豬睪丸Dickkopf樣頂體蛋白1基因的轉錄調控分析

許 靜, 代紅梅, 張 霞, 劉志朋, 楊 忠, 李衛真, 付仕穎, 克比努爾·庫爾班, 霍金龍

(1.云南農業大學動物科學技術學院,云南 昆明 650201;2.呂梁學院生命科學系,山西 呂梁 033001;3.云南生物制藥有限公司,云南 昆明 650503;4.云南農業大學動物醫學院,云南 昆明 650201)

Dickkopf樣頂體蛋白1(acrosomal protein Dickkopf-like 1, DKKL1)是一種在動物睪丸精母細胞中特異性表達的蛋白,對精子發生至關重要[1]。DKKL1與DKK基因家族成員DKK3的離散區域部分同源,與別的DKK基因家族成員不同源[2]。DKKL1僅存在于哺乳動物中,并且在各物種之間高度保守[3]。研究表明:小鼠DKKL1最早在胚胎和未成熟的神經組織中表達,胚胎發育15 d后在骨骼和眼睛中表達[1];小鼠成年后,DKKL1主要在睪丸精母細胞中高度表達并定位于成熟精子的頂體,獲能后的DKKL1主要遷移到精子表面參與受精[3-4],隨后當精母細胞逐漸形成精子時,DKKL1在精子新生頂體中發揮作用[5]。DKKL1存在于精細胞未成熟的頂體以及成熟精子的頂體中,在小鼠精母細胞發育和成熟中發揮作用[6];此外,DKKL1通過抑制發育中的精子細胞的運動,從而防止其過早遷移到生精小管的管腔后被排出體外[6]。DKKL1在促進精子有效穿過透明帶、滋養細胞降解透明帶以及輔助胚胎植入子宮內膜等方面發揮了重要作用[6-7]。雖然缺乏DKKL1的胚胎可在體內發育成正常小鼠[7-8],但在體外缺乏DKKL1的精子使卵子的受精能力嚴重減弱,因此,DKKL1對雄性的體外生育能力十分重要[7]。DKKL1還是成年雄性動物精母細胞凋亡的關鍵調節因子,可限制精子的產生,而在老年雄性動物的睪丸中,DKKL1負責調控睪丸間質細胞中類固醇生成因子SF-1的功能,使類固醇生成酶基因表達下調,從而導致睪酮合成量減少,因此,DKKL1被認為是雄性成年動物睪丸生理學的雙重調節因子[1]。然而,無論DKKL1的作用方式如何,在缺少DKKL1的動物中觀察到精子數量增加,表明調節其表達或活性可影響雄性生育能力。在某些人類少精子癥病例中,阻斷DKKL1活性有助于增加精子數量[1];此外,DKKL1還與表皮角質形成[9]、阿爾茨海默癥[10]、乳腺癌[11]等發展進程有關。

版納微型豬近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)作為我國自主繁育的大型哺乳動物近交群體,是良好的試驗動物模型,在生物醫學等領域具有重要研究價值[12]。近年來,繁殖力限制了BMI群體的應用與發展,研究影響精子發生基因的功能對提高BMI公豬的繁育能力至關重要。據此,本研究以BMI睪丸為試驗對象,進行全轉錄組測序并分析DKKL1的表達量,克隆DKKL1編碼區并分析基因結構和蛋白質功能,挖掘DKKL1的互作蛋白,注釋DKKL1功能并構建DKKL1的競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)轉錄調控網絡。結果不僅為深入研究DKKL1在BMI睪丸中的作用機制提供依據,而且對研究人體和其他哺乳動物中DKKL1的功能也具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

供試的4頭12月齡BMI成年公豬來自昆明原種豬場。

1.2 轉錄組測序及DKKL1表達量的獲得

4頭BMI公豬去勢后取其睪丸組織,提取RNA并構建文庫,分別使用Illumina Hiseq 4000和Illumina novaseq 6000平臺進行RNA-seq和核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)測序。使用Fastp軟件對原始RNA-seq數據進行質量控制,使用Bowtie 2-2.1.0軟件去除rRNA序列,使用STAR-2.5.2a軟件與豬參考基因組(Susscrofa11.1)進行比對,使用featureCounts-2.0.1軟件和Salmon-1.5.1軟件獲得DKKL1的表達量。對于snoRNA,使用Bowtie 2-2.1.0軟件將rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA去除,將剩余質控后的序列與miRBase數據庫中所有物種的微小RNA(micro RNA, miRNA)序列進行比對,獲得BMI睪丸miRNA的表達量。

