LINC00943調節miR-331-3p/KMT2A軸對宮頸癌細胞惡性生物學行為和上皮間質轉化的影響

葛新苗，高倩，刁叢，溫美俠，李帥

(保定市第二中心醫院產科,保定 072750)

宮頸癌(CC)是常見的癌癥之一,在全球女性發病率中排名第四[1]。對于CC患者,免疫治療已成為CC治療的新熱點,但其治療效果仍不理想[2]。由于CC具有高復發性和轉移性等特點,導致CC患者總體預后較差。在上皮間質轉化(EMT)過程中,細胞外基質(ECM)降解導致腫瘤細胞遷移、侵襲和擴散到各組織繼發部位[3]。因此,了解CC發生和發展機制對尋找新的診斷生物標志物和有效治療方案至關重要。長鏈非編碼核糖核酸(LncRNA)是具有200多個核苷酸的核糖核酸(RNA)轉錄本,其已被證實與CC的發生及患者的預后密切相關[4]。LINC00943是一種新型的表觀遺傳轉錄物[5]。文獻報道,CC免疫相關的競爭性內源RNA(ceRNA)網絡(包含LINC00943),在細胞增殖、凋亡和程序性細胞死亡中顯著富集[6]。微小RNA(miRNA)是高度保守的小非編碼RNA,其已成為診斷CC的潛在生物標志物[7]。據報道,miR-331-3p在HeLa細胞中高表達,miR-331-3p靶向調控NRP2抑制CC細胞增殖、遷移和侵襲[8]。此外,研究顯示,前列腺癌和膠質瘤中LncRNA UCA1、LncRNA GAPLINC均可通過調節miR-331-3p促進細胞進展[9-10]。賴氨酸甲基轉移酶2A(KMT2A)是表觀遺傳機制的一員,主要負責H3K4甲基化進行轉錄激活[11]。據報道,敲低KMT2A可抑制CC細胞的增殖和遷移,并抑制腫瘤的生長[12]。然而,LINC00943對CC惡性生物學行為及miR-331-3p、KMT2A的影響尚不清楚。因此,本研究旨在探討LINC00943在CC中的作用以及具體機制,以期為臨床治療提供理論依據。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞及動物來源:正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7和人CC細胞系HeLa、SiHa、C33A、CaSki購自美國ATCC細胞庫;4周齡BALB/c裸鼠購自湖北省實驗動物研究中心,許可證號:SCXK(鄂)2020—0018。

2.主要試劑:LINC00943短發夾RNA(sh-LINC00943)和陰性對照(sh-NC)、miR-331-3p抑制劑(miR-331-3p inhibitor)和陰性對照(NC inhibitor)、miR-331-3p模擬物(miR-331-3p mimics)和陰性對照(miR-NC)、KMT2A過表達質粒及對照(pcDNA)購自上?？蒲派锟萍加邢薰?Nuclear/Cytosol Fractionation Kit(K266-100)購自上海起源生物科技有限公司;PrimeScript RT試劑盒(RR036A)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(DRR820A)購自日本TaKaRa公司;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062S)、MTT(C0009S)、Dual-LumiTMⅡ雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(RG089S)、Lipo6000TM轉染試劑(C0526)購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗人KMT2A多抗(ab272023)、兔抗人E-cadherin單抗(ab76319)、兔抗人N-cadherin單抗(ab76011)、HRP標記的IgG(ab150077)購自英國Abcam公司。

3.主要儀器:熒光倒置顯微鏡(型號IX71)購自日本Olympus公司;PCR儀(型號:T100TM)、流式細胞儀(型號ZE5)購自美國Bio-Rad公司。

二、研究方法

1.細胞培養:將正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7和人CC細胞系HeLa、SiHa、C33A、CaSki細胞放置在含10% FBS和1%的青鏈霉素的DMEM中,置于37℃、5% 二氧化碳(CO2)培養箱中培養,每隔1 d更換培養基,待細胞貼壁達70%～80%,用胰蛋白酶進行傳代培養,取對數生長期的細胞進行后續實驗。

2.細胞轉染:將HeLa細胞分為sh-NC組、sh-LINC00943組、sh-LINC00943+NC inhibitor組、sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor組、miR-NC組、miR-331-3p mimics組、miR-331-3p mimics+pcDNA組、miR-331-3p mimics+KMT2A組。收集各組HeLa細胞,用0.25%胰蛋白酶消化重懸,并接種在6孔板中(每孔1.2×106個),待細胞融合度為70%～80%時,使用Lipo6000TM轉染試劑盒轉染細胞,轉染48 h后,提取各組細胞總RNA,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測轉染效率。

