCR 根據制造商(中國 賽默飛世爾科技公司)的說明,使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒對來自每個樣品的等量總RNA進行反向轉錄以生成cDNA。使用實時熒光定量PCR系統驗證NONRATT024616,NONRATT030683,NONRATT004058,NONRATT010334,NONRATT003292,NONRATT000 003,C1qb和Hemox的基因表達,使用2-ΔΔCT法計算基因表達量。甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA用作內部對照。RT-qPCR在含有cDNA(2.0 μL)、qPCR SYBR綠色預混液(10 μL)、每種引物0.4 μL和ddH2O(7.2 μL)的20 μL反應混合物中進行。PCR反應程序為：酶在50 ℃下活化2 min,在95 ℃下初始變性10 min,然后在95 ℃下進行40次循環,持續15 s,在60 ℃下持續1 min。從3個獨立樣品中測定相對基因表達,每個樣品一式3份測定。本實驗中使用的所有引物均列于Tab 1中。

Tab 1 Primer sequences

1.4.8分子對接實驗 活性化合物的2D結構從Pubchem官方網站下載。通過Chem3D 20.0軟件將二維結構轉化為三維結構,并對其進行優化。在PDB數據庫中下載靶蛋白的3D結構。將靶蛋白和化合物的三維結構導入AutoDockTools 1.5.7軟件,并對分子結構進行常規預處理。然后選擇AutoDockTool vina進行分子對接,并分析其結合活性。Pymol 2.4軟件用于可視化。

2 結果

2.1 lncRNA測序數據分析我們分析了在對照組、MCAO組和THSWD組中表達的lncRNA的特征,并且比較了這三組之間的差異和相似之處。從9個樣本中鑒定了24 637個lncRNA,其中22 772個相互lncRNA(Fig 1A)在三組中均有表達。接下來,我們分析了篩選的lncRNA在大鼠染色體上的分布,發現所有染色體均有表達。其中,lncRNA在九條染色體(chr1-8和chr10)表達>1 000個,其中表達lncRNA最多的是chr1(Fig 1B)。根據lncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置,lncRNA可分為五種類型,我們使用這些類別來分析已篩選的lncRNA。大多數是從蛋白質編碼外顯子轉錄而來的,而另一些從內含子和基因間區域轉錄(Fig 1C)。

Fig 1 Venn diagram(A),chromosome distribution(B) and class type(C) of lncRNAs identified in control,MCAO and THSWD groups

Fig 2 THSWD-reversed lncRNAs with MCAO

2.2 THSWD對lncRNA表達的影響314個下調mcDEL和332下調mtRNA進行交集分析獲得116個下調iDEL(THSWD逆轉MCAO下調lncRNA)(Fig 2)。此外,從563個上調mcDEL和339個上調mtRNA中篩選到了186個上調iDEL(Fig 2)。因此,THSWD可以逆轉MCAO中302個失調的lncRNA(116個下調iDEL和186個上調iDEL)。染色體分布分析表明,所有染色體都有下調的iDEL、上調iDEL和交集iDEL。我們確定了5條染色體(chr1、chr2、chr5、chr7、chr10),包含的iDEL>20個,其中chr1含有最多的iDEL(Fig 3A)。類別分析表明,大多數iDEL是從蛋白質編碼外顯子轉錄而來的,少數iDEL則來自內含子和基因間區域(Fig 3B)。這些結果與三組表達的lncRNA(2.1部分)特征相似。

Fig 3 Features of THSWD-reversed lncRNAsA： Chromosome distribution, B： Class type.

2.3 lncRNA-mRNA網絡的構建和模塊分析為了進一步了解在MCAO中被THSWD調節的iDEL,構建了lncRNA-mRNA網絡。使用GO和KEGG數據庫進行富集分析。通過Cytoscape,基于相關系數(|r|>0.95)和P值(P<0.001)構建了lncRNA-mRNA共表達網絡。根據度值,前5名lncRNA分別為MSTRG.21354.5、NONRATT016046.2、NONRATT 016429.2、NONRATT003285.2和NONRATT004 058.2。根據度值,前6名的編碼蛋白mRNA分別為RGD1311343、LOC684828、Cnn2、Hist3h3、A3galt2和Cd93。GO分析和KEGG分析展示了前30個富集結果(Fig 4A,4B)。GO分析表明,這些DEL與“有絲分裂細胞周期”、“有絲分裂”、“染色體分離”、“細胞分裂”和“細胞周期”有關。KEGG分析表明,涉及的信號通路是“ECM-受體相互作用”、“細胞周期”、“補體和凝血級聯”等。通過MCODE插件分析,確定了10個模塊。前3個模塊按降序排列,MCODE得分≥1.5,節點≥10的分別被視為模塊1,模塊2和模塊3。隨后,選擇包含大于10個蛋白質編碼基因的模塊1和模塊3進行網絡可視化。分別對模塊1(Fig 5B,5C)和模塊3(Fig 6B,6C)進行了生物功能富集分析和信號通路富集分析。屬于這些模塊的大多數iDEL在模塊1和模塊3的MCAO組中上調。在模塊1中,有12個lncRNA(NONRATT030953.2,NONRATT030261.2,NONRATT026655.2,NONRATT023599.2,NONRATT017195.2,NONRATT 015182.2,NONRATT009960.2,NONRATT007019.2,NONRATT005984.2,NONRATT003292.2和NONRATT000003.2)。這些lncRNA參與“造血細胞譜系”、“百日咳”、“ECM-受體相互作用”、“系統性紅斑狼瘡”、“補體和凝血級聯”(Fig 5)。我們還在模塊3中確定了NONRATT030262.2,NONRATT 008267.2和NONRATT010334.2,信號通路分析顯示這三種lncRNA與“ECM-受體相互作用”、“局灶黏附”、“補體和凝血級聯”有關(Fig 6)。

Fig 4 Top-30 significantly enriched terms using GO database (A) and KEGG database (B) with lncRNA-mRNA network

Fig 5 Module 1 subnet (A), GO (B) and KEGG (C) of lncRNA-mRNA networkCircular nodes denote mRNAs, and Vee nodes denote lncRNAs.

