環磷酰胺不同劑量及停藥周期構建小鼠卵巢早衰動物模型比較研究

莫金樺，胡鴻，顏秋霞，李鵬東，陳彩蓉*

(廣州醫科大學附屬清遠醫院(清遠市人民醫院)1.生殖醫學中心;2.中心實驗室,清遠 511500)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF) 指40歲前出現卵巢功能衰竭,閉經時間≥4個月、兩次月經間隔>4周、卵泡刺激素(FSH)>40 U/L并伴有雌激素水平降低及絕經癥狀,患者生育能力近乎喪失,嚴重影響身心健康和生活質量,引發骨、心腦血管以及神經系統等病變[1-3]。文獻報道,40歲以前POF發生率為1%,30歲以前發生率為1‰[4]。根據WHO的預測,全世界不孕癥的發病率日趨上升,將成為僅次于腫瘤、心腦血管病的第三大疾病[5]。隨著不孕癥發病率的日趨升高,POF作為女性不孕癥的主要原因之一,其發病人群將進一步增加[6]。然而,POF的病因及發病機制至今尚未完全闡明[7-8],其中包括遺傳因素、免疫因素、醫源性因素如手術及放化療等、環境因素,以及占半數以上的不明因素。目前對于POF的治療,主要包括補充雌激素及對不孕癥的治療,缺乏從根本上改善卵巢功能的治療方法[9]。鑒于此,關于POF疾病的基礎研究對臨床工作具有非常重要的意義,而動物模型是研究其病因、機制、治療的基礎。

目前常見的POF動物模型有化療藥物模型、基因敲除模型、半乳糖血癥模型和自身免疫性疾病模型等[10]。這些模型都側重于不同的病因學,均有著各自的獨特性和局限性,如基因敲除、半乳糖血癥和自身免疫疾病在臨床上發病率較低,缺乏代表性。隨著腫瘤發病的年輕化,化療所致的女性POF問題日益突出[11]。尤其對年輕未孕育女性,如何在化療時保護卵巢功能、如何恢復化療所致生育力損傷都是亟待解決的問題。環磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是一種常用的廣譜抗腫瘤藥和免疫抑制劑,具有嚴重的生殖毒性,使用CTX不同劑量及周期均可出現POF的典型表現[10];但是不同的劑量及停藥周期使模型的穩定性存在一定偏差,且尚不清楚CTX在停藥后何時達到對卵巢功能損害之最,以及POF模型治療時間窗。本研究擬比較CTX不同造模劑量和停藥周期構建的小鼠POF模型,探索制備小鼠POF的最佳劑量及停藥周期,為進一步研究POF提供更為適用的實驗模型。

材料和方法

一、實驗材料

1.實驗動物:7周齡的C57BL/6雌性SPF小鼠購自廣東斯嘉景達生物科技有限公司[SCXK(粵) 2020-0052],體重(18±1)g,飼養于廣州醫科大學附屬清遠醫院(清遠市人民醫院)實驗動物中心[SCXK(粵)2014-0082]。飼養條件為SPF級,溫度(22±2)℃,相對濕度50%～60%,自由飲食,每天光照時間12 h,適應性喂養一周后進行后續實驗。所有實驗操作均在該院醫學實驗中心進行,嚴格遵守實驗中心的規范要求,并得到動物倫理委員會的許可(批件號:LAEC-202208-032)。

2.主要試劑及儀器:環磷酰胺-水合物(CTX;貨號C0768,Sigma-Aidrich,美國);小鼠抗苗勒管激素ELISA Kit(貨號JYM0786M0)、小鼠卵泡刺激素ELISA Kit(貨號JYM0417M0)、小鼠雌二醇ELISA Kit(貨號JYM0379M0)均購自武漢基因美;多聚甲醛購自武漢賽維爾。電子天平(BCE2241-1CCN型,賽多利斯,德國);離心機(H1-16K型,湖南可成儀器);輪轉式切片機(RM2016型,上海徠卡);包埋機(JB-P5,武漢俊杰);相差顯微鏡(E200型,尼康,日本)。

二、實驗方法

1.實驗分組與造模:(1)CTX誘導POF模型最佳CTX暴露劑量:C57BL/6雌性小鼠適應性喂養一周后,使用相差顯微鏡觀察陰道涂片、記錄小鼠動情周期(圖1),將動情周期規律的40只小鼠隨機分成5組:CON、CTX80(80 mg·kg-1·d-1)、CTX100(100 mg·kg-1·d-1)、CTX120(120 mg·kg-1·d-1)、CTX150(150 mg·kg-1·d-1),每組8只,連續腹腔注射10 d,其中CON組注射生理鹽水,其余組注射CTX。記錄開始注射至停藥7 d內小鼠的活力、毛發、體重、動情周期和卵巢臟器系數,比較得出CTX誘導POF模型最佳CTX暴露劑量。

