基于實時無標記細胞分析技術時間維度特征的體外抗腫瘤活性評價新策略

劉芳彤,邢淑雁,劉孝云,葉冬雪,楊 佳,張國英,容 蓉,4,楊 勇

(山東中醫藥大學 1.中醫藥創新研究院、2.藥學院、3.實驗中心,4.中醫藥經典理論教育部重點實驗室,5.中醫藥基礎研究山東省重點實驗室,6.山東省中醫藥抗病毒工程研究中心,山東 濟南 250355)

肺癌在全世界范圍內的發病率和死亡率均居癌癥之首,據美國癌癥協會統計數據顯示,2022年全球范圍內肺癌新發病例數和死亡數占全部腫瘤的12.5%和21%,肺癌致死數約占所有腫瘤致死數的1/5[1]。2022年2月國家癌癥中心發布了我國最新的癌癥統計數據,肺癌占我國每年新發癌癥的20.4%,每年癌癥死亡的27.2%,肺癌致死數約占比所有腫瘤死亡數的28%,均高于世界平均水平,該腫瘤也是我國發病率和死亡率最高的癌癥[2]。根據組織病理學分類可將其分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)及小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),NSCLC約占85%。NSCLC又分為腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌3大亞型。其中,以肺腺癌最常見,在NSCLC中所占比例最高,且多數患者確診已為中晚期[3]。

化療是目前抗腫瘤治療的常用方式,篩選合適的抗腫瘤化合物是抗腫瘤藥物研究的重要領域,不同腫瘤細胞生物學特征不同,對藥物敏感性也存在巨大個體化差異,通過藥物篩選技術評估腫瘤細胞的敏感性和耐受性,可以確定藥物的合適劑量和治療時間[4]。以MTT、CCK-8為代表的終點法體外篩選仍然是抗腫瘤藥物發現的主要手段?；衔锱c腫瘤細胞的相互作用是動態變化過程,然而目前常用的終點法大都是選擇24 h、48 h等固定時間點檢測其EC50值[5-6],這種方法存在較大的主觀性或刻板性,無法全面準確反映EC50動態變化過程,無法對給藥時機提供參考。實時無標記細胞分析(real time cellular analysis,RTCA)技術是基于貼壁生長在微電極表面的細胞狀態改變引起貼壁電極界面阻抗改變的一種方法,具有非侵入性連續實時監測的特征,可以記錄完整的細胞生長曲線及藥物干預過程[7]。由于天然植物化合物庫是抗腫瘤藥物篩選的重要來源,有研究報道黃芩苷、黃芪甲苷及橙皮苷對于肺癌均具有較強的抗腫瘤作用[8-10]。因此,本實驗基于RTCA技術,以黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷和一線的抗腫瘤藥物順鉑為例進行體外抗A549、H1299肺腺癌細胞活性分析,旨在建立一種反映時間維度變化特征的EC50評價新策略。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑黃芩苷(Z28S11X125952,上海源葉生物科技有限公司),黃芪甲苷(J04M8T30363,上海源葉生物科技有限公司),橙皮苷(K09S11L123847,上海源葉生物科技有限公司),順鉑(101436,MCE),胎牛血清(2022057,Vivacell公司),雙抗(2321127,美國Gibco公司),DMEM培養液(8120441,美國Gibco公司),1640培養液(8120207,美國Gibco公司),二甲基亞砜(D8371,北京Solarbio公司),1×PBS緩沖液(71012000,美國Biosharp公司),0.25 %胰蛋白酶消化液(2186956,美國Gibco公司)。

1.2 儀器多功能RTCA儀(艾森生物有限公司);二氧化碳培養箱(力康生物醫療科技控股有限公司);生物安全柜(力康生物醫療科技控股有限公司);細胞計數儀(BIO-RAD公司);倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS);十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司);渦旋儀(寧波拓普森)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養

