鎘污染對濱海灘涂圍墾區西蘭花根際土壤細菌群落結構的影響

陳海生，陳韜略，蔡林生，李若華，羅 文，高永勝，李振宇，裴孝鐘，王 雪

（1.浙江同濟科技職業學院，杭州 31123；2.浙江農林大學數學與計算機學院，杭州 311300）

近年來，土壤重金屬污染已成為嚴重的環境問題，對作物生產、糧食安全和人類健康構成巨大威脅。鎘（Cd）是一種人體非必需的元素，具有潛在的“致癌、致畸、致突變”效應，極易通過食物鏈進入人體從而傷害人體健康[1]。由于工業“三廢”的日漸增多和含Cd肥料大量使用，大量的重金屬Cd進入土壤后導致土壤中Cd污染日趨嚴重。由于其在環境中具有潛在的毒性和高流動性，使其成為重金屬中毒性最大、分布最廣泛的污染物之一[2]。其中蔬菜受重金屬Cd污染的情況日益嚴重，Cd污染嚴重的土壤會抑制蔬菜的生長發育導致蔬菜作物減產和蔬菜可食部分Cd含量超標[3]。因此，對Cd污染蔬菜農田土壤的修復變得十分重要[4-5]。

農田土壤微生物是農田生態系統最活躍的部分，在促進土壤養分循環、維持生態系統平衡方面起著重要作用。微生物群落結構和多樣性指數能夠直接反映農田土壤的污染程度，其對環境條件的變化響應靈敏，能夠真實評估各種污染物對農田生態系統的危害程度[6]。高通量測序能同時大批量對土壤樣品微生物的優勢菌群、稀有物種等進行檢測[7]。DUAN 等[8]采用高通量測序技術研究了不同濃度Cd污染對我國東北普通始成土細菌群落結構和多樣性的影響，發現高濃度的Cd能提高農田土壤細菌群落的豐富度和多樣性指數，羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、根微菌屬（Rhizomicrobium）和阿菲波菌屬（Afipia）是高抗Cd 污染的細菌菌屬。GUO 等[9-10]采用高通量測序技術研究了陜西省商洛市被鎘（Cd）、鉛(Pb)和鋅(Zn)污染的農田土壤的細菌群落結構，發現了對這些重金屬敏感的細菌菌屬如羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、芽單胞菌屬（Gemmatimona）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）。趙立君等[11]研究了砷(As)污染濕地土壤細菌多樣性及群落結構特征，發現細菌群落對As污染具有較為敏感的響應，在As濃度為400 mg·kg-1時存在大量的假單胞菌科（Pseudomonas），可為As 污染濕地微生物修復提供借鑒。但關于Cd 污染條件下濱海灘涂圍墾區土壤細菌群落結構特征的研究報道并不多見。

西蘭花(Brassica oleracea var.italica)為十字花科蕓薹屬蔬菜，其原產地為歐洲。色澤深綠，因其口味獨特、營養全面，深受消費者喜愛[12]。西蘭花是我國在國際市場上比較有競爭力的蔬菜品種[13-14]，其作為浙江省的特色蔬菜，主要分布在浙江省沿海灘涂圍墾區。本研究利用Miseq測序平臺采用高通量測序技術分析不同濃度Cd 污染條件下濱海灘涂濕地圍墾區西蘭花根際土壤細菌群落結構組成及多樣性指數變化特征，研究Cd污染對土壤細菌群落結構影響規律，并探索有利于Cd污染修復的抗Cd細菌菌群，以期為我國濱海灘涂地西蘭花重金屬污染土壤微生物修復提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設置