Fig 6 Module 3 subnet (A), GO (B) and KEGG (C) of lncRNA-mRNA networkCircular nodes denote mRNAs, and Vee nodes denote lncRNAs.

2.4 iDEL的順反式調控基因我們在MCAO中鑒定了250個iDEL的225個順式調節基因(153個上調iDEL和97個下調iDEL),這些基因由THSWD調節。此外,這225個順式調節基因中有32個具有差異表達,其中38個iDEL與這32個差異表達順式調控基因呈正相關。同時,我們發現3個iDEL和2個差異表達順式調節基因之間存在負相關。此外,經BLASTN和RNAplex篩選了592個反式調控基因和20個iDEL組成的基因對1 606對,其中5個反式調控基因具有差異性,我們進一步篩選出了由6個iDEL和5個反式調控基因組成的15個基因對,它們之間呈現負相關關系。

2.5 通過qRT-PCR驗證DEL的表達為了進一步驗證RNA測序數據,選擇了8個iDEL(NONRAT T000003.2,NONRATT003292.2,NONRATT01033 4.2,NONRATT004058.2,NONRATT030683.2,NONRATT024616.2,C1qb和Hemox)進行RT-qPCR。與正常組相比,MCAO組NONRATT000003.2、NONRATT003292.2、NONRATT010334.2、NONRATT004058.2、C1qb和Hemox的表達明顯上調(Fig 7B),而NONRATT030683.2和NONRATT0246 16.2的表達明顯下調(Fig 7A),這與RNA測序數據一致(Fig 7C)。

Fig 7 Gene expressions of six specified lncRNAs confirmed by RT-qPCR

2.6 分子對接本研究通過構建lncRNA-mRNA網絡和富集分析,獲得了關鍵mRNA靶點和關鍵通路,選擇Cnn2、A3galt2、C3ar1、Lgals3和CD93與活性化合物沒食子酸(gallic acid)和苦杏仁苷(amygdalin)進行分子對接實驗驗證。此外,COX-2被認為在大腦穩態中起作用,因此我們也對該mRNA所指導表達的蛋白質進行了分子對接實驗。對接結合能(Tab 2)顯示,所有結合能均<-5 kcal·mol-1,表明蛋白質與化合物之間存在良好的結合。分子對接的可視化結果如Fig 8所示。

Tab 2 Molecular docking binding energy

Fig 8 Compound target molecular docking

3 討論

許多參與缺血性中風的lncRNA已經通過微陣列技術或RNA測序技術闡明[8]。Huang等[9]發現lncRNA MALAT1通過作用于HSP90促進腦缺血/再灌注小鼠神經元壞死性凋亡。

在本研究中,THSWD可以調節MCAO中302個失調的lncRNA(116個下調表達和186個上調表達),通過構建lncRNA-mRNA網絡、鑒定模塊和分析富集信號通路,我們發現補體和凝血級聯反應被富集(在腦缺血后被激活)。我們發現一些lncRNA(例如,NONRATT030262.2、NONRATT010334.2、NONRATT008267.2)可能參與THSWD治療后的補體和凝血級聯反應。一些研究表明,補體和凝血級聯的補體C3(Complement 3,C3)和補體C5(Complement 5,C5)成分可通過補體和凝血級聯反應和TLR4/NF-κB通路來加速MCAO損傷[10-11]。此外,THSWD抑制了C3ar1、C1qb、C1qc和C5ar1的表達,這與我們的其他研究結果一致[12]。C3ar1、C1qb、C1qc和C5ar1蛋白在腦缺血的發生和發展中起重要作用[13]。因此,我們推測THSWD給藥可以通過抑制補體和凝血級聯來逆轉MCAO損傷。此外,生物信息學分析表明,3種lncRNA可能分別受Lgals3、Hjurp和Kif14調控。作為與小膠質細胞和巨噬細胞相關的炎癥介質,Lgals3可能影響缺血性中風疾病發生發展[14]。

我們對部分基因進行了RT-qPCR實驗驗證,發現實驗結果與測序數據結果吻合。另外,本研究發現,Cnn2、A3galt2、C3ar1、Lgals3、CD93和COX-2與沒食子酸和苦杏仁苷穩定結合,這也證實了THSWD可能通過lncRNA-mRNA網絡和富集分析通路對MCAO大鼠發揮治療作用。

綜上,THSWD可以影響MCAO大鼠的lncRNA表達。一些核心lncRNA可能在THSWD保護MCAO損傷過程中發揮重要作用。THSWD可能通過調節補體和凝血級聯反應以及各種信號通路參與缺血性中風的治療。為缺血性中風的分子機制研究提供了新的見解,但是,本研究對lncRNA在細胞中的具體機制研究還有一定的欠缺,因此,我們后續將繼續使用THSWD作為治療方法來研究lncRNA在不同細胞類型中的功能,深入研究這些與MCAO密切相關且受THSWD顯著調控的lncRNA的作用機制。