A型肉毒毒素作用于神經膠質細胞緩解神經病理性疼痛機制的研究進展

潘昱睿 王瑜元 白玉龍

摘 要 神經病理性疼痛是一個重要的臨床問題，常規藥物治療效果不佳。A型肉毒毒素可緩解多種疼痛，其鎮痛作用被認為與神經膠質細胞相關。本文概要介紹A型肉毒毒素作用于神經膠質細胞緩解神經病理性疼痛機制的研究進展，進一步探究A型肉毒毒素在神經病理性疼痛治療上的臨床潛力。

關鍵詞 神經病理性疼痛 A型肉毒毒素 神經膠質細胞

中圖分類號：R971； R961 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）03-0009-07

引用本文 潘昱睿， 王瑜元， 白玉龍. A型肉毒毒素作用于神經膠質細胞緩解神經病理性疼痛機制的研究進展[J]. 上海醫藥， 2024， 45（3）： 9-15.

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（82102663）

Research progress on mechanism of botulinum toxin type A acting on glial cells to relieve neuropathic pain

PAN Yurui， WANG Yuyuan， BAI Yulong

（Department of Rehabilitation Medicine， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Neuropathic pain is an important clinical problem that is poorly treated with conventional medications. Botulinum toxin type A relieves a wide range of pain， and its analgesic effects are thought to be associated with glial cells. This article summarizes the research progress of the mechanism of botulinum toxin type A acting on glial cells to relieve neuropathic pain， and further explores the clinical potential of botulinum toxin type A in the treatment of neuropathic pain.

KEY WORDS neuropathic pain； botulinum toxin type A； glial cells

神經病理性疼痛是由影響軀體感覺神經系統的各種損害或疾病引起的直接后果，表現為自發性疼痛、痛覺過敏（由傷害性刺激引起的痛覺增強）和觸誘發痛（由無害刺激引起的疼痛），以及睡眠剝奪、焦慮、抑郁等共病。A型肉毒毒素是革蘭陽性厭氧菌肉毒梭狀芽孢桿菌產生的一種神經毒素[1]，被廣泛用于治療肌張力障礙疾病，如眼瞼痙攣、面肌痙攣等。近年來，A型肉毒毒素在神經病理性疼痛治療上的應用逐漸增多并顯示有良好效果，但作用機制尚未完全明確。多項研究表明，神經膠質細胞尤其是小膠質細胞在神經病理性疼痛的發展、維持中起著重要作用[2-3]。本文概要介紹A型肉毒毒素通過作用于神經膠質細胞緩解神經病理性疼痛機制的研究進展。

1 A型肉毒毒素

肉毒毒素是肉毒梭狀芽孢桿菌產生的一類神經毒素，其中A型肉毒毒素已廣泛用于臨床。A型肉毒毒素由通過二硫鍵連接的輕鏈和重鏈組成，其輕鏈可裂解可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor， SNARE）而阻止神經遞質和神經肽的釋放。長期以來，A型肉毒毒素的鎮痛作用一直被認為源自于其肌肉松弛作用。但一項對神經病理性疼痛模型的研究顯示，A型肉毒毒素治療的肌肉松弛持續時間和疼痛緩解持續時間并不重疊，表明A型肉毒毒素具有獨立于肌肉松弛的鎮痛作用[4]。A型肉毒毒素不僅抑制乙酰膽堿釋放，還抑制其他神經遞質和神經肽釋放，如P物質、降鈣素基因相關肽等[5]。A型肉毒毒素被認為是一種用于治療神經病理性疼痛的三線止痛藥[6]。A型肉毒毒素治療神經病理性疼痛有效，但鎮痛機制尚未完全明確。

