NFATc1在骨質疏松癥中的研究進展

黨祎 姚紅林 袁能華 馬亞萍 張怡 王信*

1.遵義醫科大學附屬醫院骨科,貴州 遵義 563003

2.遵義醫科大學附屬醫院手術室,貴州 遵義 563003

3.遵義醫科大學公共衛生學院,貴州 遵義 563000

骨質疏松癥的發生是骨重塑過程不平衡所致,主要是由于破骨細胞對骨的重吸收超過了成骨細胞介導的骨形成[1]。作為破骨細胞分化和破骨細胞基因表達的主要調控因子之一,抑制活化T細胞胞質核因子1(nuclear factor of activated T cell cytoplasmic 1,NFATc1)的表達和易位及其活性可減少破骨細胞的形成和骨吸收,從而保證骨穩態平衡并減少骨疾病的發生[2]。本文擬綜述NFATc1影響破骨細胞的生成與分化,及NFATc1與骨修復材料的研究進展,希望能對調控NFATc1靶點治療骨質疏松癥的基礎、臨床及骨組織工程應用提供幫助。

1 骨質疏松癥

骨量減少和骨組織微結構異常是骨質疏松癥的顯著特征,這一普遍存在的全身性骨病導致骨脆性增強,進而導致骨折風險增加[3]。目前認為,骨質疏松癥的重要機制之一在于破骨細胞介導的骨吸收作用超過了成骨細胞介導的骨形成作用,從而導致了骨平衡的破壞[4],見圖1。因此,為了達到理想的骨質疏松治療效果,需要通過一系列復雜而緊密的調控過程來維持破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨基質形成之間適當的平衡狀態[5],從而有效降低骨疾病的發生率。

圖1 骨質疏松癥的發病機制Fig.1 Diagram of the pathogenesis of osteoporosis

2 NFATc1

作為活化T細胞核因子家族(nuclear factor of activated T cell,NFAT)的重要一員,活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T cell cytoplasmic 1,NFATc1)早在20世紀80年代首次被Shaw等[6]在激活的T細胞中發現。NFATc1常駐于T細胞胞質中,其表達受鈣調磷酸酶的調控:T細胞受體與抗原的連接觸發了受體相關的酪氨酸激酶的激活,從而導致了磷脂酶C-γ(Phospholipase C,PLC-γ)的激活。激活的PLC-γ導致磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的水解,從而產生肌醇-1,4,5-三磷酸(inositol1,4,5-trisphosphate,IP3)和二?；视?diacylglycerol,DAG)。IP3與其受體結合,并向細胞質釋放Ca2+離子。鈣調蛋白(calmodulin,CaM)捕獲游離Ca2+離子并激活磷酸酶鈣調磷酸酶,促使NFATc1中的絲氨酸殘基去磷酸化,從而激活NFATc1并進行擴增,同時將其易位到細胞核中,進而激活靶基因的轉錄[7-8]。NFATc1不僅在免疫系統、心臟瓣膜和間隔的形成及動脈粥樣硬化中不可或缺,還對于破骨細胞的調節分化至關重要[9]。已有研究證實[10],通過驅動NFATc1的轉錄控制破骨細胞分化能夠調節骨穩態。這一發現不僅揭示了NFATc1調控破骨細胞分化和骨吸收的機制為進一步探索NFATc1對破骨細胞的調節作用尤為必要。

2.1 NFATc1通過相關信號通路介導破骨吸收

破骨細胞源于巨噬細胞/單核細胞系來源的前體細胞,在巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和核因子-κB受體激活劑配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)的刺激下分化而成,其具備骨吸收功能從而影響骨重塑平衡狀態。在破骨細胞生成早期,RANK被觸發激活且IP3誘導Ca2+內流,隨后激活NFATc1從而促進多種破骨基因如抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)及組織蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)等的表達[11-12]。因此,NFATc1在調節破骨細胞相關基因方面發揮著重要的調控作用。Zhang等[13]研究發現轉錄因子Bhlhe40的缺乏不僅導致體內骨量增加和破骨細胞分化減少,還能夠減輕骨質疏松癥的發展,而這一過程的發生正是通過直接結合NFATc1和c-Fos的啟動子區域并調控其表達所致。另有研究指出,NFATc1缺陷小鼠由于破骨細胞生成受損從而導致發生骨質疏松[14]。這些研究結果表明,NFATc1是破骨細胞分化的重要調控因子。作為破骨分化的重要特異性調節器,NFATc1已被證實常參與RANKL、NF-κB、MAPK及Ca2+等信號通路調控骨吸收過程[15-17],相關信號通路調節過程將在以下進行具體闡述,見圖2。

