東方蜜蜂微孢子蟲侵染過程中nce-miR-15338及候選靶基因的表達譜

王思懿, 高旭澤, 趙浩東, 荊 欣, 劉小玉, 馮佩林, 宋宇軒, 劉彩珍, 陳大福,3,4, 郭 睿,3,4

[1.福建農林大學動物科學學院(蜂學學院),福建 福州 350002; 2.福建農業職業技術學院現代農業工程學院,福建 福州 350000; 3.福建農林大學天然生物毒素國家地方聯合工程實驗室,福建 福州 350002; 4.福建省蜂療研究所,福建 福州 350002]

意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica),簡稱意蜂,是西方蜜蜂(A.mellifera)的一個優良亞種。由于其具有分蜂性弱、繁殖力強、工蜂采集力強以及對大群的維持能力等優良特性,成為養蜂生產中主要的蜂種[1]。東方蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)專性侵染成年蜜蜂的腸上皮細胞,導致宿主細胞結構破壞、免疫抑制和能量脅迫等,嚴重影響蜜蜂的健康和蜂群的生產力[2]。Fries et al[3]在北京附近的東方蜜蜂(Apiscerana)蜂群中鑒定到東方蜜蜂微孢子蟲。東方蜜蜂微孢子蟲已在歐洲和北美地區飼養的西方蜜蜂蜂群中傳播[4-5],目前可以在世界各國的飼養蜂群中檢測到東方蜜蜂微孢子蟲。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度18～22 nt的小非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA),在眾多生理和病理過程中發揮著重要的調控作用[6]。Lee et al[7]于1993年在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發現1個miRNA并命名為lin-4。隨著二代測序技術的發展與成熟,三角渦蟲(Dugesiajaponica)、小麥(Triticumaestivum)和東方蜜蜂微孢子蟲等動植物和微生物的miRNA被陸續鑒定[8-10]。目前,動植物的miRNA研究豐富而深入,但真菌的miRNA研究相對滯后[11-12]。蜜蜂真菌病原的miRNA相關研究相對較少。Huang et al[13]利用RNA-seq技術對東方蜜蜂微孢子蟲侵染的西方蜜蜂6日齡工蜂中腸進行測序,預測到東方蜜蜂微孢子蟲的6個miRNA?；谛陆M裝的東方蜜蜂微孢子蟲基因組,Shao et al[14]隨后又鑒定出3個miRNA。本課題組結合small RNA-seq和生物信息學鑒定到nce-miR-15338等東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的10個miRNA[15],并通過分子生物學方法證實了其中4個miRNA(nce-miR-23928、nce-miR-26675、nce-miR-12220和nce-miR-10660)的真實存在和表達[15-16]。

目前,關于東方蜜蜂微孢子蟲的miRNA研究相對滯后且信息匱乏。nce-miR-15338在東方蜜蜂微孢子蟲侵染蜜蜂宿主過程中的表達規律和調控尚不明確。本研究對nce-miR-15338進行表達和序列驗證,并進行nce-miR-15338的靶向預測和分析,進而檢測nce-miR-15338及其靶基因在東方蜜蜂微孢子蟲侵染意蜂工蜂過程中的表達譜,以明確nce-miR-15338及其靶基因在侵染過程中的表達規律,并為探究nce-miR-15338調控東方蜜蜂微孢子蟲侵染的功能及作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試生物材料

未受東方蜜蜂微孢子蟲感染的工蜂取自福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)教學蜂場的意蜂蜂群。東方蜜蜂微孢子蟲感染的工蜂取自福州市閩侯縣荊溪源安蜂場的意蜂蜂群。東方蜜蜂微孢子蟲孢子由福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)蜜蜂保護實驗室制備和保存[15,17]。

