次氯酸消毒種蛋效果研究

國紀壘，魏建平

（北票市宏發食品有限公司，遼寧朝陽 211300）

種蛋產出后易受到環境和空氣中細菌的污染，不僅影響其自身的孵化，而且污染孵化設備，傳播各種疾病。種蛋表面不同程度的帶有病菌（如沙門氏菌、大腸桿菌等)，雖然從蛋殼結構上看，種蛋有膠質層，蛋殼和內膜等幾道自然屏障，但這些屏障對病菌的阻止能力有限。給種蛋進行消毒，可以消除蛋殼上的病原微生物，減少胚胎死亡，提高受孵率和雞苗質量。因此對種蛋進行徹底的消毒滅活尤為重要。種蛋消毒要求消毒藥無副作用，無刺激性氣味，無生命體內殘留，不影響受精率和孵化率。

傳統種蛋甲醛熏蒸消毒的方法具有毒性和刺激性，會對工作人員和設備造成傷害。歐盟、美國、日本等國外已出臺相關法律法規，明確禁止藥品生產車間使用甲醛熏蒸.。國內學者也建議使用安全的消毒技術來代替甲醛熏蒸。此外，現場種蛋裝箱重疊碼放的現狀，限制了消毒操作。微酸性次氯酸溶液具有很強的殺菌作用，且具有廣譜、強效、快速、安全、對環境無污染等優點。為研究次氯酸對種蛋消毒的效果和對孵化指標的影響，本試驗選擇經過實驗室殺菌試驗篩選最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC) 值最高的次氯酸，開展種蛋噴霧消毒試驗，以期解決種蛋消毒的難題，從而提高孵化成績。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

不同濃度的次氯酸由購自沈陽溢源公司的YY-80 次氯酸發生器生產，試驗前使用3M 公司生產的余氯檢測試紙檢測氯濃度。對照消毒劑為企業自購市售的6 種常用消毒劑，分別為：二氧化氯、次氯酸鈉、過氧化氫、過氧乙酸、戊二醛、過硫酸氫鉀。大腸埃希菌菌種和大腸埃希菌耐藥菌均來自北票市宏發食品有限公司檢測中心鑒定驗證后保存的菌種。微生物培養材料、養瓊脂等購自北京路橋技術股份有限公司。

1.2 主要儀器

生物安全柜購自上海滬凈醫療器械有限公司；500 型電熱恒溫培養箱購自龍口先科儀器公司；19200 型單體孵化器購自蚌埠依愛電子科技有限責任。

1.3 種蛋采集

按照北票市宏發食品有限公司種蛋選擇標準選取某種雞場飼養的46 周齡科寶父母代種雞所產種蛋。試驗地點為種雞場及配套孵化廠；試驗時間為2023 年5—8 月。

1.4 試驗方法

1.4.1 大腸埃希菌和大腸埃希菌耐藥株的消毒藥篩選試驗

選擇市場常見和企業常用的7 種消毒劑，以說明書建議的濃度為基本濃度，設置10、20 和50 倍3 個濃度梯度，分別與108CFU/mL 的大腸埃希菌和大腸埃希菌耐藥株，在試管肉湯培養基內作用10min 后，37℃培養24h，觀察培養肉湯的變化，肉湯清亮的最低稀釋倍數為有效抑菌濃度。

1.4.2 種蛋表面大腸埃希菌消毒試驗

取46 周齡的種蛋36 枚，按照參考文獻[2,6]所述方法，設置10、20、50mL/L 共3 個次氯酸濃度組，每組9 枚，對照組9 枚，試驗在生物安全柜中進行，試驗組和對照組按照每枚種蛋0.5mL劑量蛋殼表面噴霧含菌量108CFU/mL 大腸埃希菌液3min 干燥后，在超凈臺內進行次氯酸消毒噴霧，試驗組從低濃度到高濃度，每枚0.5mL，對照組每枚噴生理鹽水0.5mL，噴霧消毒結束后，靜置5min。參照《食品微生物生物學檢驗 菌落總數測定》（4789.2—2016)，每組9 枚種蛋按照對角線選擇5 枚種蛋表面用2.5cm 制圓形采樣規板涂抹取樣，合并成1 個樣品，每個樣品做10-1到10-6稀釋，選擇10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋倍數，每個稀釋倍數接種伊紅美蘭瓊脂平板0.1mL，37℃培養24h 并計數。比較3 個試驗組與對照組對大腸埃希菌的滅菌率。