圖2 NFATc1參與RANKL、NF-κB、MAPK及Ca2+等多種信號通路介導骨吸收過程的作用機制Fig.2 Mechanism of action of NFATc1 involved in various signaling pathways such as RANKL, NF-κB, MAPK, and Ca2+ to mediate the process of bone resorption

2.1.1RANK-RANKL信號通路:RANKL是一種Ⅱ型跨膜蛋白,其羧基末端具有胞外結構領域。這類細胞外域被基質金屬蛋白酶等酶類切割,隨后以可溶性形式釋放RANKL至細胞外環境中[18]。在早期階段,RANKL通過與巨噬細胞表面表達的RANK受體結合的一系列中間信號,直接引發破骨細胞從破骨前體細胞向破骨細胞分化[19]。作為破骨細胞中RANK-RANKL信號通路的下游轉錄因子,NFATc1在調控破骨細胞分化方面扮演著至關重要的角色[20]。具體來講,RANKL與受體RANK的結合導致銜接蛋白的募集如腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6),其參與激活下游信號級聯反應,如NF-κB、c-Jun、c-Fos和激活蛋白1(activator protein,AP-1)[20],最后誘導以NFATc1為主的轉錄因子的激活與表達,并促進其去磷酸化和核轉位,從而誘導產生破骨分化所必需的基因如TRAP、降鈣素受體和CTSK[21],這對于破骨細胞的生成至關重要。Lee等[22]研究發現,通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶拮抗RANK-RANKL信號通路能夠降低細胞核中NFATc1蛋白的表達水平,從而抑制破骨基因如TRAP、CTSK等的表達,進而阻止破骨細胞分化和骨吸收。這也證實了RANK-RANKL作為上游介導的以NFATc1為靶點的信號通路對破骨形成的影響。此外,RANKL還能夠刺激免疫球蛋白樣受體如骨髓細胞上表達的觸發受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM-2)、信號調節蛋白β-1(signal-regulatory protein β-1,SIRP-β1)、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素15(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 15,Siglec-15)、破骨細胞相關受體(osteoclast-associated receptor,OSCAR)、配對免疫球蛋白樣受體A(paired immunoglobulin-like receptor A,PIR-A)和FcγR Ⅲ,這些受體與DNAX-活化蛋白(DNAX-activating protein of 12 kDa,DAP12)和Fc受體γ鏈(Fc receptor γ-chain,FcRγ)結合介導免疫酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)信號傳導。ITAM磷酸化導致脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)的募集,進而激活B-細胞連接蛋白(B cell linker,BLNK)和含SH2結構域的76 kDa的白細胞蛋白(SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kDa,SLP76)等銜接蛋白,這些銜接蛋白作為支架募集布魯頓酪氨酸激酶/酪氨酸蛋白激酶(bruton tyrosine kinase/tyrosine-protein kinase Tec,Btk/Tec)和PLC-γ,形成破骨細胞信號復合物。該復合物有效激活鈣信號,這些信號級聯最終導致NFATc1的誘導和激活[23],見圖3。綜上,NFATc1的生成受到RANK-RANKL信號通路的精準調控,從而對破骨細胞的形成產生了顯著影響。

圖3 RANKL信號通路在破骨細胞發生中的作用Fig.3 The role of RANKL signaling pathway in osteoclastogenesis