1.3.1.1 細胞系及細胞培養液 A549細胞株(由山東大學藥學院免疫研究所張建教授課題組惠贈);H1299細胞株(武漢普諾賽生命科技有限公司)。A549細胞的生長培養基：含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+1%青霉素-鏈霉素混合液(penicillin-streptomycin,P/S)的DMEM完全培養基,H1299細胞的生長培養基：含10%胎牛血清FBS+1% P/S的1640完全培養基。A549細胞的維持培養基：含2%胎牛血清FBS+1% P/S的DMEM完全培養基。H1299細胞的維持培養基：含2%胎牛血清 FBS+1% P/S的1640完全培養基。

1.3.1.2 細胞復蘇及培養 從液氮罐中取出A549和H1299細胞凍存管,迅速放入恒溫水浴鍋37℃溫水中,用鑷子夾住輕輕搖動使其快速解凍融化,將細胞凍存管表面噴灑75%醫用酒精,移入生物安全柜中,吸取細胞懸液至2 mL離心管中,以1 200 r·min-1離心3 min,棄上清,用含10% FBS和1% P/S的DMEM完全培養基重懸A549細胞,用含10% FBS和1% P/S的1640完全培養基重懸H1299細胞,將重懸后的細胞懸液移至培養皿中,在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養,待細胞融合率達80%以上時進行細胞傳代用于后續實驗。

1.3.2選擇最佳細胞接種密度 取對數生長期A549、H1299細胞,將細胞用胰酶消化后,懸浮于細胞培養液中,吹打成單細胞懸液。16孔電極板(E-plate 16)每孔中加入100 μL細胞培養液,放入37℃、5% CO2恒溫培養箱中的電極槽(RTCA Station)上檢測基線?；€檢測完畢,取出E-Plate 16,每孔加入100 μL不同濃度(2.5×103、5×103、1×104和2×104個/孔)細胞懸液,設4個重復孔。于超凈臺中室溫靜置30 min后,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中的RTCA Station繼續監測。每15 min記錄一次細胞指數(cell index,CI),連續監測48 h,觀測并記錄細胞生長曲線,選擇最佳接種密度。

1.3.3RTCA實時監測天然產物和順鉑的抗腫瘤活性 取對數生長期A549細胞,將細胞用胰酶消化后,懸浮于細胞培養液中,吹打成單細胞懸液。將A549細胞懸液(1×104個/孔)接種于E-plate 16,每孔100 μL,置37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中的RTCA Station上孵育。待細胞長至80%融合度(約24 h),暫停RTCA,取出E-plate 16,吸棄E-plate 16中剩余培養液,以順鉑為陽性對照藥,加入用細胞維持培養基稀釋得到的一系列濃度的順鉑及中藥活性成分藥液,每個濃度設2個復孔,每孔加100 μL藥液,同時設置細胞對照組,將E-plate 16放入RTCA Station中,RTCA繼續監測細胞狀態,每隔15 min記錄一次阻抗,繼續連續監測48 h。H1299細胞同上。

1.3.4數據分析 將得到的細胞完整生長曲線用RTCA Software Pro進行分析,并借助GraphPad Prism、Origin Pro軟件做圖。

2 結果

2.1 細胞最佳接種密度不同接種密度的A549細胞增殖曲線如Fig 1A所示。A549細胞接種密度為2.5×103個/孔時,CI值在觀察時間內未發生明顯變化,CI值略有上升;接種密度為5×103細胞/孔時,CI值48 h內緩慢增長,CI值相對較低,細胞密度小導致平臺期時間較長;接種密度為1×104細胞/孔時,CI值在24 h內呈對數生長趨勢持續增長,約24 h細胞達到80%融合度,約44 h后進入平臺期;接種密度為2×104細胞/孔時,10 h內細胞呈對數增殖趨勢,10 h后CI值增長緩慢且28 h后有下降趨勢,推測因為細胞密度大致使培養基消耗快,細胞因缺乏營養而出現死亡。綜上分析,1×104細胞/孔為A549細胞最佳接種密度。