1.3 基因擴增及序列測定

通過分析轉錄組測序數據,獲得BMIDKKL1轉錄本對應Ensembl數據庫中的轉錄本序號為ENSSSCT00000058631.2,設計特異性引物(上游引物序列:CGCCCCAGGTAATCCGGCCTA;下游引物序列:GTGTTCCGCTGTCCTCGCTC),擴增DKKL1編碼區序列。PCR總體積為25 μL:含12.5 μL PremixTaqTM(v2.0),10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL,1 μL 25 ng·μL-1cDNA,用H2O補足體系。運行程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30個循環;72 ℃ 5 min。由昆明擎科生物公司測序PCR產物獲得DKKL1序列。

1.4 DKKL1功能分析

使用Lasergene 7.1軟件校對經Sanger軟件測序后的DKKL1序列;DKKL1的開放閱讀框(ORF)使用NCBI的ORF Finder軟件進行分析;通過ExPASy網站對DKKL1性質進行分析;通過SOPMA網站、ProtScale網站、TMHMM 2.0網站分別預測DKKL1的二級結構、疏水性結構和跨膜結構;通過SignalP 5.0網站、NetPhos 3.1網站、NCBI BLAST網站分別預測DKKL1的信號肽、磷酸化位點和保守結構域。在Ensembl數據庫下載12個豬品種(杜洛克、長白、大白、巴克夏、漢普夏、皮特蘭、梅山、八眉、金華、五指山、藏豬、榮昌)DKKL1編碼區序列并與BMIDKKL1轉錄本序列進行比對,檢測是否存在單核苷酸多態性變異位點。使用MEGA-X軟件構建DKKL1系統發育樹并使用Adobe Illustrator 2022軟件進行美化,使用Megalign軟件對多物種序列進行相似性分析,并使用R軟件中的ggplot2包進行可視化。

1.5 DKKL1蛋白互作分析

使用String v11.0b軟件進行蛋白互作分析,并使用Cytoscape軟件進行可視化,然后使用軟件中的clusterProfiler包對這些蛋白進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)和基因本體(gene ontology, GO)富集分析并用ggplot2包進行可視化。通過睪丸轉錄組測序數據分析DKKL1表達量與這些蛋白編碼基因表達量之間的相關性并用R軟件中的circlize包進行可視化。

1.6 DKKL1功能注釋及ceRNA轉錄調控網絡的構建

通過UniProt數據庫對DKKL1進行GO功能注釋,通過全轉錄組數據分析miRNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)的表達量,通過miRanda 3.3網站和RNAhybrid 2.1.2網站獲取調控DKKL1的miRNA和lncRNA,并用Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化。

2 結果與分析

2.1 DKKL1的表達量及特征信息

轉錄組測序獲得BMI的DKKL1均具有較高的正表達量,平均表達量為16 112.33,進一步通過矯正獲得的平均每百萬映射讀取的轉錄本(TPM)為881.16(圖1A)。比對發現,BMI中高表達的DKKL1與Ensemble網站中的ENSSSCT00000058631.2相對應,位于豬(Susscrofa11.1)第6號染色體4 142 467～4 147 022 bp處,含有5個外顯子和4個內含子(圖1A)。RT-PCR檢測獲得DKKL1產物的長度為887 bp(圖1B),編碼區全長702 bp(圖1C),包含233個氨基酸(圖1D)?；蚝偷鞍仔蛄刑峤恢罣enBank獲得的登錄號分別為OL362243和UZD11050。

2.2 DKKL1的序列及結構

BMI DKKL1分子質量為26.591 ku,分子式為C1177H1871N349O347S4,等電點8.07,正電荷殘基總數33個,負電荷殘基總數32個。在DKKL1的二級結構中,無規則卷曲的比例最大,其次是α-螺旋和延伸鏈,只含有少量β-轉角(圖2A)。DKKL1的N端疏水,C端親水;疏水性最大值為2.733,位于第9個氨基酸處;疏水性最小值為-3.689,位于第81個氨基酸處(圖2B)。DKKL1含有絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(圖2C)。DKKL1含有信號肽(圖2D),切割位點在第21與22位氨基酸之間。

