桃金娘花藥愈傷組織誘導研究

郭佳慧，豐 鋒，向星星，干雨露，韓維棟

（廣東海洋大學 濱海農業學院，廣東 湛江 524088）

桃金娘［Rhodomyrtus tomentosa（Ait.） Hassk.］，桃金娘科（Myrtaceae）桃金娘屬［Rhodomyrtus（DC.） Rchb.］植物，為多年生落葉小灌木，又名山稔子、崗稔、多蓮等，多生長于我國兩廣的紅壤丘陵地帶，是酸土指示植物［1］。桃金娘是分布于我國的桃金娘屬的唯一種［2］，其花色絢麗多彩，可應用于園林景觀和土壤生態修復［3］，果實營養價值高，含豐富的多糖和花色素苷，具極高抗氧化活性［4］，有一定藥用保健價值。目前，關于桃金娘的研究主要集中在藥用價值分析、加工利用、生態特性等方面［4］。

桃金娘的繁殖一般采用實生繁殖和扦插繁殖［5］。實生繁殖難以保持優良種性，扦插繁殖生根率較低，推測原因是桃金娘本身單寧含量較高［6］。

花藥培養技術可使小孢子產生單倍體［7-8］，能快速獲得某一性狀純合體，豐富親本種質資源，加快育種進程，提高育種效率，縮短育種年限［9-10］，在一些作物和果樹上已有成功應用［11-12］?；ㄋ幣囵B在植物育種方面至關重要，研究誘導桃金娘花藥胚性愈傷組織的培養條件，建立桃金娘花藥愈傷組織培養體系，為桃金娘組培快繁體系的建立提供理論基礎。本研究以桃金娘花藥為材料，探究不同小孢子發育時期、花蕾大小、不同生長調節劑組合和不同時間低溫預處理對于花藥愈傷組織誘導的影響，篩選出適合桃金娘花藥愈傷組織誘導的花藥發育時期、培養基以及低溫預處理最佳時間。

1 材料與方法

1.1 材料

以廣東海洋大學園林基地長勢強壯、無病蟲害的桃金娘外植體為實驗材料，于晴朗天氣上午（8：00 ~ 10：00）用鑷子采集健壯植株的不同大小花蕾放入自封口塑料袋內，用冰盒帶回實驗室備用。每一個發育時期取花蕾20個，重復3次。

1.2 方法

1.2.1 花蕾形態特征觀察與測量

用游標卡尺測量桃金娘花蕾縱徑、橫徑，觀察花蕾外部形態并描繪特征，用鑷子剝離萼片與花瓣，觀察花藥顏色與氣味。

1.2.2 小孢子發育細胞學觀察

用卡諾式固定液固定大小不一的花蕾24 h，轉入70%酒精中，于4℃冰箱保存。用鑷子取出保存液中的花蕾，剝去花萼與花瓣，取出花藥均勻涂抹于載玻片，用鑷子輕碾花藥，以便花粉細胞流出，醋酸洋紅染色后在400× 光學顯微鏡（瑞顯光學RXBH200M）下觀察各個發育時期的小孢子結構并拍攝小孢子不同發育時期照片［10］。

1.2.3 低溫預處理

將在晴朗早晨（8：00 ~ 10：00）采集的處于單核期且發育良好的花蕾帶回實驗室，用保鮮袋保存于4℃冰箱，低溫預處理0、12、24、48、72 h，備用。

1.2.4 花藥愈傷組織誘導

培養基為MS，添加蔗糖30 g/L，pH 5.8，采用L9（33）正交試驗設計，研究2，4-D（1.0、2.0、3.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）組合對花藥愈傷組織誘導的影響。每瓶接種20 枚花藥，每處理共接種30 瓶，重復3 次。在25 ± 1℃下暗培養14 d 后，光照強度2 000 Lx，12 h/d 下培養。3 d 觀察一次，35 d 后統計愈傷組織誘導情況，計算愈傷組織誘導率。

1.3 數據統計與分析

試驗數據先用Excel 2017 進行基本統計與分析，再用SPSS 26.0 通過Duncan 分析法對各指標進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 桃金娘小孢子發育時期與花蕾形態特征的關系

