綠色草莓再生體系的建立

潘嬌艷, 肖世偉, 夏 瑾, 倪知游, 鄒雨婷, 喬玉山,

(1.南京農業大學園藝學院,江蘇 南京 210095; 2.江蘇省農業科學院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京 210014)

建立高效的離體再生體系是構建遺傳轉化體系的基礎,也是開展植物基因工程研究必要的前提條件之一,對于進一步利用轉基因、基因編輯等技術研究草莓基因功能、品種改良及種質創新具有重要意義。不同草莓品種的再生效率及遺傳轉化效率存在較大差異,一些栽培草莓(Fragaria×ananassaDuch.)品種的再生體系及遺傳轉化體系已經建立,如全明星[1]、早紅[2]、晶瑤[3]、紅顏[4]等。野生草莓擁有風味獨特、抗逆性強等優良性狀,是改良栽培品種的潛在資源[5]。國外已經建立了部分森林草莓(F.vesca)高效、穩定的再生體系及遺傳轉化體系[6-9];國內也建立Hawaii 4[10]、Ruegen[11]、Yellow Wonder[12]等森林草莓的再生體系,但這些株系的遺傳轉化體系還需要進一步研究。黃毛草莓(F.nilgerrensisSchltdl. ex J.Gay)莖尖培養體系、組培苗快繁體系、葉片離體再生體系也先后建立起來[5,13]。綠色草莓(FragariaviridisWeston)屬于二倍體野生草莓,具有抗逆性強、果實硬度高等優良性狀,同時具有基因組小等優點,在栽培草莓品種改良上具有利用價值[14],但關于其再生體系及遺傳轉化體系的研究還比較少。本研究擬以田間自然生長的綠色草莓匍匐莖為外植體,從初代培養開始逐步研究綠色草莓的再生體系,以期為其遺傳轉化體系的建立奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用綠色草莓的株系為GE-39。2021年4-6月采集田間幼嫩匍匐莖進行初代培養,進而獲得試管苗,其他培養材料為試管苗的幼葉及由其誘導產生的愈傷組織。

基本培養基為MS培養基或1/2 MS培養基,均附加3.0%蔗糖和0.7%瓊脂,121 ℃/116 ℃滅菌20 min/30 min。高溫滅菌前,將培養基的pH值調節至5.8～5.9。培養室溫度為(25±1) ℃,光照周期為16 h/8 h,光照度為2 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 試管苗的建立 將田間取回的匍匐莖用流水沖洗3～5 h,在超凈工作臺將匍匐莖保留3～5 cm的莖尖用70%的乙醇消毒30～40 s,消毒結束時用無菌水沖洗3～4次,再用10%的次氯酸鈉消毒10 min,用無菌水再次沖洗3～4次,用滅菌濾紙吸干莖尖表面水分,切除莖尖下端少許,然后接種到MS、MS+0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L赤霉素(GA3)初代培養基中,每瓶接種1個莖尖,觀察并記錄莖尖的生長狀況,30 d后統計成活率。

1.2.2 試管苗的增殖 莖尖在初代培養基中成活后獲得試管苗,將長勢相近的試管苗接種至不同增殖培養基中。增殖培養基以1/2 MS為基本培養基,植物生長調節劑組合為:6-BA與吲哚丁酸(IBA)、6-BA與GA3、6-BA與吲哚乙酸(IAA)。6-BA質量濃度梯度設置為0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L,IBA、GA3、IAA的質量濃度梯度均設置為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L。每個培養基接種3株試管苗,觀察并記錄植株的生長狀況,培養28 d后對比不同處理對綠色草莓增殖系數(增殖系數=再生芽總數/接種芽數)的影響。