試驗所用土壤采用浙江省臨海市上盤鎮磊石坑村西蘭花種植基地土壤(表層0~20 cm)，底質為黏泥沙質，成土母質為新淺海沉積物。土壤pH 值為7.48，有機質(Organic matter)含量為15.52 g·kg-1，土壤鹽分含量為0.11%,全氮(Total N)0.98 g·kg-1，有效磷(Available P)105.13 mg·kg-1，速效鉀(Available K)257.05 mg·kg-1。先把土樣自然晾干，再進行粉碎，過2 mm 尼龍篩。取10 kg 土樣置于培養盆內，試驗用盆規格為：內口徑44 cm，底徑32 cm，高32 cm。共設置3個Cd污染濃度梯度，分別是0，3.5，60 mg·kg-1，依次標記為Cd0、Cd3.5、Cd60組。具體做法是將CdCl2·2.5H2O按照0，3.5，60 mg·kg-1的濃度梯度（濃度以純Cd 計，Cd 的起始濃度參考國家土壤環境質量二級標準）配成水溶液，均勻澆灌于盆土中(滲出液反復回收澆灌，直到Cd 離子與盆栽土壤均勻混合)，以澆清水作對照為Cd0，每個處理5 次重復[15]。其中Cd3.5為我國受重金屬污染較嚴重地區土壤Cd污染濃度的平均值[16]。于2022年4月10日選取生長旺盛且大小均勻一致的西蘭花幼苗種植到試驗盆里。每個試驗盆內栽植5 株西蘭花幼苗，每個處理重復3 個平衡試驗。全部試驗用盆置于浙江省臺州農業科學院人工氣候室內，肥水管理和其他措施包括除草等均一致。培養3 個月后進行土樣取樣，取樣前先讓試驗盆自然落干，在土壤表層0~10 cm處采集直徑小于0.1 cm各植株細根，用抖落法[17-18]收集黏附在植株細根上的土壤作為西蘭花根際土壤樣品，取土樣時進行3次重復，將土樣混合均勻、去雜和過篩后，取10 g土樣置于冰盆內直接寄往杭州聯川生物公司。

1.2 土壤細菌高通量測序

采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒(D5625,Omega,Inc.,USA)提取土樣的總DNA。使用上下引物分別為341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)，對16S rDNA基因的(V3-V4)進行PCR擴增。PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，回收采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒。測序在Illumina Miseq PE300平臺上進行。

1.3 生物信息處理

根據Barcode序列拆分各樣品數據，然后使用FLASH 對截取Barcode和引物的序列進行拼接[19]；采用根據fqtrim（v0.94）對原始序列進行過濾、拼接和嵌合體去除[20]，以獲得高質量的clean 標簽。使用Vsearch 軟件對嵌合序列進行過濾（v2.3.4）。根據SILVA（release 132）分類器，利用每個樣本的相對豐度對特征豐度進行歸一化。利用QIIME2 軟件分別對每個樣本計算細菌的Alpha 多樣性指數。采用Blast 進行序列比對，每個代表性序列用SILVA 數據庫對特征序列進行注釋。其他圖使用R 包實現（v3.5.2）。所得到的數據用SPSS 16.0進行統計和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 Cd污染條件下西蘭花根際土壤細菌多樣性特征

Miseq 測序所得土壤樣品經質檢后，獲得了各處理樣品的細菌有效序列數。由表1 可知，西蘭花根際土壤細菌有效序列以Cd3.5 即Cd 濃度為3.5 mg·kg-1的處理組為最高，其次是Cd60 即Cd 濃度為60 mg·kg-1的處理組，而以對照組即不設Cd 污染的西蘭花根際土壤細菌有效序列最低。各處理及對照的有效序列比例均大于71%。序列長度在400~500 bp 和300~400 bp 的分別占99.90%和0.08%，總計大于99.98%，符合分析要求。

表1 不同程度Cd污染西蘭花根際土壤細菌有效序列讀數及OTUs數Table 1 The sequence readings and OTUs of soil bacterial of rhizosphere of broccoli under different gradients of cadmium contamination

經質控和去除嵌合體后，所得有效序列以97%的一致性聚類成OTUs，各處理及對照組的OTUs數為419~1 687 個，共計2 577 個。其中以Cd3.5 即Cd濃度為3.5 mg·kg-1的樣品OTUs數最多,為1 687個，其次是對照組樣品，OTUs 數為1 065 個，而以Cd60組樣品的OTUs 數最少，只有419 個。這三者之間的差異均達顯著水平（p<0.05）。

不同Cd 濃度污染下西蘭花根際土壤細菌共有的OTUs 數是96 個，占總數的3.73%；Cd3.5 組樣品特有的細菌OTUs 數為1 216 個，占總數的47.18%；Cd60 組樣品特有的細菌OTUs 數為229 個，占總數的8.89%；而對照組Cd0樣品特有的細菌OTUs數為634 個，占總數的24.60%。Cd3.5 組樣品土壤細菌特有OTUs 數比對照增加191.80%，而Cd60 組樣品土壤細菌特有OTUs數比對照減少63.88%（圖1）。