1.2 nce-miR-15338的Stem-loop RT-PCR、分子克隆及Sanger測序

根據前期預測到的nce-miR-15338序列(UAGUGAUGGCUGUGGCCUAGA),利用DNAMAN軟件設計Stem-loop引物和上下游引物(表1),并由上海生工生物工程股份有限公司進行合成。利用RNA抽提試劑盒(Promega Corporation,美國)提取東方蜜蜂微孢子蟲純凈孢子的總RNA。參照反轉錄試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司,長沙)說明書,利用Stem-loop引物進行反轉錄,以得到的cDNA作為模板進行PCR擴增。PCR體系與條件參照吳鷹等[18]的研究方法。參照郭意龍等[19]的方法回收目的片段和TA克隆,然后將少量菌液送至上海生工生物工程股份有限公司進行Sanger測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 nce-miR-15338的靶基因預測和分析

基于前期獲得的東方蜜蜂微孢子蟲孢子高質量sRNA-seq數據[15],使用Target Finder軟件[16]對nce-miR-15338進行靶向預測。參照吳鷹等[17]的方法,利用Blast工具將靶基因比對到Nr數據庫(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA)、Swiss-Prot數據庫(http://www.ebi.ac.uk/swissprot)、GO數據庫(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gogsea)及KEGG數據庫(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/pathwaygsea)以獲得相應注釋。根據預測到的靶向結合關系構建nce-miR-15338與靶基因之間的調控網絡,并通過Cytoscape軟件進行可視化分析。

1.4 樣品制備

意蜂工蜂接種及中腸樣品制備[20]:首先從群勢較強、外觀健康且未受東方蜜蜂微孢子蟲感染的意蜂蜂群中提取封蓋子脾至實驗室,放入恒溫恒濕箱[(溫度為(34±0.5) ℃,相對濕度為70%)];隨后,收集剛羽化的工蜂,經過2 h的饑餓處理后,單頭飼喂接種5 μL 500 g·L-1蔗糖溶液(含106個東方蜜蜂微孢子蟲孢子)。工蜂食盡蔗糖溶液后,將其放入干凈的塑料盒(每盒35頭),并在上方安放1支飼喂器(內裝有2 mL蔗糖溶液)。每24 h更換1支飼喂器(內裝有2 mL蔗糖溶液),并每日檢查工蜂的死亡情況,及時清理死亡工蜂。在接種后的第1、2、4、6、8天,使用眼科鑷取出工蜂中腸,每3條中腸放入1個無菌的RNA-Free離心管,液氮速凍后迅速轉移至-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.5 nce-miR-15338的RT-qPCR檢測

利用RNA抽提試劑盒(Promega Corporation,美國)分別提取上述5個時間點的中腸樣品總RNA,利用Stem-loop引物進行反轉錄得到相應的cDNA,作為nce-miR-15338的qPCR模板。 同時將Oligo dT引物和Random 6 mer引物按1∶1混合,通過反轉錄獲得相應的cDNA作為nce-miR-15338的內參5srRNA(GenBank ID: EF091880.1)、靶基因及靶基因內參actin(GenBank ID: 36320842)的qPCR模板。按照SYBR Green試劑的說明書進行qPCR反應。參照吳鷹等[18]試驗體系。每個反應均設置3個平行重復和3個技術重復。以1 d為參照,采用2-ΔΔCt法計算nce-miR-15338在2、4、6和8 d的相對表達量。 采用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析并繪圖。使用SPSS statistics軟件對nce-miR-15338在各日齡的相對表達量進行單因素方差分析,以P<0.05為顯著性閾值。通過Tukey檢驗法和字母顯著標記法兩兩比較分析試驗數據。