1.2.3 不同植物生長調節劑組合對葉盤脫分化的影響 選取葉齡為30 d的健康試管苗葉片,剪去葉片四周少許,再沿垂直于葉片中脈方向橫切,形成近似方形且大小相近的葉盤。將葉盤背面朝下平鋪于葉盤脫分化培養基中,均勻擺放。葉盤脫分化培養基以MS為基礎培養基,并設置不同植物生長調節劑組合(表1)。每個培養基放置8～15個葉盤,暗培養7 d后分為兩部分,一部分繼續放在黑暗環境中培養,另一部分置于光下培養。每天觀察并記錄葉盤的生長狀況、愈傷組織的發生情況,每隔14 d更換一次培養基。培養30 d后計算出愈率(出愈率=長出愈傷組織的葉盤數/接種的葉盤總數×100%)。

表1 葉盤脫分化培養基

1.2.4 不同植物生長調節劑組合對愈傷組織再分化的影響 本研究發現葉盤在適宜脫分化培養基中產生的愈傷組織經相同培養基繼代培養后,漸漸出現褐化甚至死亡的現象,不產生不定芽,因此需探索適宜的愈傷組織再分化培養基。將愈傷組織接種至不同的愈傷組織再分化培養基(表2)中,基礎培養基為1/2 MS,每個培養基放置4～6個愈傷組織。在培養過程中統計愈傷組織再分化率(再分化率=可再分化的愈傷組織數/接種的愈傷組織數×100%)及平均分化芽數(平均分化芽數=不定芽總數/可再分化的愈傷組織數),并記錄再生不定芽的生長狀態。

表2 愈傷組織再分化培養基

1.2.5 試管苗生根誘導及煉苗移栽 選擇生長狀況良好且長勢相近的試管苗接種至不同的生根培養基中,生根培養基以1/2 MS為基礎培養基,植物生長調節劑為IAA、IBA、IBA+IAA。IAA、IBA的質量濃度均設置為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L,每個培養基接種3株試管苗,培養30 d后記錄試管苗根系的生長狀況、苗的長勢并統計生根率。

將試管苗或再生的芽接種到最佳生根培養基中,經過30 d的生根培養后,對根系健壯的試管苗開蓋放置3～5 d,煉苗期間注意觀察試管苗的生長狀況,及時向葉面噴水補充水分。煉苗結束后洗凈幼苗根部培養基,并用多菌靈水溶液浸泡根系10 s。將草莓苗移栽至經高溫消毒的基質中,基質成分包含營養土、蛭石與珍珠巖,其體積比為9∶3∶1,在室溫條件下緩苗2～3 d后轉移至適宜環境中,30 d后統計成活率,成活率=成活植株數/總移栽植株數×100%。

2 結果與分析

2.1 綠色草莓試管苗的建立

試管苗的建立是綠色草莓再生體系建立的首要步驟,本研究對綠色草莓初代培養的研究結果表明,在不添加任何激素的MS培養基中莖尖的成活率相對較低,為13.3%,長勢較弱且褐化相對嚴重;而接種在MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培養基中的莖尖生長發育較為健康且能保持較為活躍的生命力,褐化現象較少。其中,在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培養基中,莖尖的生長狀況最為活躍,成活率最高,為46.6%,且有少量側芽萌發(圖1),而在MS+0.5 mg/L 6-BA培養基中莖尖的成活率僅為26.6%,因而添加GA3的培養基更適用于綠色草莓的初代培養。綠色草莓的初代建立需要經過一系列的消毒步驟,莖尖的生活力受到影響,因此與增殖培養相比,初代建立所需要的時間更長。

A:綠色草莓莖尖在MS+0.2 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)+0.2 mg/L赤霉素(GA3)培養基中培養0 d時的生長狀況;B:綠色草莓莖尖在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培養基中培養30 d時的生長狀況。

