BSA聯合轉錄組分析發掘西瓜葉片黃化候選基因

張朝陽, 程 瑞, 徐兵劃, 顧 妍, 黃大躍, 孫玉東

(江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所/淮安市設施蔬菜重點實驗室,江蘇 淮安 223001)

葉片是植物進行光合作用最主要的器官,對植物的生存具有重要意義,葉片顏色在很大程度上決定了植物的光合效率[1]。植物葉色突變不僅是研究葉綠素相關基因功能及植物發育的重要材料[2],也是優良的形態標記性狀,在實際生產中常被用來進行品種純度鑒定[3]。關于水稻、大麥、小麥、玉米、棉花、大豆、蠶豆、番茄、擬南芥等多種植物葉色突變的研究已有報道[4],葉色突變類型豐富多樣,包括白化、黃化、黃綠化等[5-6]。植株葉色的形成不僅受到葉綠體生物合成途徑、葉綠素降解途徑、血紅素代謝途徑、類胡蘿卜素代謝途徑等與光合色素代謝途徑相關基因的影響,受到與葉綠體發育相關基因的調控,還與光、溫度、植物激素、礦物元素和金屬離子等外界環境因素息息相關[6-9]。目前,關于水稻、玉米、擬南芥等模式植物中葉色的研究較為深入,水稻、玉米中已報道的葉色突變體均超200個[10-13],對擬南芥的研究發現,葉色突變以隱性遺傳為主,目前已經發現27個編碼15種葉綠素生物合成酶的核基因,它們的任何異常突變都會導致葉綠素缺乏,從而產生黃色突變[14]。近年來,隨著高通量測序技術的應用,關于辣椒、甜瓜和黃瓜等一些重要經濟作物的葉色突變研究也逐漸展開[15-19]。

西瓜是全球十大水果之一,中國西瓜栽培面積和消費量均居世界首位。隨著雜交育種的發展,西瓜育種已基本實現雜種一代化,對制種純度提出了更大挑戰,葉形、葉色雖是重要的形態標記性狀,但尚未應用于育種中。西瓜的遺傳基礎狹窄,自然突變率低,目前有關西瓜葉色突變的報道有斑駁突變類型[20]、白化突變類型[21-22]、不完全顯性黃葉突變類型[22]、后綠突變類型[23]、黃化突變類型[24-25]等,但研究主要集中于遺傳規律、生理特性[21-25]。西瓜基因組的公布和測序技術的快速發展為西瓜重要性狀定位、關鍵基因功能研究奠定了重要生物學基礎[26-29]。Kidanemariam[30]發現,西瓜后綠突變體Houlv中的ClCG03G010030基因存在1個單核苷酸多態性(SNP)變異,導致該基因編碼的FtsH胞外蛋白酶序列中精氨酸突變為賴氨酸,FtsH蛋白主要參與葉綠體早期發育,進而影響西瓜葉片顏色。Zhu等[25]對葉片黃化突變西瓜材料w-yl進行精細定位,認為基因Cla97C02G036040、Cla97C02G036050和Cla97C02G036060可能是導致西瓜葉片黃化的主要基因。探索葉片顏色變異機制可為遺傳改良提供理論依據,滿足人們在生產、選種和育種等方面的需求;開發葉色形態標記,能夠有效縮短育種周期,提高育種效率與制種純度。本研究擬以全生育期葉片黃化西瓜材料ly104和綠葉西瓜材料w3為試驗材料,通過混合分組分析(BSA)測序初步定位葉片黃化基因在染色體中的位置,進一步利用簡化基因組(RAD)測序開發全基因組SNP分子標記,利用F2代群體構建高密度遺傳圖譜進行西瓜葉片黃化基因定位,結合轉錄組測序及基因功能注釋鎖定關鍵候選基因。本研究結果可為進一步全面解析西瓜葉片黃化基因及其生物學功能奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2014年,利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變獲得的穩定遺傳的葉片黃化西瓜材料,經5代連續自交獲得相對純合的葉片黃化突變材料ly104。本研究以ly104為母本(P1),以正常綠葉西瓜材料w3為父本(P2)構建F1代、F2代、BC1代群體,群體的構建與表型調查試驗均于淮安市農業科學研究院科研創新基地進行,群體配制過程嚴格自交、雜交,整個生育期采取商品化管理。