2.1.2NF-κB信號通路:NF-κB作為RANK-RANKL活化的一條主要下游信號通路,在破骨細胞的發生中發揮的作用不可或缺[24]。在典型NF-κB信號途徑中,RANKL和RANK的結合可進一步誘導核因子κB抑制因子α(inhibitory Subunit Of NF Kappa B Alpha,IκB-α)降解和p65亞基磷酸化,p65轉運到細胞核中啟動破骨細胞相關基因和蛋白包括TRAP、c-Fos、CTSK和基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達[25]。不僅如此,NF-κB的p50和p65亞基響應RANKL,通過與NFATc1啟動子區結合誘導NFATc1表達[26]。已有研究發現,NF-κB抑制劑是通過降低NFATc1對RANKL信號通路的抑制作用來誘導破骨細胞的產生[27]。而Liu等[24]的研究也發現麻黃素具有破壞破骨細胞分化和吸收功能,而這一機制主要是通過減弱RANKL刺激的NF-κB信號通路和NFATc1活性來降低破骨基因和蛋白的表達來實現的。由此證明了NF-κB在RANKL-RANK信號誘導NFATc1的激活中的上下游調節關系及其在破骨分化中的調節作用。

2.1.3MAPK信號通路:破骨細胞分化受細胞因子RANKL和M-CSF調控。在破骨細胞分化和骨吸收過程中,M-CSF和RANKL均通過MAPK信號傳導發揮作用。M-CSF與其受體的結合導致MAPK和Akt的激活,從而促進破骨細胞的存活[28]。RANKL則與RANK受體結合可募集TRAF6,從而啟動下游信號通路MAPK,并激活其下游NFATc1的轉錄進而調控破骨分化[29]。因此,MAPK信號通路在破骨細胞分化過程的重要性不言而喻。MAPK是一種包含細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-JunN 端激酶(c-Jun N terminal kinase,JNKs)和p38的復合物,它對基因誘導、細胞增殖和存活、細胞凋亡和分化、細胞應激和炎癥反應等多種生物學結果產生重要影響,同時也是正常破骨細胞分化和激活的關鍵[30]。RANKL通過刺激下游信號MAPKs(ERK、JNK、p38)磷酸化激活,從而誘導了破骨細胞分化相關因子NFATc1的自我擴增;然后,NFATc1易位到細胞核,促進破骨細胞相關的TRAP、MMP9、CTSK、DC-STAMP和OSCAR基因的表達[15]。這一機制已在Xu等[31]的研究中得以證實,他們通過使用寡聚糖減弱RANKL介導的MAPK通路,發現NFATc1的表達降低,從而影響破骨細胞分化。ERK活化是成熟破骨細胞存活的關鍵[32]。Ras作為ERKs的上游激活蛋白,通過高親和力和Raf-1 N-端結合,將Raf從胞漿轉移到胞膜上,從而激活Raf在胞膜上的作用,進而誘導MAPK/ERK激酶MEK1和MEK2,從而控制ERK1和ERK2的激活;并導致多種下游效應物如c-Fos和NFATc1磷酸化[33]。NFATc1作為破骨細胞生成的重要轉錄因子,在ERK信號的調節下對破骨細胞的融合和骨吸收進行調控[34]。同樣,JNKs也參與了破骨細胞的形成,由JNKs控制的AP-1和相關基因(c-Jun、JunB、c-Fos)對于破骨細胞的分化和成熟也是至關重要的[35]。RANKL誘導JNK活化,從而調節轉錄因子c-Jun的磷酸化,進而與c-Fos形成復合物,成為破骨細胞生成的關鍵轉錄因子;JNK信號也上調鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶、c-Fos和NFATc1,因而促進形成破骨細胞[33]。Chang等[36]研究表明,炎癥環境中的IL-16增強了JNK的磷酸化,進而激活下游分子NFATc1和TRAP,最終導致單核細胞分化為破骨細胞并導致小鼠骨質流失。這一研究表明,和ERK一樣,JNK也通過影響NFATc1的轉錄影響骨平衡。此外,作為MAPK家族的一員,P38經RANKL介導從而激活下游c-Fos、NFATc 1等破骨細胞分化相關因子影響破骨分化[37]。已有研究者使用高姜素抑制了p38以及下游因子NFATc1、c-Jun和c-Fos的磷酸化可抑制破骨細胞的發生,從而有效地抑制骨質疏松癥的發生和進展[38]。綜上所述,作為影響破骨的重要下游信號通路之一,MAPK通路通過調節NFATc1影響破骨細胞的形成,而這一機制也將成為未來治療骨質疏松癥的重要靶點。