2.2 不同培養基對試管苗增殖的影響

不同植物生長調節劑組合對綠色草莓的增殖效果不同,但綠色草莓增殖系數的高低主要由6-BA決定。在含有0.2 mg/L IAA的增殖培養基中,綠色草莓的增殖系數隨著6-BA質量濃度的升高而提高;但是當綠色草莓的增殖系數過高時,幼苗在有限的空間內相互擠壓,植株的生長勢變弱,表現出根系短小、莖葉細弱、略有黃化的現象。在培養基中包含0.1 mg/L的6-BA時,添加0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L的IBA或IAA,均可獲得明顯的增殖效果,且植株形態正常,生長狀況良好;而添加0.3 mg/L的GA3時,增殖效果一般,但植株更健壯,葉片肥大鮮綠(圖2A)。綜合分析,當培養基中添加0.1 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IBA時,綠色草莓的增殖效果最好,增殖系數為6.4,所誘導產生的草莓苗不但健壯而且葉片鮮綠(圖2B)。

A:綠色草莓在1/2 MS+0.1 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)+0.3 mg/L赤霉素(GA3)培養基中培養28 d時的生長狀況;B:綠色草莓在1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L吲哚丁酸(IBA)培養基中28 d時的生長狀況。

2.3 不同培養基對誘導葉盤脫分化的影響

使用不同培養基誘導葉盤脫分化的研究結果表明,葉盤在MS+2,4-D(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)+噻苯隆(TDZ,1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)培養基中連續暗培養24 d時多在周圍刻傷處形成白色的愈傷組織,質地較軟,在這些培養基中葉盤出愈率均為100%。將白色愈傷組織轉移到光照下繼續培養,其顏色逐漸變為嫩黃色,愈傷組織快速增殖且質地緊密,但無不定芽分化現象(圖3)。葉盤在相同培養基中暗培養7 d后轉移至光下培養23 d,其脫分化效果不明顯。葉盤在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA培養基中連續暗培養30 d后,出愈率也為100%,但葉盤產生的愈傷組織面積不大,多呈黃白色或黃褐色,長勢較差,在相同的培養基連續繼代培養后,愈傷組織硬化、不具有生命活力。在TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、6-BA(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、6-BA(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+NAA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、1.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA、1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA培養基中,無論是連續暗培養還是暗培養7 d后轉到光下培養,葉盤生長狀況都較差,隨著誘導時間的延長,葉盤褐化率逐漸升高,培養30 d時葉盤大部分或全部褐化,不產生愈傷組織,出愈率為0。綜合分析,最適宜誘導葉盤脫分化的培養基為MS+1.5 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L TDZ,在該培養基中出愈率高,且愈傷組織生命力旺盛,在適宜的愈傷組織再分化培養基中產生不定芽的效果最好。

2.4 不同培養基對愈傷組織再分化的影響

愈傷組織再分化產生不定芽的數量和質量因再分化培養基中植物生長調節劑組合的不同而不同。表3、圖4顯示,在含有TDZ+NAA、TDZ+IBA的培養基中,愈傷組織的再分化率都高于80.0%,平均分化芽數也較多,但分化而來的芽基本表現出質地較脆、葉片細小、生長緩慢的玻璃化特征,不能正常生長,難以進行下一步的生根培養。在含有TDZ+2,4-D、6-BA+2,4-D的培養基中,愈傷組織在連續培養50 d時,基本都褐化,不分化不定芽。在含有1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養基中,愈傷組織在連續繼代后仍然保持愈傷狀態,顏色為嫩黃色,質地較為疏松,不分化不定芽。愈傷組織在1/2 MS+6-BA+IBA培養基中培養18～25 d后,細胞變得更為緊密并產生綠色突起,30～40 d后形成不定芽,并產生根系。在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA的培養基中,愈傷組織再分化率最高,為91.0%,愈傷組織產生的不定芽形態健康、生長活躍且數量最多,因此選用該培養基作為綠色草莓愈傷組織再分化培養基。