2 神經膠質細胞

小膠質細胞存在于大腦和脊髓的所有區域。作為一種巨噬細胞，小膠質細胞在神經組織的免疫和炎癥方面起著重要作用[7]。小膠質細胞活化表現為“小膠質細胞增生”，特征是顯著的細胞形態變化（肥大）、增殖和功能變化[3]。與小膠質細胞類似，星形膠質細胞也會在各種病理條件下被激活，導致“星形膠質細胞增生”，特征是細胞形態變化、增殖和星形膠質細胞標記的膠質纖維酸性蛋白水平顯著上調[8-9]。

3 神經膠質細胞在神經病理性疼痛中的作用

神經系統和免疫系統的相互作用對神經病理性疼痛的發展、維持起著重要作用[2]。研究顯示，正常情況下刺激小膠質細胞可導致痛覺過敏，表明小膠質細胞參與疼痛的產生[10]。神經損傷發生后，小膠質細胞通過改變形態和激活胞內炎癥通路，釋放促炎細胞因子，促進神經炎癥的發生、發展[11-12]。多種與疼痛相關的神經調質能作用于小膠質細胞，小膠質細胞表面廣泛表達的各種神經遞質受體、激素和神經調質受體在痛覺敏化中起著關鍵作用[13-14]。神經損傷會導致傷害性信息通過小膠質細胞胞內信號通路轉導，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）、核轉錄因子κB（nuclear transcription factor κB， NF-κB）、信號轉導及轉錄激活蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）等信號通路[12， 15]。

星形膠質細胞已被認為是另一種參與神經病理性疼痛發生、發展的神經膠質細胞。神經病理性疼痛信號的引入會上調星形膠質細胞中膠質纖維酸性蛋白的表達和多種活性物質的分泌[16]，進而促進神經病理性疼痛的發生、發展，介導中樞敏化的形成。神經損傷發生后，星形膠質細胞相對較晚地被激活，通常在小膠質細胞被激活之后，但在神經病理性疼痛持續時間內，星形膠質細胞保持活化狀態[17-18]。

4 A型肉毒毒素作用于小膠質細胞緩解神經病理性疼痛的機制

A型肉毒毒素、星形膠質細胞和小膠質細胞之間相互作用的主要證據大多來自對神經病理性疼痛動物模型的研究。

4.1 A型肉毒毒素通過P2X7受體促進小膠質細胞向M2表型的極化來緩解疼痛

在中樞神經系統，P2X7受體及其mRNA在小膠質細胞中的表達水平最高，在星形膠質細胞和少突膠質細胞中的表達量則低得多[19-20]。一項研究發現，小膠質細胞通過P2X7受體上調促炎細胞因子白介素-18水平來維持癌癥痛，驅動脊髓神經元過度活化和中樞敏化[21]。小鼠周圍神經損傷后，P2X7受體基因的缺失可顯著降低其引起的痛覺過敏[22]。這些研究結果表明，P2X7受體在神經病理性疼痛的發生、發展中起著重要作用。

小膠質細胞有M1、M2兩種表型。M1型小膠質細胞可增加各種促炎細胞因子的合成和釋放，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白介素-18等，激活鄰近神經元，導致痛覺過敏和疼痛持續[23]。M2型小膠質細胞則能分泌抗炎細胞因子，如白介素-4、白介素-10等。Higashi等[24]發現，P2X7受體可促進小膠質細胞向M1表型的極化，并釋放促炎細胞因子，而抑制這種極化，就可緩解疼痛。Wu等[25]的研究表明，在體、離體時P2X7受體表達水平的上調都會誘導脊髓小膠質細胞向M1表型的極化，且伴隨TNF-α、白介素-18的分泌。用BBG（一種P2X7受體的特異性拮抗劑）處理癌癥骨痛大鼠模型可顯著上調M2表型標志物（CD163、精氨酸酶-1）和抗炎細胞因子（白介素-4、白介素-10）的表達水平，同時下調M1表型標志物（誘異型一氧化氮合酶、CD86）和促炎細胞因子（TNF-α、白介素-18）的表達水平。這些數據表明，P2X7受體參與調節小膠質細胞的M1/M2表型極化。Gui等[26]的研究發現，在慢性壓迫損傷所致神經病理性疼痛大鼠模型中，A型肉毒毒素能通過下調P2X7受體表達水平而誘導小膠質細胞向M2表型的極化，提高大鼠的疼痛閾值。目前，盡管P2X7受體是如何誘導小膠質細胞向M2表型極化的尚不完全清楚，但可確定的是，A型肉毒毒素能夠通過P2X7受體促進小膠質細胞向M2表型的極化，故對于神經病理性疼痛，設法使小膠質細胞從促炎表型轉化為抗炎表型或許是一種新的有效治療策略。