2.3 DKKL1的保守性及系統進化關系

系統進化分析表明,BMI與山羊(XP_005692770)、綿羊(XP_042088245)、麋鹿(XP_043292184)、白尾鹿(XP_020741201)的親緣關系較近(圖3A);相似性分析表明,BMIDKKL1編碼區對應的氨基酸序列與除了食蟹獼猴(XP_005589936)和黑猩猩(XP_016792018)以外的其他哺乳動物的相似度均在80%以上(圖3B);BMIDKKL1編碼區高度保守,與杜洛克、長白、大白、巴克夏、漢普夏、皮特蘭、梅山、八眉、金華、五指山、藏豬、榮昌等12個豬品種比對不存在單核苷酸多態性。綜上所述,BMI DKKL1在進化過程中與其他哺乳動物之間具有較高的保守性以及序列同源性。

A:系統進化樹;B:相似性。

2.4 DKKL1與互作蛋白的關系

蛋白互作分析表明,DKKL1與多種蛋白存在互作關系(圖4A),互作密切程度從高到低依次為含螺旋結構域的蛋白155(coiled-coil domain containing protein 155, CCDC155)、轉錄增強締合域蛋白2(transcriptional enhanced association domain protein-2, TEAD2)、RAS癌基因家族成員11B(member of RAS oncogene family 11B, RAB11B)、癌癥相關基因-1(cancer-associated gene-1, CAGE1)、Dickkopf相關蛋白4(Dickkopf-related protein 4, DKK4)、WNT家族成員2B(WNT family member 2B, WNT2B)、胞質非特異性二肽酶2(cytosolic non specific dipeptidase 2, CNDP2)、二?；视椭久?diacylglycerol lipase alpha, DAGLA)等。將這些蛋白進行KEGG富集分析并取P<0.05的前20個通路,發現這些蛋白主要富集在Wnt信號、阿爾茨海默癥、乳腺癌、胃癌、mTOR信號、Hippo信號、肝細胞癌等通路上(圖4B);GO富集分析發現,這些蛋白主要富集在典型Wnt信號通路、細胞-細胞黏附調控、脂肪細胞分化調控、信號受體活性調節、共受體結合等條目上(圖4C)。通過轉錄組測序數據分析DKKL1與這些蛋白編碼基因表達量之間的相關性,結果(圖4D)顯示,DKKL1表達量與TEAD2、CNDP2的表達量顯著相關(P<0.05)。

A:互作蛋白網絡;B:互作蛋白KEGG富集分析圖;C:互作蛋白GO富集分析圖;D:互作蛋白編碼基因表達量的相關性弦圖。

2.5 DKKL1功能注釋及ceRNA轉錄調控網絡

DKKL1功能注釋結果顯示共有13個GO。其中:生物過程主要包括信號受體活性的負向調控、脂肪細胞分化的正向調控、睪酮生物合成過程的負向調控、解剖結構形態發生、典型Wnt信號通路的負向調控、透明帶穿透、凋亡過程的正向調控等7個方面;細胞組分主要包括頂體泡、胞質囊泡、細胞外區域、細胞外空間等4個方面;分子功能主要包括受體結合、受體拮抗劑活性調節等2個方面(圖5)。

ceRNA轉錄調控網絡分析發現,BMIDKKL1受miR-15a和miR-15b兩個miRNA靶向調控,另有8個lncRNA(ENSSSCG00000043931.1、ENSSSCG00000037771.2、ENSSSCG00000049125.1、ENSSSCG00000045328.1、ENSSSCG00000050726.1、ENSSSCG00000044738.1、ENSSSCG00000031683.2、ENSSSCG00000050821.1)與DKKL1競爭性結合miR-15a,有2個lncRNA(ENSSSCG00000041693.1、ENSSSCG00000043136.1)與DKKL1競爭性結合miR-15b(圖5)。

3 討論與結論

本研究通過全轉錄組測序獲得了BMI睪丸DKKL1的表達量,比對發現BMI中高表達的DKKL1與Ensemble數據庫中的ENSSSCT00000058631.2相對應;采用cDNA擴增了DKKL1編碼區序列,GenBank認證的基因登錄號為OL362243,蛋白登錄號為UZD11050;BMI在進化上與綿羊、山羊、麋鹿、白尾鹿等偶蹄目動物的親緣關系較近;BMIDKKL1編碼區對應的氨基酸序列與除了食蟹獼猴和黑猩猩以外的其他哺乳動物的相似度均大于80%,表明BMI DKKL1在進化過程中與其他哺乳動物之間具有較高的保守性和序列同源性。