圖1 正常小鼠動情周期陰道涂片

(2)CTX誘導POF模型最佳CTX停藥周期:C57/BL6雌性小鼠適應性喂養一周后,將動情周期規律的小鼠使用最佳CTX暴露劑量重新造模,隨機分為模型組(24只)和對照組(24只),分別在停藥后第1、2、3、4周隨機選取6只小鼠,檢測其血清抗苗勒管激素(AMH)、FSH、E2水平,分析其卵巢臟器系數,卵巢HE染色計數各級卵泡,比較得出CTX誘導POF模型最佳停藥周期。對照組分組記為:CON-1W、CON-2W、CON-3W和CON-4W;模型組分組記為:CTX-1W、CTX-2W、CTX-3W、CTX-4W。

2.體重變化與卵巢臟器系數:自注射CTX開始,到試驗取材,記錄每只小鼠體重變化,觀察周期結束后,頸椎脫臼處死小鼠,取雙側卵巢組織進行稱重,拍照記錄。卵巢臟器系數=雙側卵巢質量(g)/體重(g)×10 000()。

3.血清性激素檢測:自注射結束日為D0,分別于D7(1W)、D14(2W)、D21(3W)、D28(4W) 通過眼球摘除法取血,常溫靜置30 min,待血清析出,3 000 r/min離心15 min后取上清(血清),-80℃冰箱內保存備用。血清收集完整后,酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清E2、FSH、AMH的含量。

4.卵巢組織形態觀察與卵泡計數:4%多聚甲醛溶液固定卵巢組織24 h,經脫水、透明,卵巢最大平面石蠟包埋,5 μm切片,每隔10 μm取一張,每個組織取3張切片,常規HE染色后,每張切片全視野觀察卵巢的組織學變化及各級卵泡個數,最終卵泡計數為3張切片計數之和除以3。

三、統計學分析

結 果

一、模型小鼠一般情況比較

CTX150組小鼠自注射第3天開始出現明顯的進食減少、活力減退,第5天開始出現脫毛,其中2只小鼠分別于注射CTX第7天及停藥第2天死亡,由于CTX150組出現死亡,說明CTX 150 mg·kg-1·d-1劑量過大,不適合進行小鼠POF造模,后續部分結果不納入統計。CTX100組和CTX120組小鼠注射CTX第6天開始出現進食減少、活力減退和脫毛;而CTX80組小鼠在注射CTX后雖也出現進食減少、活力減退,但直至停藥后才開始出現脫毛。各組小鼠用藥前動情周期規律,約為4～5 d(圖1)。CTX暴露后,CTX80組小鼠仍有完整的動情周期,但延長至6～7 d,CTX120組和CTX100組小鼠則出現動情周期紊亂,在停止暴露的1周內基本處于動情間期,少見動情后期(CTX100組有3只小鼠共出現4次動情后期,CTX120組僅1只小鼠出現1次動情后期),未見動情期,說明CTX 80組劑量不足,剔除該劑量小鼠POF造模。

二、各組小鼠體重和卵巢臟器系數比較

CTX150組注射CTX過程中小鼠體重下降最快。CTX其他組第4天開始小鼠體重均低于CON組,但第4～7 天差異無統計學意義(P>0.05),第8天開始CTX小鼠體重均顯著低于CON組(P<0.05),但各CTX組間無顯著差異(P>0.05);CTX小鼠體重在停藥后開始回升,且與CON組體重差逐漸減小,但至停藥第7天仍顯著低于CON組(P<0.05)(圖2A)。在停藥1周時各CTX組卵巢臟器系數顯著低于CON組(P<0.01),且CTX100最低(P<0.001),但各CTX組間差異無統計學意義(P>0.05),對比得出CTX100(100 mg·kg-1·d-1×10 d)是誘導卵巢早衰模型最佳CTX暴露劑量(圖2B)。

A:造模不同時期小鼠體重變化(第1～10天為藥物注射日,第11～17天為停藥后);B:停藥第7天時各組卵巢臟器系數比較情況。注:與CON組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