H1299細胞接種密度為5×103細胞/孔時,CI值0～29 h增長緩慢,29～48 h細胞呈對數增長趨勢;接種密度為1×104細胞/孔時,在第24 h達到短暫平臺期,繼續生長至35 h達到平臺期;接種密度為2×104細胞/孔時,20 h內細胞呈對數增殖趨勢,20 h后CI值增長緩慢且35 h后有下降趨勢(Fig 1B)。綜上分析,1×104細胞/孔為H1299細胞最佳接種密度。

Fig 1 The growth curve of A549 cells and H1299 cells at different seeding densities

2.2 不同天然產物及順鉑抗腫瘤活性檢測RTCA實時監測不同天然產物及順鉑干預后的細胞生長曲線見Fig 2。黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對A549細胞與H1299細胞的抗腫瘤活性均出現濃度依賴性的抑制作用,隨著藥物濃度的升高,細胞增殖曲線CI值降低,表現出更強的抑制細胞增殖的作用。

2.3 數據分析采用RTCA Software Pro 2.6.0對每個檢測時間點的EC50計算,EC50計算公式為 Sigmoidal dose-response (variable slope)：Y=Bottom+(Top-Bottom))/(1+10^[(logEC50-X)×Hill Slope])。在“Y Axis”中選擇“%Control”即給藥孔相對于正常對照孔CI值的百分率,可消除細胞本身的影響。點擊“Normalization Time”選擇加樣的時間點,可抵消加樣前細胞生長的差異。黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對A549、H1299細胞24 h、48 h單個時間點的EC50值如Tab 1所示。

Tab 1 EC50 of natural products and cisplatin on A549 and H1299 cells by endpoint method

將加樣點作為0 h點,用GraphPad Prism 8.4.2做圖,見Fig 3。Fig 3顯示受試液/藥對細胞的EC50在不同時間點存在波動。如順鉑作用于A549細胞,在藥物干預后0～24 h,EC50波動較大。另外,當EC50相對穩定時,需對其相關系數R2進行考察。橙皮苷對A549細胞的EC50在21.5～48 h內相對穩定,但其在29.75～48 h時間段內的R2<0.9,因此這個時間段內的EC50值并不準確。將相鄰4個點的EC50進行線性擬合,以斜率為縱坐標,時間點為橫坐標作圖,如Fig 4所示。以相鄰4個點的EC50線性擬合后|斜率|≤1、R2>9為標準,選擇連續時間段,計算這一時間區間內每個檢測時間點EC50的平均值作為其EC50,表示為Mean±SD。黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑作用于A549細胞,分別在16～48 h、32.25～48 h、21.5～29.75 h及27.5～48 h時間區間內EC50相對穩定且R2>0.9,黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑作用于H1299細胞,分別在19.5～48 h、14～48 h、12.75～46.25 h及10.25～48 h時間區間內EC50相對穩定且R2>0.9,選擇相應區間EC50平均值作為其EC50。黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對A549細胞、H1299細胞帶有時間維度特征的EC50值如Tab 2所示。

Fig 3 Fitted curve of EC50 values of A549 and H1299 cells treated with different natural products and cisplatin

Fig 4 A549 and H1299 slope of EC50 linear fit for adjacent 4 detection points

Tab 2 EC50 of natural products and cisplatin on A549 and H1299 cells characterized by time dimension

3 討論

RTCA技術是將微電子生物感應芯片整合在細胞培養板的孔中,通過活細胞與檢測板孔中微電極相互作用,電阻抗發生改變,系統將這些信號轉化為特定的參數-細胞指數來衡量細胞的狀態[11]。該技術通過實時無標記連續監測提供細胞對不同刺激響應的動力學數據,如藥物的細胞毒性[12]、病毒感染引起的宿主細胞數量、大小、附著強度和細胞間黏附力(即屏障功能)的變化等[13],具有操作簡單,靈敏度高和重復性好等特點。

