梔子花多糖的提取工藝及其脂代謝調節作用

柳宛藝, 鄧湘鑄, 尚煜昆, 黃 超, 吳思鎣, 黃 維,2

(1.福建農林大學生命科學學院;2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心,福建 福州 350002)

梔子(GardeniajasminoidesEllis)是我國八大香花之一,是一種藥食同源植物,其果、花等皆有藥效。梔子花味苦、性寒,歸肺、肝經,有清肺止咳、涼血解毒的功效[1-2]。目前對梔子花藥效的研究較少[3-4]。研究[5-7]表明:梔子花的主要成分有多糖、黃酮、環烯醚萜、三萜、酚酸等,其中,多糖占梔子花干質量的10%以上,高于其他活性成分。植物多糖具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖、降血脂、提高人體免疫力等功效[8-10]。植物多糖的提取方法主要有溶劑提取法、微波提取法、酶解輔助提取法、超聲波提取法等,而超聲波提取法在植物多糖中的應用較為廣泛[11-12]。本研究擬采用超聲波提取法研究梔子花多糖的提取工藝,并采用脂肪堆積細胞模型對梔子花多糖的降血脂功效進行研究,以期為梔子花多糖等功能性食品的開發與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

梔子花采自福建省寧德市福鼎市貫嶺鎮黃梔子生產基地。

人肝癌細胞HepG2購于中國科學研究院(上海)細胞庫;DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液,購自美國HyClone公司;噻唑蘭[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、油酸(oleic acid,OA)購于美國 Sigma公司;甘油三酯(triacylglycerol,TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所;高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;Bradford蛋白含量測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司;牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)購于上海源葉生物科技有限公司;辛伐他汀(批號171101)購于國藥集團汕頭金石制藥有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

主要儀器包括超聲波儀(KQ-600DE,昆山市超聲儀器有限公司)、二氧化碳培養箱(美國賽默飛世爾科技公司)、倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)、臺式離心機 (TGL-16G,上海安亭科學儀器廠)、超純水機(Millipore Synergy-UV,美國默克密理博公司)、SJIA-10N冷凍干燥機(寧波市鄞州雙嘉儀器有限公司)和電子天平(BS-210S,北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 梔子花干粉的制備 將新鮮的梔子花于陰涼處攤開、晾干;置于60 ℃烘箱干燥24 h,用中藥打粉機粉碎,過40目篩;采用索氏提取器在50 ℃下用石油醚將梔子花干粉回流2次,每次2 h;再用布氏漏斗抽濾,最后將梔子花干粉放入烘箱,60 ℃下烘干,備用。

1.3.2 單因素試驗 設定液料比為5～30 mL·g-1,提取溫度為30～80 ℃,超聲功率為100～600 W,提取時間為30～180 min。稱取梔子花干粉3.0 g于250 mL具塞錐形瓶中,混合后放入超聲波儀器中提取多糖。

1.3.3 響應面試驗 按照中心組合原則選擇各因素的3個水平設計試驗,設置3個重復,使用Design Expert 8.0.6軟件對梔子花多糖的提取結果進行分析、優化。

1.3.4 多糖含量測定[13]稱取105 ℃下烘干后的標準葡萄糖40 mg,用蒸餾水溶解于1 000 mL容量瓶中,配制40 μg·mL-1葡萄糖溶液(對照)。稱取苯酚5 g,用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中并搖勻,配制質量分數為5%的苯酚溶液。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 40 μg·mL-1葡萄糖溶液,置于試管中;以蒸餾水補至1.0 mL,加入1 mL 5%(質量分數)苯酚及5.0 mL濃硫酸,搖勻,放置20 min;在490 nm波長下測量光密度。以葡萄糖含量為橫坐標,光密度為縱坐標,繪制如下標準曲線:

Y=0.146 9X+0.108 2(R2=0.998 3)

式中:X為葡萄糖質量濃度(μg·mL-1);Y為D490 nm。

取上述試驗獲得的梔子花水提液1 mL,用蒸餾水稀釋于 25 mL容量瓶內;再從該容量瓶中取1 mL溶液于試管中,分別與苯酚、濃硫酸發生反應,測定D490 nm,并根據葡萄糖標準曲線計算梔子花提取液中多糖的含量。

1.3.5 脂肪堆積細胞試驗[14](1)細胞存活率測定:采用96孔板,每孔加入200 μL HepG2細胞液(5×104個·mL-1),培養過夜;待細胞貼壁后,棄去培養液。設置無細胞培養基為對照1,不加藥培養基為對照2。