4.2 A型肉毒毒素通過影響P2X4受體、p38 MAPK信號通路來緩解疼痛

P2X4受體是小膠質細胞上的另一種三磷酸腺苷受體。2003年，Tsuda等[27]首次在神經病理性疼痛研究中觀察到P2X4受體表達水平的變化：神經損傷后，脊髓中小膠質細胞P2X4受體的表達水平上調，而神經元和星形膠質細胞的P2X4受體表達水平卻無變化。阻斷P2X4受體能抑制神經損傷引起的觸誘發痛[27]。此后，越來越多的研究表明，小膠質細胞P2X4受體是神經病理性疼痛發生、發展的重要參與者。

p38 MAPK是神經膠質細胞中的重要信號通路，與疼痛介質的產生密切相關[28]。有研究觀察到選擇性神經損傷（spared nerve indury）大鼠脊髓小膠質細胞P2X4受體、p38 MAPK、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）的表達水平上調[29]，而小膠質細胞P2X4受體能通過激活并誘導p38 MAPK信號通路釋放BDNF、p38或MAPK的抑制因子來減弱這一現象[30-31]。一項研究表明，A型肉毒毒素可通過抑制小膠質細胞P2X4受體- p38 MAPK信號通路而影響小膠質細胞的活化[32]。P2X4受體、p38 MAPK信號通路在A型肉毒毒素緩解神經病理性疼痛中起著重要作用。

4.3 A型肉毒毒素通過靶向Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR）2-髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）信號通路裂解突觸體相關蛋白（synaptosomal-associated protein， SNAP）-23來緩解疼痛

SNARE是A型肉毒毒素的作用靶點。既往體外、體內研究表明，SNAP-23而不是SNAP-25在A型肉毒毒素對小膠質細胞的影響中起著重要作用[33-34]。在小膠質細胞表面表達的眾多受體中，TLR家族特別是TLR2和TLR4代表了小膠質細胞活化和神經損傷之間的可能聯系[35-36]。MyD88是介導TLR效應的最重要胞內途徑。小膠質細胞被激活后，其表面TLR能通過TLR- MyD88信號通路激活并促進NF-κB合成細胞因子，如TNF-α、白介素-1β等[37]。