1.6 靶基因的RT-qPCR檢測

根據1.3節的靶向預測結果和東方蜜蜂微孢子蟲的生物學背景[21],同時參考相關研究報道[22],篩選出2個關鍵靶基因長鏈脂肪酸連接酶(long chain fatty acid ligase)編碼基因LCFAL2(GenBank ID: 36321219; gene 1366)和20s蛋白酶體亞基(20s proteasome subunit)基因20sPS(GenBank ID: 36320219; gene 1677)進行表達譜檢測。 根據LCFAL2和20sPS的序列設計并合成相應的特異性引物(表1)。 采用qPCR檢測上述2個靶基因的相對表達量。 以肌動蛋白基因actin(GenBank ID: AB023025.1)作為內參。 參照吳鷹等[18]的試驗體系。每個反應均設置3個技術重復和3個平行重復。以1 d為參照,采用2-ΔΔCt法計算靶基因在2、4、6、8 d的相對表達量。利用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析并繪圖。

2 結果與分析

2.1 nce-miR-15338的表達與序列驗證

瓊脂糖凝膠電泳結果表明,Stem-loop RT-PCR能夠擴增出符合預期(約100 bp)的目的片段(圖1A);進一步的Sanger測序結果顯示,目的片段的序列(UAGUGAUGGCUGUGGCCUAGA)與基于轉錄組數據預測的nce-miR-15338序列完全一致(圖1B),表明nce-miR-15338真實存在和表達。

A:nce-miR-15338 Stem-loop RT-PCR擴增產物檢測;B:目的片段的Sanger測序。

2.2 nce-miR-15338的靶基因

nce-miR-15338共靶向16個基因,形成相應的調控網絡(圖2)。這些靶基因在Nr數據庫中均有注釋,其中,有7個靶基因可注釋到Swissprot數據庫,注釋信息包括蛋白酶體亞單位β-3型、錳轉運ATP酶、苯丙氨酸-tRNA連接酶、T復合蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、長鏈脂肪酸-輔酶A連接酶和熱休克蛋白。此外,有3個靶基因在KEGG數據庫中有注釋,涉及7條通路,包括脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、群體感應、脂肪酸代謝、氨?；?tRNA的生物合成、蛋白酶體和代謝途徑。另外,有8個靶基因在GO數據庫中有注釋,涉及生物學進程、細胞組分和分子功能大類相關的28個功能條目,包括定位、單一組織進程和代謝進程等。

圖2 nce-miR-15338及其靶基因之間的調控網絡Fig.2 Regulatory network between nce-miR-15338 and its target genes

2.3 nce-miR-15338的表達譜

RT-qPCR結果顯示,相比于1 d,nce-miR-15338在2 d的表達水平極顯著上調1.66倍(P<0.01),在4、6、8 d的表達水平均極顯著下調(P<0.01),下調99.23%、99.85%和99.85%?？傮w呈現先上升后下降的表達趨勢(圖3)。

t表示接種后的天數。曲線上相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(Tukey檢驗)。

2.4 靶基因LCFAL 2的表達譜

RT-qPCR結果顯示,相比于1 d,靶基因LCFAL2在2、4、6、8 d的表達量均極顯著下調(P<0.01),下調31.68%、98.41%、98.42%和98.86%(圖4B)?？傮w表現出持續下降的表達趨勢(圖4B)。

t表示接種后的天數。A:nce-miR-15338與LCFAL 2的靶向結合關系;B:LCFAL 2在東方蜜蜂微孢子蟲侵染過程的表達譜。曲線上相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(Tukey檢驗)。

2.5 靶基因20s PS的表達譜

20sPS(gene 1677)與nce-miR-15338的潛在靶向結合關系如圖5A所示。與1 d相比,靶基因20sPS在2、4、6、8 d的表達量均極顯著下調(P<0.01),下調45.91%、76.15%、71.27%和77.59%(圖5B)。20sPS總體上呈現持續下降的表達趨勢(圖5B)。

t表示接種后的天數。A:nce-miR-15338與20s PS的靶向結合關系;B:20s PS在東方蜜蜂微孢子蟲侵染過程中的表達譜。曲線上相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(Tukey檢驗)。