土壤微生物Chao1 指數和Shannon 指數用來表示其豐富度和多樣性。由表2 可知，不同程度Cd污染對西蘭花根際土壤細菌Chao1 指數和Shannon指數的影響程度是不同的。Chao1 指數和Shannon指數均以Cd3.5 處理組樣品為最高，其值分別為1 623.31和9.26，比對照的1 029.12和8.37分別增加57.74%和10.63%，而Cd60處理組樣品的Chao1指數和Shannon 指數下降至403.02 和6.93，分別比對照降低60.85%和17.21%，3 個處理的差異程度均達顯著水平(p<0.05)。

表2 不同程度Cd污染西蘭花根際土壤細菌Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity in soil bacterial communities of rhizosphere soils of broccoli under different gradi‐ents of cadmium contamination

2.2 Cd污染對西蘭花根際土壤細菌群落結構在門水平上組成的影響

通過對測序結果的物種注釋，各處理組土壤樣品中所檢測到的細菌菌群分屬于35 門、97 綱、205目、315 科、506 屬。在門水平上，各處理組土壤細菌群落組成均以變形菌門(Proteobacteria，48.26%~60.38%)為主，其次是放線菌門(Actinobacteria，4.78%~19.50%)，其他占比較大的還有酸桿菌門(Acidobacteria，3.56%~10.31%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，4.24%~8.54%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，3.21%~4.88%)、髕骨菌門(Patescibacteria，1.02%~8.57%)、綠灣菌門(Chloroflexi，2.62%~4.60%)、棒狀桿菌門(Rokubacteria，2.37%~3.14%)、浮霉菌門(Planctomycetes，0.77%~3.38%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，1.27%~2.56%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae，0.70%~1.48%)、厚壁菌門(Firmicutes，0.20%~1.62%)。

不同程度Cd 污染條件下，西蘭花根際土壤細菌群落組成在門水平上發生了明顯的變化。由圖2可知，在門水平上，未經Cd污染處理的Cd0組土壤變形菌門的相對豐度為48.92%，經Cd3.5組處理后，變形菌門的相對豐度稍有下降，但與Cd0相比差異不顯著(p>0.05)。當Cd濃度增加到60 mg·kg-1時，土壤變形菌門的相對豐度增加到60.38%，增加23.43%，與Cd0 和Cd3.5 組的差異均達顯著水平(p<0.05)。土壤放線菌門的相對豐度隨著Cd濃度的上升呈下降趨勢，Cd3.5組比Cd0組下降30.62%，其差異達極顯著水平(p<0.01)，Cd60組比Cd0組下降75.49%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。土壤酸桿菌門的相對豐度在低濃度Cd污染時呈上升趨勢，在Cd3.5組樣品其相對豐度比Cd0時增加30.34%，其差異程度達極顯著水平(p<0.01)，而在高濃度Cd 污染時呈下降趨勢，Cd60組樣品酸桿菌門相對豐度比Cd0時降低54.99%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。土壤擬桿菌門的相對豐度在低濃度Cd 污染時上升幅度不大，與對照差異未達顯著水平(p>0.05)，而在高濃度Cd 污染時上升幅度較大，比對照Cd0 增加101.42%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。土壤芽單胞菌門的相對豐度也隨著Cd污染程度的加劇而呈升高的趨勢，Cd60 組的比對照升高52.03%，其差異達顯著水平(p<0.05)。土壤綠灣菌門的相對豐度在低濃度Cd 污染時呈上升趨勢，Cd3.5 組樣品其相對豐度比對照Cd0 組增加27.42%，其差異達極顯著水平(p<0.01)，在高濃度Cd 污染時呈下降趨勢，Cd60 組樣品其相對豐度比對照Cd0 組的下降27.42%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。棒狀桿菌門的相對豐度在低濃度Cd 污染時呈上升趨勢，Cd3.5 組比Cd0 組增加30.83%，差異程度達極顯著水平(p<0.01)，而在高濃度Cd 污染時呈下降趨勢，但Cd60 組與對照Cd0 相比差異未達顯著水平(p>0.05)。浮霉菌門的相對豐度隨著Cd 污染程度的加劇一直呈下降趨勢，在Cd 3.5 時下降26.33%，其差異達極顯著水平(p<0.01)，而到Cd60 時下降77.22%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。土壤疣微菌門的相對豐度在低濃度Cd 污染時呈上升趨勢，Cd3.5 組樣品其相對豐度比對照雖有增加，但差異未達顯著水平(p>0.05)，在高濃度Cd 污染時呈下降趨勢，Cd60 組樣品其相對豐度比對照降低45.02%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。土壤硝化螺旋菌門和厚壁菌門的相對豐度也呈同樣的趨勢，在低濃度Cd污染時其相對豐度分別比對照增加37.04%和110.39%，并且差異均達極顯著水平(p<0.01)，而在高濃度Cd污染時其相對豐度呈急劇下降趨勢，分別比對照降低35.19%和74.03%，其差異均達極顯著水平(p<0.01)。