3.LINC00943在HeLa中的定位:收集HeLa細胞,預冷PBS沖洗,離心后取細胞沉淀,使用Nuclear/Cytosol Fractionation Kit試劑盒分離細胞核、細胞質并提取RNA,RT-qPCR法檢測LINC00943表達。

4.RNA pull down實驗:將生物化LINC00943探針和HeLa細胞裂解物混合,以非生物化LINC00943探針為對照,加入磁珠于4℃下孵育48 h。提取總RNA,RT-qPCR檢測miR-331-3p表達。

5.熒光素酶報告實驗:將LINC00943野生型(wt)或突變型(mut)及KMT2A-wt/KMT2A-mut序列克隆到pmirGLO載體中,構建LINC00943-wt/LINC00943-mut、KMT2A-wt/KMT2A-mut質粒,使用Lipo6000TM轉染試劑將構建的載體與miR-331-3p模擬物或陰性對照(NC)共轉染到HeLa細胞,轉染2 d后,采用熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。

6. RT-qPCR實驗:TRIzol試劑提取各組細胞總RNA,并利用PrimeScript RT試劑盒反轉錄成cDNA,按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明進行PCR擴增,RT-qPCR反應條件為:95℃ 5 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個循環,使用2-ΔΔCt法計算LINC00943、miR-331-3p的表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列及產物長度

7.Western blot實驗:收集轉染后的細胞,提取總蛋白,BCA法測量蛋白濃度后,10% SDS-PAGE分離蛋白,并轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗KMT2A(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000),4℃孵育過夜,洗膜3次后加入HRP標記的二抗IgG(1∶10 000),ECL暗光反應,Image J軟件檢測蛋白表達。

8.細胞增殖實驗:將轉染后的細胞接種在96孔板中,每組設置3個復孔,加入MTT溶液,酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD值)。

9.細胞遷移和侵襲:Transwell小室法檢測HeLa細胞遷移和侵襲。將細胞加入無血清DMEM上腔進行細胞遷移,細胞侵襲上腔涂有Matrigel,下腔加入10%胎牛血清的DMEM,孵育24 h,結晶紫染色,顯微鏡下對遷移和侵襲細胞進行計數。

10.細胞凋亡實驗:將轉染后的細胞置于96孔板中,室溫下孵育48 h,結合緩沖液重懸,加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色,流式細胞儀分析細胞凋亡率。

11.裸鼠體內腫瘤形成實驗:4周齡BALB/c裸鼠分別皮下注射200 μl sh-NC或sh-LINC00943慢病毒轉染的HeLa細胞,記為sh-NC組或sh-LINC00943組,每組5只裸鼠。4周后,處死小鼠剝離腫瘤,測量腫瘤重量,Western blot檢測移植瘤組織中KMT2A、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平。實驗經過本院動物倫理審查委員會審查。

三、統計學分析

結 果

一、LINC00943在CC細胞系中的表達

RT-qPCR結果顯示,與正常宮頸上皮細胞Ect1/E6E7比較,CC細胞系中LINC00943表達顯著升高(P<0.05),且HeLa細胞中LINC00943表達水平最高,因此選取HeLa進行后續實驗(圖1)。

注:與Ect1/E6E7比較,*P<0.05。

二、Hela細胞中LINC00943與miR-331-3p的相互作用

亞細胞分離實驗顯示,Hela細胞的細胞質中LINC00943的百分比高于細胞核(圖2A)。RNA pull down實驗顯示,Bio-miR-331-3p-wt中,LINC00943高度富集(圖2B)。使用Targetscan獲得LINC00943與miR-331-3p的結合位點(圖2C)。雙熒光素酶活性檢測顯示,與miR-NC組相比較,miR-331-3p mimics加了LINC00943-wt的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),加了LINC00943-mut的熒光素酶活性則無顯著差異(P>0.05)(圖2D)。RT-qPCR結果顯示,與sh-NC比較,sh-LINC00943組LINC00943表達顯著降低,miR-331-3p表達顯著增加(P<0.05);與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor組miR-331-3p表達顯著降低(P<0.05)(圖2E、圖2F)。