Piotrowska等[33]發現，A型肉毒毒素能通過抑制胞內信號通路（NF-κB、p38、胞外調節蛋白激酶1/2信號通路）的活化來阻止內毒素誘導的促炎細胞因子的釋放。這與先前對巨噬細胞的研究結果一致：A型肉毒毒素可減少MAPK的磷酸化[38]；NF-κB、p38、胞外調節蛋白激酶1/2信號通路與神經炎癥的發生、發展密切相關。相關研究顯示，A型肉毒毒素能下調神經病理性疼痛大鼠小膠質細胞TLR2、MyD88的表達水平，但對TLR4表達水平沒有影響[33， 39]。最近，研究者們注意到了TLR與SNARE之間的相互作用問題。Nair-Gupta等[40]的研究發現，依賴MyD88的TLR信號通路參與樹突狀細胞吞噬小體上SNAP-23的磷酸化。磷酸化的SNAP-23可穩定SNARE復合體，導致吞噬小體與內質體再循環區室融合，最終形成交叉呈遞。在小膠質細胞中可觀察到類似現象[1]。因此，可以推斷，抑制小膠質細胞中的TLRMyD88- NF-κB信號通路就能減少SNAP-23。既往在對小膠質細胞體外模型和慢性壓迫損傷所致疼痛大鼠模型的研究中都觀察到，A型肉毒毒素可下調小膠質細胞SNAP-23表達水平，且在對慢性壓迫損傷所致疼痛大鼠模型的研究中進一步發現，A型肉毒毒素通過兩種表觀遺傳修飾下調SNAP-23表達水平：一方面，A型肉毒毒素通過抑制κB抑制因子激酶磷酸化來抑制SNAP-23的表達和磷酸化；另一方面，A型肉毒毒素通過泛素介導的SNAP-23降解來減少SNAP-23的表達[33， 39]?？傊?，A型肉毒毒素似能通過抑制TLR2- MyD88信號通路而下調SNAP-23表達水平并減少其磷酸化，進而阻止促炎細胞因子的產生。

4.4 A型肉毒毒素上調沉默信息調節因子1（silent information regulator 1， SIRT1）表達水平使NF-κB、p53、PI3K-蛋白激酶B信號通路失活來緩解疼痛

SIRT1已被證實是防治神經病理性疼痛的潛在靶點[41-42]。SIRT1存在于細胞核和細胞質中，主要作用是使細胞核內的p53、NF-κB等轉錄因子去乙?；痆43-44]。在各種神經病理性疼痛動物模型的脊髓中均觀察到，SIRT1的表達水平較低[45-46]。研究發現，持續性痛覺過敏和慢性壓迫損傷所致疼痛與脊髓中SIRT1表達水平降低有關，而鞘內注射SIRT1激動劑SRT1720則可上調SIRT1表達水平，進而通過抑制NF-κB乙?；妥钄郥NF-α、白介素-6等促炎細胞因子的釋放來緩解神經病理性疼痛[47]。這些研究結果表明，脊髓中的SIRT1在神經病理性疼痛發生、發展中起著重要作用。

近期，一項對脊髓損傷大鼠模型的研究發現，A型肉毒毒素在體內、體外均能顯著上調SIRT1表達水平，從而使NF-κB、p53、PI3K-蛋白激酶B等炎癥和損傷相關信號通路失活，減輕炎癥和氧化應激[46]。若再聯合米諾環素處理，效果更明顯[46]。p53是細胞凋亡途徑中的關鍵分子之一，其表達上調可直接誘導細胞凋亡[48]。一項對體內、體外脊髓損傷模型的研究發現，SIRT1可能通過p53信號通路抑制神經元凋亡[49]。一項小膠質細胞培養研究發現，傷害性趨化因子-1會深度激活小膠質細胞的PI3K-蛋白激酶B信號通路[50]。進一步的體內研究顯示，鞘內注射PI3K抑制劑LY29400不僅能顯著降低骨癌痛動物模型脊髓中的小膠質細胞水平，而且可降低骨癌痛引起的機械性痛覺過敏[50]。這些研究結果表明，A型肉毒毒素可能通過上調SIRT1表達水平使NF-κB、p53、PI3K-蛋白激酶B信號通路失活，最終減輕神經炎癥。