圖2 門水平上不同濃度Cd污染條件下西蘭花根際土壤細菌群落結構Figure 2 The bacterial communities at phylum level in rhizosphere soils of broccoli under different gradients of cadmium contamination

2.3 Cd污染對西蘭花根際土壤細菌群落結構在屬水平上組成的影響

在屬水平上，各處理組土壤樣品中細菌群落均以羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter,4.52%~21.25%)為主，其次為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，2.45%~4.83%)、馬賽菌屬(Massilia，1.59%~4.03%)、未分類的噬幾丁質科(Chitinophagaceae-unclassified，1.42%~2.56%), 其他相對豐度較大的還有假節桿菌屬（Pseudarthrobacter，0.36%~3.22%)、未分類的α-變形菌(Alphaproteobacteria-unclassified，1.07%~2.08%)、黏液桿菌屬(Muciaginibacter，0.97%~2.12%)、慢生根廇菌屬(Bradyrhizobium，1.08%~1.54%)、鏈霉菌屬(Streptomyces，0.18%~1.86%)、黃桿菌屬(Flavobacterium，0.20%~2.78%)、杜搟氏菌屬(Duganella，0.62%~1.49%)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas，0.46%~1.87%)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira，0.70%~1.32%)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira，0.49%~1.06%)、中慢生根廇菌屬(Mesorhizobium，0.73%~0.91%)、火山巖海球菌屬(Marmoricola，0.63%~0.82%)、諾卡氏菌屬(Nocardioides，0.19%~1.27%)。

不同程度Cd 污染條件下，西蘭花根際土壤細菌群落結構在屬水平上發生了明顯變化。由圖3 可知，未經Cd污染處理的土樣羅思河小桿菌屬相對豐度為8.84%，經Cd3.5組處理后，其相對豐度大幅度下降，下降幅度為48.87%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。當Cd濃度增加到60 mg·kg-1時，土壤羅思河小桿菌屬相對豐度增加到21.25%，增加140.38%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。土壤鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度在低濃度Cd 污染時呈上升趨勢，但上升幅度只有5.69%，與對照的差異程度不明顯，在高濃度Cd污染時呈下降趨勢，下降幅度達46.39%，其差異程度達極顯著水平(p<0.01)。土壤假節桿菌屬、黏液桿菌屬以及紅假單胞菌屬的相對豐度隨著Cd濃度的增加一直呈下降趨勢。土壤黃桿菌屬的相對豐度隨著Cd污染程度的加劇呈一直升高的趨勢，其Cd60組的相對豐度比對照增加1290.00%，其差異達極顯著水平(p<0.01)。

圖3 屬水平上不同濃度Cd污染條件下西蘭花根際土壤細菌群落結構Figure 3 The bacterial communities at genus level in rhizosphere soils of broccoli under different gradients of cadmium contamination

3 討論與結論

曾經有學者認為，重金屬污染會對土壤微生物多樣性的變化產生影響，隨著污染的加重，土壤微生物多樣性會出現拱橋形的變化趨勢[21]。當重金屬污染劑量較低時，會產生抑制優勢種群的競爭性排除效應，而促進劣勢種群的生長和繁殖，導致微生物多樣性升高。而重金屬污染劑量較高時，會對微生物產生毒性，某些造成微生物物種消亡，而致使微生物多樣性下降。邢奕等[22]研究了密云水庫上游鐵礦區重金屬污染對土壤微生物群落的影響，發現細菌、放線菌的種群多樣性水平隨著重金屬污染程度的加強呈先上升再下降的趨勢。鄭涵等[23]的研究發現低濃度Zn 脅迫(200 mg·kg-1)促進微生物群落數量的增加，提高了群落結構多樣性，而高濃度Zn脅迫(>800 mg·kg-1)時，較重程度的鋅脅迫對微生物產生了明顯的抑制作用。趙立君等[11]研究了砷(As)脅迫對濕地生境下土壤微生物生物多樣性及群落結構特征，發現低濃度砷(As)脅迫會在一定程度上刺激As敏感微生物的生長繁殖，造成微生物多樣性增加，而高濃度As脅迫會對微生物產生明顯的抑制作用，導致某些物種消亡而微生物多樣性下降。本研究在濱海灘涂濕地圍墾區西蘭花根際土壤上的研究也表明了低濃度Cd 污染時西蘭花根際土壤細菌Chao1 指數和Shannon 指數與對照相比大幅度上升(p<0.01)，而高濃度Cd 污染時西蘭花根際土壤細菌Chao1 指數和Shannon 指數大幅度下降(p<0.01)。各樣品土壤細菌特有的OTUs 數變化也呈同樣的趨勢(p<0.01)，即低濃度Cd污染時土壤細菌特有的OTUs數與對照相比呈大幅度增加趨勢，而在高濃度Cd污染時土壤細菌特有的OTUs數與對照相比呈大幅度減少趨勢(p<0.01)。本研究結果與上述學者的結論一致。