1.2 形態觀察與遺傳規律分析

以第1張完全展開的真葉進行表型統計與分析,采用人工觀察和便攜式色差儀RM200QC(愛色麗X-Rite,美國)對葉片顏色指數進行測定,測定指標為亮度值(L*)、紅綠值(a*)和黃藍值(b*)3個顏色參數。對F1代、F2代、BC1代群體分離表型進行統計,分析西瓜葉片黃化遺傳規律,并進行卡方檢驗。

1.3 通過BSA測序進行葉片黃化初定位

BSA測序即混合分組分析法,是一種簡單快速的目標性狀定位方法,已被廣泛應用于多種園藝作物重要性狀的基因定位[31]。本研究從F2代西瓜群體中選取黃葉、綠葉極端表型植株各20株,采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[32]提取植株幼葉基因組DNA并檢測其濃度,通過等量混勻構建2個極端混池,利用親本DNA構建親本池進行測序分析,送至上海凌恩生物科技有限公司,利用Illunima HiSeq 4000進行測序,親本測序深度為10×,混池測序深度為20×,測序讀長為150 bp。對原始序列(Read)進行過濾,去除接頭,過濾掉包含未確定堿基(N)>15%和低質量的read(質量值≤20的堿基數占整個Read的10%以上),將獲得的干凈序列(Clean read)用于后續分析。使用BWA軟件[33]將高質量的Clean read映射到西瓜基因組97103v2(http://cucurbitgenomics.org/organism/21)上。然后用GATK[34]、SnpEff[35]軟件對突變位點進行檢測和注釋,用SNP-index算法進行關聯分析,閾值為0.5。

1.4 西瓜高密度遺傳圖譜的構建

為了更精確地定位獲得西瓜葉片黃化突變位點,本研究根據F2代群體中黃葉、綠葉分離比選取共100份單株,分別提取基因組DNA,采用RAD建庫方式構建長度范圍在300～500 bp的雙端文庫。將產物送至上海凌恩生物科技有限公司,利用Illunima HiSeq進行測序,測序讀長為150 bp。對原始Read采用以下標準進行質控:(1)去除Read中的接頭序列;(2)修剪測序質量較低的Read末端(測序質量值小于Q20);(3)去除含N比例達到10%的Read;(4)舍棄接頭及質量修剪后長度小于100 bp的小片段。用BWA軟件將Clean read比對至參考基因組97103v2,并對映射結果進行統計分析。用GATK軟件進行變異位點檢測獲得SNP。對獲得的SNP按以下標準進行過濾:(1)去除比對Read質量值小于20的位點,同時過濾掉缺失率大于50%的SNP;(2)刪除無義SNP位點;(3)用joinmap 4.0軟件[36]對過濾后的SNP進行卡方測驗,先后過濾掉P<0.01和缺失率30%以上的標記,對于最終獲得的SNP,采用joinmap 4.0軟件進行西瓜遺傳圖譜構建,選用Kosamb’s參數。

1.5 轉錄組分析

從親本及其F2代群體中取ly04和w3單株各3份,當第1張真葉完全展開后取樣進行轉錄組分析。用Plant RNA Purification Reagent試劑盒(購自上海凌恩生物科技有限公司)提取植物總RNA,并構建轉錄組測序文庫。送至上海凌恩生物科技有限公司采用Illumina HiSeq進行測序,Read長度為150 bp。測序數據經質控過濾獲得Clean read,用Hisat2軟件[37]將其映射到西瓜基因組97103v2上。用每個基因在一個樣本中所對應的基因轉錄本數(FPKM)計算基因表達水平?；贙EGG (http://www.genome.jp/kegg/)和GO(http://www.geneontology.org/)數據庫進行基因注釋和功能分析。差異表達基因以差異倍數(Foldchange)≥1.5、P≤0.005為標準。

1.6 候選區域功能注釋與候選基因篩選

結合遺傳規律分析及BSA,利用RAD測序開發全基因組SNP標記,加入葉色表型標記進行西瓜2號染色體圖譜的構建,對西瓜葉片黃化基因進行定位。以97103v2為參考基因組對定位區間基因進行注釋,通過基因序列分析及轉錄組測序差異表達情況分析進一步篩選并確定候選基因。