A:細胞核和細胞質中LINC00943的表達占比;B:RNA pull-down實驗各組LINC00943相對表達量;C:Targetscan分析LINC00943與miR-331-3p的結合位點;D:雙熒光素酶基因報告檢測LINC00943和miR-331-3p之間的相互作用;E:下調LINC00943后各組細胞LINC00943相對表達量;F:下調LINC00943后,各組細胞miR-331-3p相對表達量。注:與Bio-NC組、miR-NC組或sh-NC組比較,*P<0.05;與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,#P<0.05。

三、下調LINC00943對CC細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和EMT的影響

與sh-NC比較,sh-LINC00943組細胞增殖、遷移和侵襲顯著降低,細胞凋亡率顯著增加,E-cadherin表達顯著上調,N-cadherin表達顯著下調(P<0.05);與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor組細胞增殖、遷移和侵襲顯著增加,細胞凋亡率顯著降低(圖3、圖4),E-cadherin蛋白表達顯著下調,N-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.05)(圖5)。

圖3 下調LINC00943對各組細胞遷移(光鏡400×)、侵襲(光鏡400×)、凋亡的影響

A:各組細胞增殖曲線圖;B:各組遷移細胞數比較;C:各組侵襲細胞數比較;D:各組細胞凋亡灰度圖。注:與sh-NC組比較,*P<0.05;與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,#P<0.05。

A:Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達;B:各組E-cadherin蛋白表達水平比較;C:各組N-cadherin蛋白表達水平比較。注:與sh-NC組比較,*P<0.05;與sh-LINC00943+NC inhibitor組比較,#P<0.05。

四、Hela細胞中miR-331-3p與KMT2A的靶向關系

使用Targetscan預測miR-331-3p與KMT2A存在結合位點(圖6A),表明KMT2A是miR-331-3p下游基因。雙熒光素酶活性檢測顯示,與miR-NC組相比較,miR-331-3p mimics組加入KMT2A-wt后,熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而KMT2A-mut則無顯著改變(P>0.05)(圖6B)。RT-qPCR顯示,與miR-NC組比較,miR-331-3p mimics組miR-331-3p表達顯著增加,miR-331-3p mimics組、miR-331-3p mimics+pcDNA組和miR-331-3p mimics+KMT2A組比較無顯著差異(P>0.05)(圖6C)。miR-331-3p mimics組KMT2A蛋白表達顯著低于miR-NC組,與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,miR-331-3p mimics+KMT2A組KMT2A蛋白表達顯著增加(P<0.05)(圖7)。

A:Targetscan分析miR-331-3p與KMT2A的結合位點;B:雙熒光素酶基因報告檢測miR-331-3p與KMT2A的相互作用;C:轉染miR-331-3p mimics后,各組細胞中miR-331-3p相對表達。注:與miR-NC組比較,*P<0.05。

A:Western blot檢測KMT2A蛋白表達;B:各組KMT2A蛋白表達水平比較。注:與miR-NC組比較,*P<0.05;與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,#P<0.05。

五、miR-331-3p通過調控KMT2A對HeLa細胞增殖、凋亡和EMT的影響

與miR-NC組比較,miR-331-3p mimics組細胞活力、遷移和侵襲顯著降低,細胞凋亡率顯著增加,E-cadherin表達顯著上調,N-cadherin表達顯著下調(P<0.05);與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,miR-331-3p mimics+KMT2A組細胞活力、遷移和侵襲顯著增加,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖8、圖9),E-cadherin蛋白表達顯著下調,N-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.05)(圖10)。

圖8 miR-331-3p通過調控KMT2A對HeLa細胞遷移(光鏡400×)、侵襲(光鏡400×)和凋亡的影響

A:各組細胞增殖曲線圖;B:各組細胞遷移比較;C:各組細胞侵襲比較;D:流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。注:與miR-NC組比較,*P<0.05;與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,#P<0.05。

A:Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達;B:各組E-cadherin蛋白表達水平比較;C:各組N-cadherin蛋白表達水平比較。注:與miR-NC組比較,*P<0.05;與miR-331-3p mimics+pcDNA組比較,#P<0.05。

六、體內腫瘤實驗

與sh-NC比較,sh-LINC00943組腫瘤重量顯著降低,LINC00943表達顯著降低,miR-331-3p表達顯著增加(P<0.05)(圖11);Western blot顯示,KMT2A、N-cadherin顯著降低,E-cadherin蛋白水平顯著增加(P<0.05)(圖12)。