觀察桃金娘不同大小花蕾（圖1）小孢子發育時期發現，桃金娘花粉母細胞通過減數分裂產生四分小孢子，進入四分體時期。不同發育時期的小孢子在形態上有較大差異，在光學顯微鏡下觀察同一平面一般只能看到3 個小孢子（圖2-A）。隨后四分孢子分開，進入單核期（圖2-B），直到細胞質中出現液泡，將細胞核從中心擠壓到靠近細胞壁，此時細胞處于單核靠邊期（圖2-C）。隨后花粉細胞進行第一次有絲分裂，此時細胞進入雙核期（圖2-D）。

圖1 處于不同發育時期的桃金娘花蕾Fig. 1 Buds in R. tomentosa at different development periods

圖2 桃金娘不同發育時期的小孢子Fig. 2 Microspores of R. tomentosa at different developmental stages

由表1 可知，桃金娘小孢子不同發育時期與花蕾橫縱徑大小密切相關。桃金娘小孢子從四分體時期向雙核期的發育過程中，其花蕾的橫徑、縱徑呈增長趨勢，花蕾橫縱徑比值也基本呈上升趨勢?；ɡ贆M徑、縱徑大小在桃金娘的不同發育階段都有顯著差異，并與小孢子發育時期呈正相關。桃金娘小孢子處于單核靠邊期時，花蕾橫徑為7.877 ±0.374 mm，縱徑為7.167 ± 0.340 mm，花瓣比花萼稍長。桃金娘小孢子不同發育時期花蕾大小不同，且外部形態不甚相似，說明桃金娘小孢子發育時期與花蕾外部形態密切相關。從四分體時期到雙核期，花蕾逐漸膨大，花瓣逐漸露出花萼，花藥顏色由淡黃色轉變為黃色，直至最后成熟花粉粒時花藥顏色為深黃色并伴隨濃烈芳香氣味。故花蕾橫縱徑大小和花藥顏色可以作為判斷小孢子發育時期的指標。小孢子處于單核靠邊期時，花藥顏色為黃色，此時期的花藥適宜用于愈傷組織誘導。

表1 桃金娘小孢子發育時期花蕾形態特征Tab. 1 Morphological characteristics of flower buds during microspore development in R.tomentosa

2.2 4℃低溫預處理時間對花藥愈傷組織誘導的影響

由表2可知，4℃條件下低溫預處理不同時間對桃金娘花藥愈傷組織誘導率有顯著影響，桃金娘花藥經過4℃低溫分別預處理0、12、24、48、72 h 后，花藥均能形成愈傷組織。預處理24 h 的效果最好，極顯著高于未經低溫處理（對照）下的7.11%，35 d 后愈傷組織誘導率達23.78%。

表2 低溫預處理對花藥愈傷組織誘導的影響Tab. 2 Effects of different pretreatments time on callus induction

2.3 生長調節劑對花藥愈傷組織誘導的影響

接種28 d，桃金娘花藥開始膨大，35 d時可見純白色或米黃色團狀愈傷組織，第4 次繼代至分化培養基中可見綠色胚狀體（圖3）。極差分析見表3，不同水平2，4-D 之間的極差最大，是影響桃金娘愈傷組織誘導的主導因子，6-BA 和NAA 是次要因子，2，4-D 2.0 mg/L處理下愈傷組織誘導率極顯著高于其他處理。方差分析表明，2，4-D 處理組間差異有統計學意義（P< 0.01），6-BA和NAA處理組間差異有統計學意義（P< 0.05）（F2，4-D= 27.513，F6-BA=4.286， FNAA= 4.435），不同處理組合之間愈傷組織誘導率Duncan 多重比較的結果（表3）表明，組合MS +2.0 mg/L 2，4-D + 1.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA的誘導率最高（30.82%）。

表3 植物生長調節劑組合對桃金娘花藥愈傷組織誘導的影響Tab. 3 Effects of plant growth regulator combinations on R. tomentosa callus induction

表4 植物生長調節劑組合對桃金娘花藥愈傷組織誘導影響的多重差異比較Tab. 4 Comparison of multiple differences in the effects of plant growth regulator combinations on the induction of R. tomentosa callus tissue

圖3 桃金娘花藥愈傷組織生長過程Fig. 3 R. tomentosa callus growth process

3 討論與結論

McCormick［13］研究認為，植物小孢子發育從母細胞開始到成熟花粉結束，分為母細胞、四分體、單核花粉、成熟花粉4 個時期。其中，在四分體時期，一些植物的4 個細胞核并不一定處于同一平面，而是以三維立體的形式出現。在百合科（Liliaceae）植物開口箭［Rohdea chinensis（Baker） N. Tanaka］、山麥冬［Liriope spicata（Thunb.） Lour.］中發現其四分體全部為左右對稱型［14-15］；而東方百合（Lilium OrientalHybrids）四分體則是左右對稱型和四面體型同時存在［16］。本試驗結果表明，桃金娘2 種類型的四分體都存在，其中四面體型占多數，偶見左右對稱型。