1.4.3 孵化廠種蛋彌霧消毒試驗

選擇0～40μm 可調彌霧機，調整至5μm、20μm 2 個霧粒直徑，射程3m、噴霧量60mL/min，加入染色劑測試噴霧后觀察著色均勻度，按照每箱種蛋280 枚，4 箱一摞碼放，計算噴霧量約為230mL，設置噴霧時間4min，沿蛋箱周圍約20cm 的距離均勻噴霧。根據著色均勻的噴霧距離選擇50ml/L 的次氯酸，使用彌霧機對庫存種蛋進行20μm、5μm 不同霧粒霧化消毒。選擇中間層的種蛋檢測表面細菌總數、金黃葡萄球菌和致病性霉菌，消毒前后細菌總數、金黃葡萄球菌數和致病性霉菌數量均符合標準，比較消毒前后滅菌率。

參照《公共場所衛生檢驗方法第3 部分空氣微生物》（GB/T 18204.3—2013) 《活禽疫病與禽肉衛生質量檢測程序及內控標準》（北宏牧企字[2021]第001 號) 的檢測方法，驗證次氯酸對大腸桿菌的消毒濃度和效果。噴霧結束后，取中間2 盤種蛋帶回實驗室，每盤選擇對角線的5 枚種蛋，使用2.5cm 的規板于種蛋表面涂抹取樣，合并成1 個樣品，每個樣品做10-1到10-6稀釋，選擇10-4、10-5、10-6三個稀釋倍數，每個稀釋倍數做 3 個平板，接種伊紅美藍培養基（eosin-methylene blue medium，EMB)、高鹽甘露醇瓊脂平板和孟加拉紅瓊脂平板，37℃培養24h，統計細菌總數、金黃葡萄球菌、致病性霉菌。

1.4.4 孵化場種蛋消毒孵化效果對比試驗

選擇北票市宏發食品有限公司孵化中心46周齡科寶雞群的種蛋，分試驗組19200 枚和對照組18570 枚，試驗組使用濃度為10mL/L 的次氯酸，每枚種蛋噴霧劑量0.7mL；對照組按照相同噴霧劑量，噴霧300 倍稀釋的戊二醛，試驗組和對照組同機孵化場。出雛后單獨撿雛，統計孵化成績，比較2 種消毒藥消毒種蛋后的孵化效果。

1.4.5 菌落計數

先用肉眼觀察，點數菌落數，然后再用放大5～10 倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數。若平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不計數。若片狀菌落不平到平皿中的一半，而其余一半中菌落數分布有很均勻，則可將此半個平皿菌落計數后乘以2，以代表全皿菌落數。

1.5 數據分析

滅菌率、受精率、污染率、中止率的計算見公式（1)～（4)。

式（4) 中，早死胚數量為1～5 胚齡死胚數；中死胚數量為6～14 胚齡死胚數。

2 結果與分析

2.1 大腸埃希菌的消毒藥篩選試驗

選擇市場常見和企業常用的7 種消毒劑，對標準大腸埃希菌和耐藥大腸埃希菌做滅菌效果試驗。由表1 可知，與其他6 種常用消毒劑相比，次氯酸在相同時間內具有最低的滅菌濃度。