3 討論與結論

關于東方蜜蜂微孢子蟲miRNA的研究相對較少,主要是基于生物信息學方法進行預測,而對miRNA的分子生物學驗證以及功能研究則相對匱乏。在本研究中,利用Stem-loop RT-PCR和Sanger測序證實了nce-miR-15338在東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的真實存在和表達。此前,本課題組已經驗證了東方蜜蜂微孢子蟲孢子中nce-miR-23928、nce-miR-26675、nce-miR-12220和nce-miR-10660的存在和表達[15,18]。鑒于目前東方蜜蜂微孢子蟲miRNA序列的信息較少,以上結果為miRNA序列信息的豐富提供了重要補充。本研究表明,nce-miR-15338在2 d的表達量顯著高于1 d,而在4、6、8 d的表達量則顯著下調,說明nce-miR-15338在東方蜜蜂微孢子蟲侵染意蜂工蜂的過程中發生了差異表達,因此nce-miR-15338可能參與了對東方蜜蜂微孢子蟲侵染的調控。

長鏈脂酰輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, LACS)是?；せ蠲讣易宄蓡T之一,包含5種不同的亞型,由不同的基因編碼,在真核生物中廣泛存在,且在細胞的脂質代謝、增殖以及凋亡中起到重要作用[23-24]。Tomoda et al[25]研究表明,將Raji細胞在含LACS的抑制劑中培養時,細胞增殖以劑量依賴性方式受到抑制,且?；o酶A合成酶的抑制與脂質合成的抑制密切相關。Schoonjans et al[26]通過部分肝切除試驗發現,72 h后肝細胞中的LACS mRNA恢復到術前70%,表明LACS與肝細胞增殖之間存在實質性聯系。本研究中,nce-miR-15338與LCFAL2存在潛在靶向結合關系(圖4A),而LCFAL2在2、4、6和8 d的表達水平分別下調了31.68%、98.41%、98.42%和98.86%(圖4B),暗示其潛在參與侵染過程。另外,nce-miR-15338的表達趨勢與LCFAL2在4、6、8 d一致,二者之間可能存在潛在的正調控關系,但仍需通過雙熒光素酶報告基因系統進一步驗證。

蛋白酶體存在于真核動物、古細菌和細菌中,以20s蛋白酶體核心顆粒為中心的復合物,在細胞核和細胞質中具有蛋白水解和細胞代謝等重要功能[27]。另外,蛋白酶體亞基的一種新型磷酸位點α5-S16能夠與關鍵調節因子PLK1等許多蛋白質共同作用進而影響有絲分裂[28]。在小鼠中,免疫蛋白酶體亞基通過影響CD8+T淋巴細胞的反應加強宿主對布魯氏菌(Brucellaabortus)的抵抗[29]。本研究發現,nce-miR-15338與20sPS存在潛在靶向結合關系(圖5A),相較于1 d,20sPS在2、4、6、8 d分別極顯著下調了45.91%、76.15%、71.27%和77.59%(圖5B),表明20sPS在東方蜜蜂微孢子蟲的侵染過程中持續下調表達,推測其參與侵染過程。此外,20sPS在4、6、8 d的表達趨勢與nce-miR-10660一致,二者間同樣具有潛在的正調控關系,但仍需要進一步的試驗驗證。下一步擬利用雙熒光素酶報告基因系統驗證nce-miR-10660與上述2個靶基因之間的結合關系,再通過飼喂dsRNA對孢子接種的工蜂體內的東方蜜蜂微孢子蟲LCFAL2(20sPS)進行RNAi,進而檢測病原孢子載量、增殖和侵染相關基因相對表達量及宿主生存曲線、蔗糖溶液消耗量等指標,以明確LCFAL2和20sPS在侵染中的功能。

綜上,研究結果證實了nce-miR-15338在東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的真實存在和表達,并明確了nce-miR-15338及其靶基因LCFAL2和20sPS在東方蜜蜂微孢子蟲侵染意蜂工蜂過程中的表達規律和潛在調控關系。