2.1.4Ca2+信號通路:除上述信號通路外,RANKL與RANK之間的相互作用還可以激活Ca2+通路影響破骨細胞[39],這對于破骨細胞增殖、分化、基因轉錄和骨吸收等多種功能至關重要[40]。前面章節已闡明在破骨細胞形成的早期階段,RANK和RANKL的聯合作用引發了TRAF6的激活并刺激PLCγ產生IP3,從而引起內質網Ca2+釋放。細胞內驟升的Ca2+使通過CaM激活鈣調磷酸酶后使NFAT調節結構域的絲氨酸殘基去磷酸化,改變NFAT蛋白的構象,暴露出核定位序列,從而促進其從細胞質轉移到細胞核,并在細胞核中作為轉錄因子進一步誘導和激活NFATc1[41],同時增加破骨細胞特異性基因(如TRAP、CTSK等)的表達,刺激破骨細胞前體的成熟,并增強破骨細胞相關蛋白的活性[42]。因此,Ca2+信號對于破骨細胞的分化和功能至關重要。Hong等[43]的研究結果發現,通過抑制RANKL誘導的Ca2+振蕩的增加,從而抑制NFATc1的激活和自我擴增。這一研究結果表明抑制NFAT反式激活取決于RANKL誘導的Ca2+振蕩的減少。另有研究發現,通過使用青蒿琥酯抑制TRAF6和下游PLCγ-1-Ca2+-NFATc1信號通路的表達可以減弱破骨細胞生成[44]。這些研究表明,破骨細胞轉錄因子NFATc1依賴于Ca2+信號通路,從而調節RANKL誘導的破骨細胞生成。

2.2 NFATc-1與骨質疏松

骨代謝過程中破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成之間的平衡失調,是導致骨質疏松癥發生的主要原因[45]。當破骨細胞對骨的吸收超過成骨細胞形成新骨的速度會損害骨骼穩態,導致骨質疏松癥的持續發展[46]。

在破骨細胞的形成過程中,NFATc1作為“開關”啟動破骨細胞的分化和成熟[9]。Long等[47]研究發現,通過抑制NFATc1進入細胞核來減少破骨細胞的產生和骨吸收,可用于治療雌激素缺乏和破骨細胞亢進所致的骨質疏松癥。另有研究表明,通過抑制NFATc1的表達水平和轉錄活性,可有效地抑制破骨細胞的形成和功能,從而進一步降低下游破骨細胞基因的表達水平[48]。這可能為研究針對破骨失衡誘導的骨質疏松癥的治療方法鋪平道路。

NFATc1作為破骨細胞信號通路的重要下游轉錄因子之一,對其調節可以影響破骨細胞的生成,而這一機制也將有望成為未來治療骨質疏松癥的重要靶點。

2.3 NFATc-1與骨修復材料

隨著組織工程技術的不斷發展和完善,基于生物材料的治療策略最近成為治療骨質疏松癥的有效替代方案[49]。已有研究人員探索鈦植入物表面對破骨細胞發生的調控機制,通過評估不同鈦植入物表面刺激后NFATc1的表達情況,他們發現仿生微/亞微層級表面可能通過下調NFATc1表達抑制破骨細胞分化,進而以促進種植體與骨的骨融合,從而提高骨質疏松患者的治療效果[50]。Ha等[51]研究揭示了二氧化硅納米顆粒在抑制RANKL刺激早期關鍵破骨細胞轉錄調節因子NFATc1方面的作用。在此基礎上,他們進一步將此蛋白修飾于二氧化硅納米顆粒表面并構建成具有抗骨質疏松活性的藥物載體。這項研究揭示了納米顆粒在骨代謝方面的潛在治療應用。應用生物材料調控NFATc1從而抑制過度破骨吸收誘導的骨穩態失衡,這在未來將有望成為臨床上治療骨質疏松癥的一種新的策略思想。

3 總結與展望

骨質疏松癥是一種由破骨細胞介導的骨質吸收過程,其強度超過了成骨細胞介導的骨質形成,從而導致了骨平衡的破壞。既往研究證實,NFATc1可以通過調控RANKL-RANK、NF-κB、MAPK、Ca2+等信號通路的表達影響破骨細胞的生成與分化,在骨質疏松癥領域發揮著重要作用。然而,對于NFATc1通過多種信號通路作用于破骨細胞生成過多誘導骨質疏松的相關機制研究較為零散。關于生物材料靶向NFATc1的研究還處于起步階段,其機制和相關信號通路仍需進一步探索。