表1 不同消毒劑對大腸埃希菌滅菌效果

2.2 次氯酸消毒種蛋的試驗結果

2.2.1 種蛋表面大腸埃希菌噴霧消毒試驗結果

由表2 可知，種蛋表面噴霧108CFU/mL 大腸埃希菌后，噴霧10～50mL/L 次氯酸作用10min，大腸埃希菌數量降低，其中50mL/L 降低3.5×104CFU/mL，20mL/L 降低1.78×105CFU/mL，10mL/L 降低1.75×105CFU/mL。比較生理鹽水對照組，滅菌率達到99.35%～97.61%。

表2 不同濃度次氯酸對種蛋表面大腸艾希菌的滅菌效果

2.2.2 裝箱重疊碼放種蛋彌霧消毒試驗結果

由表3 可知，與消毒前相比，大霧滴組和小霧滴組均能降低細菌總數、滅菌率，其中小霧滴組效果較好。

表3 次氯酸對種蛋表面的消毒效果

根據以上試驗結果，制定次氯酸霧化消毒種蛋操作程序：次氯酸濃度50mL/L，彌霧機霧化粒子直徑20μm，按照每枚種蛋0.2mL 的劑量，噴霧時間4min。種蛋送到孵化場后隨機抽樣，檢測種蛋表面微生物，設定內控標準為：細菌總數合格標準≤50CFU/cm2，金黃葡萄球菌數合格標準≤10CFU/cm2，檢測結果見表4。6 月份共計抽查種蛋9 個樣品全部合格。種蛋孵化出雛后，檢測雛雞和毛蛋的大腸埃希菌和沙門氏菌均為陰性，無氣囊渾濁的現象。

表4 孵化場種蛋表面消毒效果檢測

2.3 次氯酸分子水噴霧消毒種蛋的孵化成績對比試驗結果

由表5 可知，使用濃度為50mL/L 的次氯酸噴霧的種蛋，與使用戊二醛噴霧消毒種蛋同機孵化，次氯酸噴霧組受精率高于戊二醛噴霧組，中止率低于戊二醛噴霧組，污染率沒有上升。

表5 種蛋次氯酸和戊二醛噴霧消毒效果

3 討論

研究結果表明，pH5.0～5.8 的次氯酸帶中性電荷，與人和動物有機體自身免疫功能中嗜中性白細胞生成的次氯酸溶液酸度一致，并被機體組織細胞所接受，次氯酸很容易穿透帶負電荷的細菌細胞壁，通過氧化細胞壁殺死細菌或者通過細胞壁進入，分解破壞微生物的氨基酸和酶系統，進而控制微生物的蛋白質合成，終止微生物的代謝功能[1]。本試驗結果表明，次氯酸對大腸埃希菌和大腸埃希菌耐藥菌株有較強的殺滅作用。種蛋消毒試驗和孵化指標跟蹤結果顯示，次氯酸對種蛋消毒效果良好且不影響孵化指標。次氯酸以無毒無害無刺激性的優勢，加之彌霧機的配合，實現了種蛋全天候消毒，解決了現場裝箱重疊碼放種蛋消毒和種蛋隨檢隨消的難題，同時為孵化廠醛類消毒劑的替代提供了數據支撐。

4 結論

本試驗通過對比次氯酸與其他市售的6 種消毒劑對大腸埃希菌及大腸埃希菌耐藥菌株的殺滅實驗，驗證了次氯酸在相同時間內具有最低的滅菌濃度。根據次氯酸消毒種蛋的試驗結果，制定次氯酸霧化消毒種蛋操作程序：次氯酸濃度50mL/L，彌霧機霧化粒子直徑20μm，按照每枚種蛋0.2mL 的劑量，噴霧時間4min。設定內控標準為：細菌總數合格標準≤50 CFU/cm2，金黃葡萄球菌數合格標準≤10CFU/cm2。

種蛋經孵化出雛后，孵化指標優于戊二醛消毒組，檢測雛雞和毛蛋的大腸埃希菌和沙門氏菌均為陰性，無氣囊渾濁的現象?？梢?，次氯酸完全可以替代戊二醛進行孵化廠的種蛋消毒。