2 結果與分析

2.1 西瓜葉片黃化特性及遺傳規律分析

經EMS誘變獲得葉片黃化的西瓜材料,經5代連續自交后,獲得遺傳穩定的葉片黃化材料ly104,該材料從子葉期至果實收獲時的葉片均保持黃化狀態(圖1A)。通過對ly104、w3的葉片顏色指標進行測定,發現葉片黃化西瓜材料與綠葉西瓜材料在葉片顏色指標上存在極顯著差異(圖1B)。

A:表型;B:顏色指數。L*:亮度(閾值0～100);a*:紅綠色范圍(閾值-128～+127);b*:黃藍色范圍(閾值-128～+127);MT:突變體葉片黃化材料;WT:野生型材料。**表示不同材料間差異極顯著(P<0.01)。

表1 F2代和BC群體中葉片黃化突變型與野生型的分離比

2.2 西瓜葉片黃化基因的BSA初定位

原始Read經質控過濾,2個混池共獲得12.4 Gb高質量Clean read,Q30在93.0%以上,與參考基因組97103v2的平均比對率在98.0%以上。使用GATK軟件進行變異檢測,共獲得523 303個SNP,經過濾后用SNP-Index算法對性狀相關侯選區域進行選擇,作圖窗口大小為1 Mb,作圖步移為10 kb,閾值為0.5,結果表明,西瓜葉色黃化基因定位于2號染色體8 490 001～26 410 000 bp(大小約為17.92 Mb)(圖2A)。

2.3 高密度西瓜遺傳圖譜的構建與葉片黃化基因的定位

根據分離比,從F2代群體中選取76株綠葉、24株黃葉西瓜單株進行RAD測序,共獲得69.17 Gb高質量Clean read,Q30在91.3%以上,與參考基因組的平均比對率在97.6%以上。使用GATK軟件進行變異檢測,共獲得229 704個SNP,經過濾篩選,最終確定4 273個SNP用于西瓜高密度遺傳圖譜的構建。西瓜遺傳圖譜總長度為1 602.44 cM,平均遺傳距離為0.39 cM,最大間隔為7.38 cM(表2)。

表2 西瓜高密度遺傳圖譜構建結果

為了進一步精確定位西瓜葉片黃化基因,用RAD測序結果對西瓜2號染色體上的SNP標記進行過濾篩選,剔除檢測率低于40%的樣品單株和標記,最終用91份單株(68份綠葉,23份黃葉)、286個SNP標記進行葉片黃化基因定位,葉片顏色標記(Leafcolor)用綠葉(D)、黃葉(B)表示,用joinmap4進行西瓜葉片黃化基因的定位。結果顯示,Leafcolor定位于Clas97Chr02-13950306與Clas97Chr02-15517591標記之間(大小約為1.567 Mb)(圖2B),以西瓜97103v2為參考基因組,該區間包含24個注釋基因(圖2C、表3)。

表3 候選區間注釋基因

A:BSA定位結果。B:西瓜2號染色體遺傳圖譜及葉色黃化標記定位。C:根據西瓜參考基因組97103v2注釋候選區域的基因。SNP index:單核苷酸多態性指數。

2.4 西瓜黃化葉片轉錄組分析及候選基因的篩選

RNA-seq共檢測12個樣本,其中P1、P2分別選取3個樣本,F2代群體中葉片黃化類型、綠葉類型分別選取3個樣本,每個樣本平均獲得6.4 Gb高質量Clean read數據,Q30在92.0%以上,平均基因組比對率為91.4%。分別以P2G(親本綠葉)與P1Y(親本黃葉)和F2G(F2代綠葉)與F2Y(F2代黃葉)為對比組進行獨立分析,其中P2G與P1Y對比組中共檢測到1 356個差異表達基因,其中上調表達的基因529個,下調表達的基因827個;F2G與F2Y對比組中共檢測到4 180個差異表達基因,其中上調表達的基因1 378個,下調表達的基因2 802個(圖3A,圖3B)。P2G與P1Y對比組和F2G與F2Y對比組中均顯著下調表達的基因共有327個、均顯著上調表達的基因共有132個(圖3A)。以上結果表明,親本中黃葉和綠葉差異表達基因數量顯著小于F2代群體,說明P1和P2已相對純合;GO和KEGG富集分析結果表明,差異表達基因富集通路多與光合、應激反應等有關,說明黃葉和綠葉西瓜植株在光合作用等方面存在較大差異。