表3 不同培養基對綠色草莓愈傷組織再分化的影響

A:愈傷組織接種在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養基20 d的生長狀況;B:愈傷組織接種在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA培養基50 d的生長狀況;C:愈傷組織接種在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養基50 d的生長狀況;D:愈傷組織接種在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養基50 d的生長狀況;E:愈傷組織接種在1/2 MS+2.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L 2,4-D培養基50 d的生長狀況;F:愈傷組織接種在1/2 MS+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培養基50 d的生長狀況;G:愈傷組織接種在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基50 d的生長狀況。TDZ:噻苯隆;2,4-D:2,4-二氯苯氧乙酸;IBA:吲哚丁酸;6-BA:6-芐氨基嘌呤;NAA:萘乙酸。

2.5 生根培養和煉苗移栽

綠色草莓生根培養結果(圖5)表明,不同培養基對試管苗生根率的影響無明顯差異,生根率均為100%,但對試管苗生根量和生根長度的影響是不同的。適宜質量濃度的IBA能提高生根量,在IBA的質量濃度為0.1～0.2 mg/L時,隨著IBA質量濃度的增加,根的數量和長度也增加。在添加0.2 mg/L IBA的基礎上再添加0.1 mg/L IAA的培養基中,試管苗的根系比在僅含0.2 mg/L IBA培養基中的根系更為粗壯。但是,隨著IAA、IBA質量濃度增加為0.3 mg/L、0.4 mg/L時,試管苗生根長度及生根量呈下降趨勢,植株的長勢也變弱。綜合分析,1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA培養基最有利于綠色草莓生根培養,在此培養基中,試管苗根系密集,主根和側根生長勢均衡,植株莖、葉健壯,整體長勢較為旺盛。

從左到右所用培養基依次為1/2 MS+0.1 mg/L IBA、1/2 MS+0.2 mg/L IBA、1/2 MS+0.1 mg/L IAA、1/2 MS+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA、1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA。IBA:吲哚丁酸;IAA:吲哚乙酸。

對根系健壯、長勢良好的綠色草莓試管苗進行煉苗,7 d后移栽于經高溫滅菌的基質中,在溫室培養30 d后,植株的成活率達到93.7%,并有匍匐莖萌發現象(圖6)。

圖6 煉苗與移栽

3 討 論

3.1 不同培養基對綠色草莓初代培養與離體增殖的影響

在基礎培養基中添加適量的細胞分裂素或生長素有利于初代試管苗的建立。韓如春等[15]發現,紅顏草莓的莖尖在添加6-BA和NAA的培養基中能獲得較高的成活率和誘芽率。6-BA與NAA或IBA或IAA組合使用都對紅顏草莓再生不定芽有促進作用,其中6-BA與NAA搭配效果最好[16]。本研究發現,相較于MS、MS+0.5 mg/L 6-BA,莖尖在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培養基中的成活率更高,且成活的莖尖長勢更好,因而該培養基更適用于綠色草莓初代培養。

不同草莓品種增殖培養階段使用的最適植物生長調節劑類型和比例存在差異。6-BA在減弱根尖優勢、刺激新芽萌發方面比其他植物生長調節劑的效果更好[17]。肖君澤等[18]發現,章姬草莓的增殖系數隨著培養基中添加6-BA質量濃度的增加而增加。白雪公主、紅顏草莓的最佳增殖培養基均使用6-BA[19-20]。本研究也同樣發現,綠色草莓增殖系數主要受6-BA質量濃度影響,但隨著增殖系數的不斷提高,會出現幼苗生長勢變弱、葉片黃化的現象。6-BA與IAA或IBA或GA3配合使用能緩和單獨使用6-BA對綠色草莓過度增殖產生植株長勢變弱的極端影響;當培養基中添加6-BA和IBA的質量濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L時,綠色草莓的增殖效果最好,增殖系數為6.4,所誘導產生的草莓苗不但健壯,而且葉片鮮綠。