四分體時期是減數分裂的一個階段，此時花藥發育時期過早，小孢子尚未形成，幾乎不能成胚［17］；當小孢子發育成成熟花粉粒時的發育時期過晚，小孢子不具備脫分化能力［18］。因此，花藥培養需要合適的小孢子發育時期，選擇適宜的花粉發育時期對花藥誘導形成愈傷組織進行組培至關重要。不同植物的小孢子最適培養時期不同。謝淼等［19］對黃瓜（Cucumis sativusL.）花器形態發生、小孢子發育與花藥培養進行研究的結果表明，孢子發育時期與花蕾形態特征、花藥顏色具有相關性，黃瓜花藥培養中小孢子最佳培養時期為單核中后期。詹艷等［20］以10 個不同基因型黃瓜為試材進行游離小孢子培養，對成胚條件的系統研究結果表明基因型和小孢子發育時期是限制黃瓜游離小孢子成胚的關鍵因子，其中單核靠邊期是進行黃瓜游離小孢子培養的最佳時期。Takahata和Keller［21］研究認為，甘藍（Brassica oleraceavar.capitataLinnaeus）小孢子培養的最佳時期是單核靠邊期至雙核期。楊廷紅等［22］研究認為，單核靠邊期是進行湖北海棠［Malus hupehensis（Pamp.） Rehd.］游離小孢子培養的最佳時期。一般認為，單核靠邊期的小孢子離體培養成功率最高［23-25］，試驗結果與前人研究結果一致。

在小孢子或花藥培養時，常采用鏡檢方式確定發育時期，但該方式導致培養效率較低、過程繁瑣。在對金蓮花［26］（Trollius chinensisBunge）和黃花苜蓿［27］（Medicago falcataL.）等多種植物的研究中均發現，小孢子發育時期和花蕾外部形態密切相關；但對于不同的植物，處于相同發育時期的小孢子對應的花蕾及花藥外部形態指標值不同，在菜心［11］（Brassica rapa syn. Campestris ssp. Chinensisvar.UtilisTsen et LEE.）中單核靠邊期小孢子對應的花蕾縱徑為3.03 ~ 3.39 mm；而本研究通過對桃金娘花粉細胞染色，觀察發現桃金娘小孢子發育時期經歷四分體時期、單核中期、單核靠邊期及雙核期，最終發育成成熟花粉粒，且小孢子發育時期與花蕾外部形態、花藥顏色密切相關。桃金娘小孢子處于單核靠邊期時，花蕾橫徑為7.877 ± 0.374 mm，縱徑為7.167 ± 0.340 mm，玫紅色花瓣露出花萼，花藥黃色。因此，取材時可根據桃金娘花蕾形態、花藥顏色等外形指標來判斷小孢子發育時期，快速找到需要的時期，無需鏡檢，有利于提高小孢子培養效率。

小孢子培養受小孢子發育時期、基因型、處理方式、培養基成分等多種因素的影響［28-29］，通過低溫處理花藥可抑制形成紡錘絲的酶活性，從而快速得到單倍體?；ㄋ幣囵B中利用低溫處理花蕾，極大提高了花藥培養效率，且在多種植物上得到證實［30-32］。本研究發現通過低溫預處理桃金娘花藥，可以顯著提高花藥愈傷組織發生率，與前人研究結果一致?；ㄋ幱鷤M織的形成受多種因素影響，其中激素種類和濃度至關重要。許多實驗結果表明，在花藥啟動培養過程中，植物生長調節劑2，4-D 起主導作用［33-34］，本實驗與前人研究結果一致。

本試驗以桃金娘花藥為材料，分析了4℃低溫預處理和植物生長調節劑組合對桃金娘花藥愈傷組織發生率的影響，研究結果表明：低溫處理24 h，桃金娘花藥愈傷組織誘導率最高。2.0 mg/L 2，4-D對桃金娘花藥愈傷組織誘導影響極顯著，組合MS+ 2.0 mg/L 2，4-D + 1.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA的誘導率最高。