A:兩組裸鼠體內腫瘤重量比較;B:兩組細胞LINC00943表達水平比較;C:兩組細胞miR-331-3p表達水平比較。注:與sh-NC組比較,*P<0.05。

A:Western blot檢測KMT2A、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達;B:兩組細胞KMT2A蛋白表達水平比較;C:兩組細胞E-cadherin蛋白表達水平比較;D:兩組N-cadherin蛋白表達水平比較。注:與sh-NC組比較,*P<0.05。

討 論

CC是女性常見的惡性腫瘤之一,尤其在不發達國家發病率較高,CC患者在初次治療后的最初幾年內易發生盆腔復發或遠處轉移的風險[13],因此,尋找潛在生物標志物對CC治療和預后至關重要。最近幾年內,LncRNA被確定為包括CC在內的多種癌癥的重要標志物[14]。研究表明,LncRNA DLEU2通過miR-455-3P/OTUD7B軸激活PI3K/AKT信號通路促進CC的惡性進展[15]。據報道,構建與免疫相關的LINC00943 ceRNA網絡,有助于癌癥患者存活率的預后評估[16],而有關LINC00943對CC調控機制的研究還未見報道。本研究結果顯示,在CC細胞系中LINC00943表達顯著上調,其中HeLa細胞中LINC00943表達最高,這是因為HeLa細胞比其它細胞擴增得快。由于HeLa細胞中LINC00943表達最高,敲低LINC00943表達的效果最顯著,故選擇HeLa細胞進行后續實驗。沉默LINC00943可抑制細胞增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。EMT是上皮細胞向間充質細胞轉化的細胞過程。早期腫瘤的轉移與EMT密切相關,EMT可加速腫瘤的遷移和侵襲[17]。有研究表明,EMT過程在CC轉移和侵襲過程中起主要作用,例如:沉默LncRNALINC01305可以抑制TNXB介導的PI3K/Akt信號通路,從而抑制CC細胞EMT[18]。高表達LncRNA UNC5B-AS1可以增強TLR信號通路,促進CC細胞增殖和EMT能力[19]。本研究結果顯示,沉默LINC00943可促進E-cadherin表達,同時抑制N-cadherin表達,提示沉默LINC00943可抑制EMT,發揮抑癌作用。

LncRNA可作為ceRNA抑制miRNA表達,進而調控癌癥的生物學行為[20]。Buranjiang等[21]研究顯示,LncRNAHOTAIR通過海綿化miR-331-3p增強染色體凝縮調控因子2(RCC2)表達,加速CC進展。本研究發現,LINC00943主要分布在細胞質中,且與miR-331-3p存在靶向關系。已證實,miR-331-3p可以調節腫瘤的進展,并可作為獨立的預后因素。相關研究表明,miR-331-3p在CC中高表達,LncRNAXLOC-006390可作為ceRNA反向調節miR-331-3p和miR-338-3p的表達,促進CC的發生和轉移[22]。本研究結果顯示,過表達miR-331-3p可抑制CC增殖、遷移、侵襲和EMT,促進細胞凋亡,而LINC00943可負調控miR-331-3p的表達,促進CC惡性生物學行為發生,抑制miR-331-3p表達可逆轉沉默LINC00943表達對CC增殖、遷移、侵襲和EMT的抑制作用。

KMT2A是具有H3K4甲基轉移酶活性的轉錄共激活劑,可以調節癌癥細胞活力、遷移和凋亡。據報道,KMT2A的高表達與腫瘤患者的不良預后有關[23]。敲低KMT2A表達可抑制黑色素瘤細胞的活力和腫瘤球的形成[24]。在骨髓增殖性腫瘤中,檢測到KMT2A陽性率顯著增加,其突變體KMT2A G3131S可促進細胞增殖和菌落形成能力[25],但是,KMT2A在CC上的作用機制鮮有報道。本研究發現,過表達KMT2A可逆轉miR-331-3p上調對CC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT的抑制作用。體內研究表明,沉默LINC00943可抑制腫瘤生長和EMT,并下調KMT2A表達,與體外實驗結果一致。提示沉默LINC00943可通過負調控miR-331-3p降低KMT2A表達,抑制CC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT,促進細胞凋亡。

綜上所述,LINC00943在CC細胞中高表達,當其表達下調時,可以通過調控miR-331-3p/KMT2A軸抑制CC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT,誘導細胞凋亡。但LINC00943與CC臨床患者中的病理特征和預后的關系仍有待深入研究。