3.2 不同培養條件對綠色草莓葉盤脫分化的影響

以草莓不同部位為外植體誘導產生不定芽的研究已有報道,在不同的外植體中,葉盤的再生率最高[21]。由于葉片來源廣泛、易于處理,草莓葉片已成為離體再生的最佳材料。以葉盤為再生外植體時,其放置方式對不定芽再生率和不定芽質量有一定影響,研究發現,Redcoat[22]、紅頰[23]等多個草莓品種葉盤背面接觸培養基時的再生率更高。但也有研究發現,葉盤背面接觸培養基時產生的再生芽不如其他放置方式產生的再生芽健壯,葉盤放置方式對再生效果的影響還有待進一步研究[24]。目前常用的基本培養基有MS、1/2 MS、改良MS等,MS基本培養基中各元素的比例合適,緩沖性強,具有高效的不定芽誘導性,可用于多種植物的各類組織培養[25-26]。草莓離體再生培養前期需要暗培養,直接進行光照或在不適宜光強下培養可能導致無愈傷組織形成[27]。本研究以MS為基礎培養基,對綠色草莓葉齡為30 d的葉盤進行脫分化處理,采用葉盤背面接觸培養基的方式進行培養,在連續暗培養24 d后葉盤傷口處產生白色愈傷組織。

控制植物生長調節劑的使用可以調節細胞的分化方向,一般來說,細胞分裂素與生長素的比值高有利于誘導不定芽的產生,細胞分裂素與生長素的比值低則有利于愈傷組織的誘導和根的形成[28-31]。TDZ對愈傷組織的誘導、不定芽再生有不同程度的影響,可以促進一些很難發生器官再生的木本植物的體外再生,如蘋果、梨[32-34]。有研究結果表明,TDZ的使用對草莓試管苗再生的效果顯著[35-36]。本研究發現,TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)與IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)組合使用時,出愈率為0。在培養基中添加2,4-D(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0mg/L)和TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)時都能使葉盤產生愈傷組織,出愈率都高達100%,其中在MS+1.5 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L TDZ培養基中產生的愈傷組織在適宜再分化培養基中的再分化效果最好。

3.3 不同培養基對綠色草莓愈傷組織再分化的影響

草莓再生不定芽誘導階段常用的細胞分裂素是6-BA和TDZ[37]。張志宏等[38]認為TDZ誘導Tudla草莓再生的效果優于6-BA。據報道,在草莓組織培養中單獨使用TDZ或與2,4-D、IBA聯合使用能有效誘導不定芽再生[5,39-40]。也有研究發現,愈傷組織在6-BA+IBA培養基中的再分化率比在其他激素組合的培養基中的再分化率更高[41]。本研究發現愈傷組織在含有TDZ+2,4-D的培養基中不能進一步分化;在含有TDZ+NAA、TDZ+IBA的培養基中,愈傷組織再分化產生的不定芽玻璃化嚴重,難以進行生根誘導,不能達到理想的再生效果;在1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養基中,愈傷組織在連續繼代培養后始終保持疏松的愈傷組織狀態;6-BA與IBA組合能有效促使綠色草莓愈傷組織分化出不定芽,其中最適組合為1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,在該培養基中愈傷組織再分化率為91.0%,平均分化芽數為46.2個,再生芽比較健壯。

3.4 不同培養基對綠色草莓生根的影響

植物生根培養一般采用MS、1/2 MS為基本培養基,同時添加或不添加低質量濃度的生長素,如IAA、IBA等。在草莓生根培養基中添加低質量濃度的生長素測試中,單獨添加IBA、IAA、NAA均可進行生根誘導[42-45]。紅顏草莓最佳生根培養基為添加IBA的1/2 MS培養基[20]。梁貴秋等[46]發現,IBA、IAA分別有利于草莓組培苗側根、主根的生長,同時使用IBA和IAA可以取得良好的不定根誘導效果。本研究發現適宜質量濃度的IBA、IAA均能誘導再生芽生根,但生長素質量濃度過高時根的生長勢失衡表現為短而粗或細而長。在IBA與IAA組合使用的培養基中,綠色草莓的根系更為密集,生根形態更自然、更正常,莖、葉長勢旺盛,有利于馴化移栽或開展其他與根系相關的試驗。綜合分析,綠色草莓在1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA培養基中的生根效果最好。