5 A型肉毒毒素作用于星形膠質細胞緩解神經病理性疼痛的機制

許多研究表明，抑制星形膠質細胞活化可減輕各種疼痛動物模型的疼痛[51-53]，但A型肉毒毒素對星形膠質細胞的作用尚不明確。Marinelli等[34]的研究發現，A型肉毒毒素系通過裂解脊髓星形膠質細胞中的SNAP-25而產生神經病理性疼痛緩解作用的。其他研究也顯示，在經A型肉毒毒素處理后的脂多糖激活的培養星形膠質細胞[54]和脊髓背角星形膠質細胞（慢性壓迫損傷所致疼痛模型[34， 55]和脊髓損傷模型[56]）中檢測到裂解的SNAP-25。不過，多項體外研究證實，A型肉毒毒素不影響脂多糖刺激的培養星形膠質細胞的促炎細胞因子（白介素-1β、白介素-6、白介素-18、一氧化氮合酶2）和抗炎細胞因子（白介素-1受體拮抗劑、白介素-10、白介素-18結合蛋白）的釋放。此外，A型肉毒毒素不影響脂多糖處理的培養原代星形膠質細胞中MAPK、p38、胞外調節蛋白激酶1/2和NF-κB信號通路的活化，對TLR2、TLR4的表達水平亦無影響[33]。Holm等[57]的研究發現，星形膠質細胞對TLR2和TLR3激動劑的反應較強，對TLR4激動劑的反應完全依賴于功能性小膠質細胞的存在。A型肉毒毒素對星形膠質細胞的直接影響似乎較為輕微。

6 A型肉毒毒素作用于少突膠質細胞緩解神經病理性疼痛的機制

有關少突膠質細胞在慢性疼痛發病機制中所起作用的研究較少。在部分視神經脊髓炎（一種脫髓鞘疾?。┗颊咧锌蓹z測到針對髓鞘少突膠質細胞糖蛋白的自身抗體[58]。相當部分的多發性硬化癥（另一種脫髓鞘疾?。┗颊邥霈F慢性疼痛[59]，其特征是自身免疫介導的少突膠質細胞丟失，這表明人類少突膠質細胞的破壞與疼痛之間可能存在一定的關聯。使用白喉毒素對成年小鼠少突膠質細胞進行實驗性消融，小鼠會發生持續幾周的神經病理性疼痛，且疼痛的發生不依賴適應性免疫細胞或反應性小膠質細胞和星形膠質細胞[60]，表明少突膠質細胞可能獨立于免疫因素或反應性小膠質細胞和星形膠質細胞而在疼痛中起著作用。Zarpelon等[61]的研究發現，少突膠質細胞是慢性壓迫損傷所致疼痛模型誘導產生白介素-33的主要細胞，而缺乏白介素-33受體ST2的小鼠表現出疼痛減輕。此外，鞘內注射白介素-33會引起幼年小鼠的超敏反應，并增強其神經損傷后的機械性痛覺過敏，由白介素-33介導的痛覺過敏依賴于促炎細胞因子TNF-α和白介素-1β。因此，少突膠質細胞在痛覺中的作用可能與初級傳入神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞的作用交織在一起。少突膠質細胞對創傷性脊髓損傷高度敏感，并易因脊髓損傷而發生凋亡[62]?？傮w來說，目前有關A型肉毒毒素對少突膠質細胞作用的研究較少，二者間的相互作用尚不明確。

7 小結

神經病理性疼痛的發病機制復雜，且臨床上缺乏有效的治療方法。既往研究表明，A型肉毒毒素通過影響小膠質細胞極化、抑制小膠質細胞胞內炎癥通路、裂解SNAP-23，以及上調SIRT1表達水平使NF-κB、p53、PI3K-蛋白激酶B信號通路失活等機制來緩解神經病理性疼痛。星形膠質細胞通過受體、連接蛋白與神經元及其他神經膠質細胞密切聯系，在神經病理性疼痛發生、發展中也起著重要作用。少突膠質細胞在疼痛中的作用及其與A型肉毒毒素的相互作用尚不明確，其在痛覺調制中的作用可能與初級傳入神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞的作用交織在一起。A型肉毒毒素對神經膠質細胞的作用很復雜，加之實驗模型的多樣性和膠質細胞胞內炎癥通路的復雜性，目前仍不能對A型肉毒毒素的作用機制作出統一的解釋。但可推斷的是，鑒于研究發現存在多種作用機制，A型肉毒毒素在神經病理性疼痛治療方面具有相當的潛力。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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