A549、H1299細胞是人NSCLC研究最常用的上皮類型細胞株,在NSCLC研究中具有一定的代表性。順鉑等鉑類抗癌藥物通過損傷DNA誘導細胞發生凋亡,是臨床上治療各種惡性腫瘤的主要化療藥物。有研究報道,黃芩苷通過抑制Akt/mTOR通路,體外抑制A549和H1299細胞的活力、侵襲和轉移,誘導肺癌細胞凋亡和細胞周期阻滯[14]。黃芪甲苷通過調控PKC-α-ERK1/2-NF-κB通路,抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。橙皮苷通過調節線粒體通路相關蛋白及細胞周期相關蛋白水平,抑制A549細胞增殖和誘導細胞凋亡[16]。本實驗以A549細胞和H1299細胞作為細胞模型,以天然植物化合物黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷和一線抗腫瘤藥物順鉑為例,采用RTCA技術監測其抑制腫瘤細胞增殖的情況,細胞生長曲線(Fig 2)顯示黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對A549細胞與H1299細胞的抗腫瘤活性均出現濃度依賴性的抑制作用。

在進行體外抗腫瘤藥效評價時EC50是一個重要指標,目前研究多采用MTT、CCK-8等終點法計算供試品EC50值。胡翔東等[17]在用不同濃度順鉑處理腫瘤細胞24 h后,MTT法測定細胞活力并計算EC50,順鉑對A549和H1299細胞的EC50分別為52.84 mg·L-1和15.53 mg·L-1;鄭海峰等[18]研究黃芩苷對A549細胞凋亡的影響,測定黃芩苷對A549細胞24、48、72 h的EC50值分別為7.38、5.04、3.94 mg·L-1。我們應用RTCA Software Pro 2.6.0計算黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷及順鉑對A549、H1299細胞24 h、48 h固定時間點的EC50值如Tab 1所示,不同時間點的EC50值存在一定差異。將RTCA實時連續監測的48 h中若干個時間點作圖分析,發現某些受試液/藥對腫瘤細胞的EC50在不同時間點存在較大波動(如Fig 3順鉑干預A549細胞),提示終點法檢測24 h、48 h等某個固定時間點的EC50存在一定主觀性或刻板性,無法準確全面反映EC50動態變化過程。另外,當EC50相對穩定時,有些受試液/藥對腫瘤細胞的EC50的曲線擬合相關系數隨時間延長而降低(如橙皮苷干預A549細胞),提示計算的EC50可靠性降低。因此,本實驗中選用受試藥/液對腫瘤細胞的EC50值相對穩定(相鄰4點EC50線性擬合后|斜率|≤1)且曲線擬合相關系數>0.9時,計算此時間段內EC50的平均值作為具有時間維度特征的EC50(Mean±SD)。如Fig 5所示,在對應時間維度內,順鉑對A549細胞及H1299細胞的EC50值最小,其它提取物對A549細胞的EC50從小到大依次為黃芩苷、黃芪甲苷、橙皮苷;對H1299細胞的EC50從小到大依次為橙皮苷、黃芩苷、黃芪甲苷。不同腫瘤細胞對藥物的敏感性存在差異,此方法若應用于來源于患者的腫瘤細胞,可更加直觀的觀察腫瘤細胞對藥物的耐受性和敏感性,為腫瘤患者的個性化治療提供參考。順鉑、黃芩苷和黃芪甲苷抗A549細胞的時間窗口偏后(起效在30 h左右以后),橙皮苷抗A549細胞時間窗口偏前(起效在30 h之前);這些受試液/藥對H1299細胞作用時間窗口差別不大。這些數據顯示不同的受試品抗腫瘤有效的時間段是不一樣的,提示這種不同有效時間的抗腫瘤藥物可能為臨床兩藥聯合或多藥聯合的給藥時機提供參考。

Fig 5 EC50 of natural products and cisplatin on A549 and H1299 cells characterized by time dimension

綜上所述,進行體外抗腫瘤藥效評價時,基于RTCA技術采用曲線擬合相關系數>0.9、EC50動態變化相對穩定期策略計算反映一定時間窗口期內帶有時間維度特征的EC50數據用于抗腫瘤活性研究將更加全面、準確和合理。本研究思路在其他相關的體外實驗活性評估中可以借鑒和參考。