對西瓜2號染色體13 950 306～15 517 591 bp(大小約為1.56 Mb)內的24個注釋基因進行功能分析和轉錄組表達差異分析,結果顯示,24個注釋基因中有17個在植株葉片中表達,僅有基因Cla97C02G036060、Cla97C02G035950、Cla97C02G036010、Cla97C02G036020在葉片黃化植株與綠葉植株中的表達存在顯著差異,Cla97C02G036060在P2G和F2G中均顯著上調表達(圖3C),其注釋功能為Ycf2蛋白編碼基因,該編碼基因為被子植物中最重要的質體基因,與植物光合作用有關。

A:P2G與P1Y對比組及F2G與F2Y對比組上調和下調基因數量Venn圖;B:P2G與P1Y對比組及F2G與F2Y對比組上調和下調基因數量柱形圖;C:F2G與F2Y對比組差異基因火山圖,標注基因為候選區間基因。P1Y:親本黃葉;P2G:親本綠葉;F2G:F2代綠葉;F2Y:F2代黃葉。

3 討論與結論

化學EMS誘變是人工創造突變體最常用的處理方式之一,葉片黃化是最常見的誘變表型[22]。筆者所在課題組前期通過EMS誘變西瓜種子,獲得穩定遺傳的西瓜葉片黃化材料,其整個生育期均可保持黃化狀態。植物葉片黃化突變,又稱葉綠素缺乏突變,通常是由葉綠素合成或降解途徑被破壞所致[38]。目前,研究者已經在水稻[39]、番茄[40]、黃瓜[19]、擬南芥[41]等植物中發現了黃化突變體。有研究發現,不同類型的葉色突變的遺傳規律差異較大,有些葉色突變可能是核遺傳,也可能是細胞質遺傳,水稻[42]、玉米[43]、小麥[44]、黃瓜[45]、番茄[46]等都由1對或2對隱性核基因控制。Zhang等[21]研究證實,西瓜葉片白化突變是由1對隱性等位基因(jaja)控制的。Provvidenti[20]發現,西瓜葉色斑駁突變由1對隱性基因(slv)控制。Kidanemariam等[30,47]發現,西瓜葉色后綠突變是由1個隱性基因(dgdg)控制的。Zhu等[25]研究發現,西瓜黃化突變體w-yl由1對隱性核基因控制,與本研究結果一致。

西瓜作為重要的園藝經濟作物[48-51],在中國的栽培面積和產量均居世界首位。經長期人工選擇,栽培西瓜遺傳背景狹窄,多態性分子標記開發受限,致使西瓜分子標記輔助育種及品種改良進展緩慢。高密度遺傳圖譜的構建不僅是開發西瓜重要農藝性狀遺傳基因/QTL緊密連鎖分子標記的重要手段,亦是深入挖掘和解析西瓜重要農藝性狀基因的基礎,通過遺傳圖譜構建進行基因/QTL定位研究已經在西瓜多種性狀研究中得到成熟應用[52-53]。本研究基于BSA定位,將西瓜葉片黃化基因定位于2號染色上,為了進一步獲得可靠定位基因,本研究開發了SNP標記,用于構建高密度西瓜遺傳圖譜,并將西瓜葉片黃化基因定位到2號染色體13 950 306～15 517 591 bp(大小約為1.56 Mb),比對西瓜參考基因組97103v2發現,在候選區段內包含24個注釋基因,17個基因在葉片中表達,4個基因在黃葉與綠葉轉錄組分析中存在顯著差異表達,其中基因Cla97C02G036060是Ycf2蛋白的編碼基因,Ycf2/FtsH調控的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-蘋果酸脫氫酶是葉綠體或非光合質體在黑暗中產生腺嘌呤核苷三磷酸的關鍵酶[54],是光合生長必需的酶[55]。目前,Ycf2基因已被證實是被子植物中最重要的質體基因[56],它在高等植物中發揮著重要功能[57]。在本研究中,由于雙親重測序深度不高,候選區間注釋基因編碼區中未發現可靠突變,但轉錄組結果顯示,Ycf2在葉片黃化西瓜材料中的表達量顯著下調,說明葉片黃化西瓜材料的光合作用系統可能與正常綠葉植株光合系統存在顯著差異,相關機制需要進一步研究。本研究結果可為進一步挖掘葉片黃化植株光合作用機制奠定一定科學基礎。