將提取工藝優化后獲得的梔子花多糖用70%(體積分數)乙醇沉淀后低溫冷凍、干燥,再用蒸餾水分別配制50、100、150、200、250、300 μg·mL-1的梔子花多糖溶液,對HepG2細胞給藥,每孔分別加入180 μL上述梔子花多糖溶液;24 h后每孔分別加入20 μL 5 mg·mL-1MTT溶液;4 h后棄去孔中溶液,用150 μL DMSO溶解,測定D490 nm。根據如下公式計算細胞存活率:

細胞存活率=[D490 nm(處理)-D490 nm(對照1)]/[D490 nm(對照2)-D490 nm(對照1)]×100%。

(2)OA造模劑的制備:吸取100 μL OA于 70 ℃水浴中,振蕩后溶解于3.06 mL 0.1 mol·L-1NaOH中,配制100 mmol·L-1OA儲備液;稱取2.844 g BSA,加入28.44 mL PBS溶液,配制質量分數為10%的BSA溶液;置于55 ℃水浴中,振蕩后逐滴加入上述OA儲備液,配制10 mmol·L-1的OA溶液。以0.22 μm濾膜過濾OA溶液,-20 ℃下冷凍保存,備用。

(3)OA造模劑濃度的篩選:采用96孔板,每孔加入200 μL HepG2細胞液(5×104個·mL-1),培養過夜,在HepG2細胞貼壁后,棄去培養液。設置無細胞培養基為對照1,不加藥培養基為對照2;分別設置500、750、1 000、1 250、1 500、2 000 μmol·L-1OA造模劑為處理組,每組設3個復孔。采用TG檢測試劑盒測定TG含量,再采用MTT法測定細胞存活率,篩選出最佳OA造模劑濃度。

(4)梔子花多糖對脂肪堆積細胞脂代謝的影響:采用96孔板,每孔接種200 μL HepG2細胞(5×104個·mL-1)。利用上述篩選出的OA造模劑濃度建立脂肪堆積細胞模型;利用提取工藝優化后獲得的50、100、150、200、250、300 μg·mL-1梔子花多糖溶液和50 μg·mL-1辛伐他汀分別對上述脂肪堆積細胞給藥;24 h 后根據試劑盒說明書分別測定TG、TC、HDL-C、LDL-C含量和細胞存活率。以未添加OA造模劑的細胞為對照1,以僅添加OA造模劑的細胞為對照2;處理1、處理2、處理3分別為100、150、200 μg·mL-1梔子花多糖溶液,處理4為50 μg·mL-1辛伐他汀溶液。每組設3個復孔。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

分別考察液料比、提取溫度、超聲功率和提取時間對梔子花多糖提取率的影響。對不同液料比的梔子花溶液提取多糖,在超聲功率300 W、提取溫度40 ℃條件下提取60 min,多糖提取率隨液料比的增大而升高,但液料比大于25 mL·g-1時多糖提取率升高不顯著(圖1A)。在液料比25 mL·g-1、超聲功率300 W、提取時間60 min的條件下,升高提取溫度有助于提高多糖提取率;提取溫度為70 ℃時多糖提取率達到最大值;而提取溫度為80 ℃時提取率不再升高,推測溫度過高會引起多糖降解(圖1B)。在提取溫度70 ℃、液料比25 mL·g-1的條件下,超聲功率為500 W時提取率最高,而超聲功率為600 W時提取率明顯下降,推測超聲功率過高會使多糖結構受到破壞(圖1C)。在液料比25 mL·g-1、超聲功率500 W、提取溫度70 ℃的條件下,提取時間為150 min時多糖提取率最大,而提取時間大于150 min時提取率下降,推測提取時間過長會使多糖結構受到破壞(圖1D)。

圖1 不同提取條件下的梔子花多糖提取率Fig.1 Yield of polysaccharide extracted from G.jasminoides flower under different extraction conditions

2.2 響應面試驗

根據單因素試驗結果,運用中心組合原則選擇液料比(A)、提取溫度(B)、超聲功率(C)和提取時間(D)的3個水平,分別以-1、0和1表示(表1)。利用Design Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型設計響應面試驗,結果見表2。

表1 基于響應面試驗的因素水平表Table 1 Factors and levels in the response surface design

表2 梔子花多糖提取的響應面試驗結果Table 2 Result of response surface experiment on extraction of polysaccharides from G. jasminoides

采用Design Expert軟件對試驗結果進行多元回歸分析,得到各提取因子與梔子花多糖提取率的回歸擬合方程:

Y=17.45-0.11A-0.23B+0.81C+0.66D+0.34AB+0.08AC-0.072AD+0.11BC-0.34BD-0.073CD-0.61A2-0.73B2-0.35C2-0.71D2(R2=0.934 6)。

由回歸擬合方程可知,液料比對梔子花多糖提取率的影響最大,其次是超聲功率(表3)。由響應面模型可以看出:液料比與提取溫度以及提取溫度與提取時間之間的相互作用對梔子花多糖提取率的影響較顯著(表3)。