功能分析表明:DKKL1含有信號肽,但不含保守結構域;含有絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點,這兩種氨基酸是激酶作用的靶點,在脊椎動物的精子發生中起重要作用[13]。DKKL1是一種糖基化蛋白,糖基化在精子發育和精卵結合中起著重要作用[14]。在精子發生過程中,DKKL1經歷了N-連接糖基化,而在成熟精子中以非N-糖基化方式被修飾。DKKL1作為一種新的頂體蛋白可能參與頂體組裝,并在精子發生過程中促進頂體的形成從而發揮作用[6]。

蛋白互作網絡分析發現,DKKL1與CCDC155、TEAD2、RAB11B、CAGE1、DKK4、WNT2B、CNDP2、DAGLA等多個蛋白互作,其中與CCDC155互作最為密切。CCDC155(KASH5)作為細胞質動力蛋白的外核膜適配器主要存在于哺乳動物的睪丸和卵巢中[15];小鼠睪丸中的CCDC155僅在初級精母細胞中表達,對減數分裂前期調節端粒主導的染色體運動至關重要,CCDC155缺失的小鼠患無精子癥從而不育[16]。TEAD2位于DKKL1下游3.8 kb處,二者轉錄方向相反,在哺乳動物發育初期同時表達,并在胚胎發育時期細胞分化開始時差異表達[17];TEAD2在正常小鼠睪丸支持細胞和睪丸間質細胞中表達,與精子發生和精子成熟有關[17];轉錄組測序數據分析表明,TEAD2表達量與DKKL1表達量顯著相關,為下一步開展TEAD2研究指明了方向。RAB11B是RAB11亞家族成員,是一種在哺乳動物睪丸中高度表達的YPT/RAB蛋白[18];RAB11在成年果蠅的睪丸和卵巢中表達,對生育至關重要;RAB11的突變會破壞肌動蛋白細胞骨架,導致精子缺陷以及卵母細胞減少[19]。CAGE1主要在小鼠精子成熟后表達,是哺乳動物精子細胞和頂體的重要組成成分,對成功受精至關重要[20]。DKK4與精子發生有關,在減數分裂過程中精母細胞、精子細胞和精子所在的血睪屏障腔室中可阻斷Wnt信號通路的激活,從而影響未分化精原細胞的增殖[21]。WNT2B在初生小鼠睪丸中表達,與精原干細胞(SSC)活性和精子發生有關[22],在人類減數分裂中也具有重要作用,其受體僅在初級精母細胞中表達[23]。CNDP2是一種精漿蛋白,與無精子癥有關[24];轉錄組測序數據分析表明,CNDP2表達量與DKKL1表達量顯著相關,為拓展DKKL1的研究提供了方向。DAGLA主要存在于睪丸間質細胞中,與精子發生相關[25]。對互作蛋白進行GO和KEGG富集分析發現,這些蛋白主要富集在典型Wnt信號通路、細胞-細胞黏附調控、信號受體活性調節等條目上,為深入研究DKKL1在BMI中的功能提供了參考。

本研究對DKKL1進行功能注釋發現,其主要參與睪酮生物合成過程的負向調控、透明帶穿透、頂體泡生成、凋亡過程的正向調控等。靶基因分析發現,有2個miRNA(miR-15a、miR-15b)可在精子發生中靶向下調DKKL1 mRNA的表達,從而抑制DKKL1的表達[26-27]。miR-15a在小鼠減數分裂前持續下降,對早期精子發生至關重要[28];miR-15a在公牛精子中表達,并與公牛生育力呈負相關,低生育率公牛中的miR-15a水平比高生育率公牛高[29];降低人體精索靜脈曲張中miR-15a的表達可保護精子免受高溫或氧化應激損傷,從而避免不育[30]。miR-15b對精子發生至關重要,其異常高表達可能會破壞體內正常精子的發生[31];miR-15b與精子結構、運動和代謝相關蛋白質有關[32];另外,miR-15b可靶向大鼠Bcl-2和半胱天冬酶信號通路在細胞凋亡過程中發揮作用[33]。本研究中,miR-15a和miR-15b的發現為DKKL1的深入研究提供了方向。

綜上所述,本研究采用全轉錄測序方法獲得了BMI睪丸組織中DKKL1的表達量,通過RT-PCR獲得了DKKL1編碼區序列并分析了基因結構和蛋白質功能,構建了蛋白質互作網絡并對這些蛋白進行了GO和KEGG富集分析,注釋了DKKL1功能并構建了ceRNA轉錄調控網絡。本研究結果不僅為深入研究DKKL1在BMI睪丸中的作用機制提供了依據,也為DKKL1在人體或其他哺乳動物中的功能及轉錄調控機制研究提供了參考。