趙立君等[11]在研究砷污染濕地生境下土壤細菌群落結構特征時檢測到，在高濃度砷（As）污染條件下，土壤變形菌門的相對豐度為75.00%，而厚壁菌門的相對豐度只有7.00%。本研究結果也表明了在高濃度Cd 污染下土壤變形菌門的相對豐度升高至60.38%，而厚壁菌門的相對豐度下降至0.20%，這說明土壤變形菌門是能夠在高濃度Cd 污染條件下生存下來的耐Cd 微生物，并能成為土壤細菌群落的主導，這一點與趙立君等[11]的研究結果相一致。另外，土壤酸桿菌門、綠灣菌門、疣微菌門、硝化螺旋菌門、棒狀桿菌門在低濃度Cd 污染時其相對豐度增加，而在高濃度Cd 污染時其相對豐度降低，說明在這些菌門中可能存在大量的對Cd 敏感的細菌群落在Cd 刺激下大量出現，而隨著Cd 濃度的升高，Cd對土壤細菌產生毒性，大量對Cd敏感的細菌逐漸消失，而使群落結構趨于單一、穩定。

Cd 污染使濱海灘涂濕地圍墾區西蘭花根際土壤細菌群落結構在門水平上發生了變化。隨著Cd污染程度的加重，農田土壤放線菌門和浮霉菌門的相對豐度呈一直下降的趨勢，擬桿菌門和芽單胞菌門的相對豐度呈一直升高的趨勢，土壤變形菌門和髕骨菌門的相對豐度則呈先下降后上升的趨勢。而酸桿菌門、棒狀桿菌門、疣微菌門、硝化螺旋菌門和厚壁菌門的相對豐度均呈先上升后下降的趨勢，說明這5個菌門中可能存在大量對Cd敏感的菌群，在Cd的刺激下大量出現，群落結構變得復雜多樣，導致這些菌群的相對豐度上升。而當Cd 污染程度繼續加重時，這些菌門的相對豐度呈下降趨勢，這說明隨著Cd 污染程度的增強，Cd 對土壤細菌產生了毒性，大量對Cd 敏感的細菌不斷消失，而使變形菌門、擬桿菌門、髕骨菌門、芽單胞菌門這些能夠在高濃度Cd 污染環境下能夠生存下來的耐Cd 細菌門成為農田土壤細菌的主體。

不同程度Cd污染條件下，西蘭花根際土壤細菌群落結構在屬水平上發生了明顯變化。土壤羅思河小桿菌屬相對豐度在低濃度Cd 污染時呈下降趨勢，而在高濃度Cd 污染時呈升高趨勢，土壤鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度在低濃度Cd 污染時呈上升趨勢，在高濃度Cd 污染時呈下降趨勢。土壤假節桿菌屬、黏液桿菌屬以及紅假單胞菌屬的相對豐度隨著Cd濃度的增加一直呈下降趨勢。土壤黃桿菌屬的相對豐度隨著Cd 污染程度的加劇呈一直升高的趨勢。在高濃度Cd 污染處理下，西蘭花根際土壤細菌群落結構趨于簡單、穩定，耐Cd 的細菌菌群占據主導地位。在高濃度Cd 污染處理下在屬水平上仍然具有高豐度的菌群有羅思河小桿菌屬，以及Gemmatimonadaceae-unclassified、馬賽菌屬、Candidatus-Adlerbacteria-unclassified、Chitinophagaceae-unclassified、Alphaproteobacteria-unclass、黃桿菌屬、杜搟氏菌屬，這些菌屬可以被認為是在濱海灘涂濕地西蘭花種植田土壤上高抗Cd污染的細菌菌群。