表3 回歸模型的方差分析1)Table 3 Variance analysis of regression equation

由Design Expert軟件分析得出多糖提取的最佳條件為:液料比24.8 mL·g-1,提取溫度62.7 ℃,超聲功率547.9 W,提取時間138.16 min。這時多糖提取率(理論值)可達17.52%。根據實際情況優化后的提取條件為:液料比25 mL·g-1,超聲功率550 W,提取時間140 min,提取溫度63 ℃。由驗證試驗結果可知:多糖平均提取率為17.48%±0.22%,與理論值較接近,其相對標準偏差為4.63%,說明此響應面模型穩定、可靠。

2.3 梔子花多糖對脂肪堆積細胞脂代謝的影響

采用優化后的提取工藝獲得不同含量梔子花多糖,醇沉后低溫凍干,加入蒸餾水配制成50、100、150、200、250、300 μg·mL-1梔子花多糖溶液。從圖2可知:當梔子花多糖的質量濃度不高于250 μg·mL-1時,其對HepG2細胞無抑制作用(P>0.05);當梔子花多糖的質量濃度為300 μg·mL-1時,其對HepG2細胞有顯著的抑制作用(P<0.05)。

圖2 不同含量梔子花多糖對HepG2細胞存活率的影響Fig.2 Effect of different contents of G. jasminoides flower polysaccharides on survival rate of HepG2 cell

分別配制500、750、1 000、1 250、1 500和2 000 μmol·L-1OA溶液,對HepG2細胞給藥, 24 h后檢測細胞存活率和TG含量。由表4可知:0～1 250 μmol·L-1OA對細胞存活率無顯著影響(P>0.05);與對照2相比,1 500～2 000 μmol·L-1OA顯著降低細胞存活率(P<0.05),說明高含量OA對細胞有抑制作用。結果(表4)顯示:當OA濃度≥500 μmol·L-1時,HepG2細胞的TG含量均顯著提高(P<0.05);OA濃度為1 000 μmol·L-1時,TG含量達到最大值。因此,選擇1 000 μmol·L-1作為OA造模劑濃度(表4)。

表4 OA造模劑濃度對HepG2細胞存活率和TG含量的影響1)Table 4 Effect of oleic acid on survival rate and triglyceride content of HepG2 cells

以1 000 μmol·L-1作為脂肪堆積細胞試驗的誘導濃度,由表5可知:與對照2相比,隨著梔子花多糖含量的提高,脂肪堆積細胞的TG、TC和LDL-C含量均逐漸下降,而HDL-C含量上升,且對細胞存活率無顯著影響(P>0.05),表明梔子花多糖對脂肪堆積細胞的脂代謝具有顯著的調節作用。

表5 梔子花提取物對脂肪堆積細胞脂代謝的影響1)Table 5 Effect of G.jasminoides flower polysaccharides on fat accumulation cells

3 討論和小結

黃維等[15]研究表明,液料比、提取溫度、超聲波功率和提取時間是影響超聲波提取植物多糖的關鍵因素。本研究通過優化蒸餾水與梔子花干粉的液料比、提取溫度、超聲功率和提取時間,設計響應面法試驗。結果表明,液料比和超聲波功率對梔子花多糖提取率的影響比較顯著,這與大多數研究結果[12]一致。宮寧江等[16]對梔子多糖超聲提取工藝進行了優化研究,結果顯示,最佳工藝參數為液料比44 mL·g-1、超聲功率120 W、提取時間73 min,該工藝條件下梔子多糖的提取率為6.34%±0.09%。本試驗得到的最優工藝為液料比25 mL·g-1、超聲功率550 W、超聲時間140 min、提取溫度63 ℃,梔子花多糖的提取率高達17.48%。

肝臟是人體脂肪代謝的重要器官,肝臟內的TG和TC等脂肪類物質可通過三酰甘油轉運蛋白形成LDL-C,分泌肝細胞,而HDL-C可降低肝臟細胞的膽固醇含量,降低動脈硬化風險[17-18]。劉暢等[19]利用紅樹莓提取物抑制HepG2細胞胞內脂肪堆積。甘露珍等[20]研究表明,澤漆提取物能夠有效抑制HepG2細胞內脂肪堆積,調節脂質代謝。本研究通過OA造模劑構建人肝癌HepG2細胞脂肪堆積模型,結果顯示梔子花多糖能有效降低細胞內TG、TC和LDL-C含量,提高HDL-C含量,表明梔子花多糖對高脂肝細胞脂代謝具有顯著的調節作用。但目前對于梔子多糖的降脂機制還不明確,有待于進一步研究。