在研究最佳停藥周期時,模型組使用CTX 100 mg·kg-1·d-1×10 d的最佳劑量造模。隨停藥周期延長,模型組與對照組體重差逐漸減小,但到4W時模型組小鼠體重仍顯著低于對照組[(20.03±0.55)g vs.(21.38±1.29)g,P<0.01],而這種趨勢差異在卵巢質量[(5.43±0.67)mg vs.(8.41±1.07)mg,P<0.001]和卵巢臟器系數[(2.71±0.31)vs.(3.92±0.70),P<0.001]同樣存在,說明CTX 100 mg·kg-1·d-1×10 d誘導的POF模型具有較好的穩定性(表1)。模型組組內比較時,相比1W,體重在2W、3W、4W增長,但只有在3W時差異有統計學意義(P<0.05);而卵巢質量和卵巢臟器系數僅在2W、3W時增長,4W時相對降低,但是只有卵巢質量在3W時差異有統計學意義(P<0.05),展現出模型組體重和卵巢臟器系數并未隨停藥周期延長而出現明顯差異,同樣反映出較好的模型穩定性(表1)。

表1 CTX不同停藥周期小鼠卵巢早衰模型參數比較(-±s)

三、血清性激素水平比較

模型組(CTX)小鼠在停止CTX暴露后的第1、2、3、4W,血清AMH、E2水平均顯著低于同期對照組(P<0.05),而FSH在第1、3、4W均顯著高于同期對照組(P<0.05),血清性激素水平符合POF模型特征(表2)。模型組組內比較時,AMH水平隨停藥周期延長呈進行性下降趨勢,而FSH水平在3W、4W時顯著低于1W和2W(P<0.001),E2水平在3W、4W時顯著高于1W和2W(P<0.001),但是E2和FSH水平在1W和 2W間、3W 和 4W間的差異均無統計學意義(P>0.05),呈現出隨停藥周期延長,小鼠血清E2和FSH開始出現一定程度回復、而AMH呈持續走低的狀態(表2)。

表2 CTX不同停藥周期小鼠性激素水平比較(-±s)

四、卵巢組織形態與卵泡計數

模型組在CTX停藥后的第1、2、3、4W卵巢組織肉眼可見的小于同期CON組(圖3)。模型組在CTX停藥后的第1、2、3、4W原始卵泡、初/次級卵泡均顯著低于同期CON組,第3、4W成熟卵泡計數均顯著低于同期CON組,而第1、2、4W的閉鎖卵泡計數均顯著高于同期CON組(P<0.05),符合POF特征表現。隨CTX停藥周期延長,模型組小鼠原始卵泡、初/次級卵泡、成熟卵泡計數呈進行性下降,閉鎖卵泡計數升高(P<0.05),展現出CTX對卵巢損傷呈進行性加重(圖4)。

紅色箭頭:對照組;黑色箭頭:模型組。每個卵巢組織代表1只小鼠。

A1～A4:對照組;B1～B4:模型組。1～4分別代表停藥后第1～4周。注:與同期對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

討 論

隨著經濟和醫學的發展,腫瘤和自身免疫疾病早期診斷率的升高,化療藥物在臨床上的廣泛應用,化療所致的女性POF問題日益突出[1]。POF增加了不孕癥發病率和退行性健康問題,如心血管疾病、骨質疏松、抑郁焦慮和神經認知障礙等,嚴重影響了生活質量,使POF患者承受著心理、生理的雙重打擊[12-13]。但暫無針對POF有效的治療方法,需要進一步的動物模型和臨床研究去探索。目前POF建模方式多樣,操作復雜程度、模型穩定性差異較大[10]。由于化療藥物造模具有造模時間短,操作簡單,穩定性好且重復率高,在研究中較為常用。CTX是一種廣譜抗腫瘤藥和免疫抑制劑[14],是治療卵巢癌、乳腺癌、白血病、惡性淋巴瘤及自身免疫性疾病等常用的化療藥物,價格低廉,同時具有嚴重的生殖毒性,損傷顆粒細胞,引發POF[13],是誘導POF的最佳造模方式。但是當前CTX構建小鼠POF模型方式各異,模型穩定性有待探討。Nguyen等[15]用CTX 300 mg/kg單次靜脈注射,在24 h內即可顯著消耗小鼠的原始卵泡,構建POF模型,但是劑量過大,且與臨床周期化療不符;亦有腹腔注射CTX 120 mg·kg-1·d-1,連續2周,停止暴露后即可成模[16]。更多的研究者使用大劑量沖擊+后續小劑量維持的方法建模,如:CTX 200 mg/kg單次腹腔注射,后續8 mg·kg-1·d-1連續14 d的小劑量維持,以此構建POF模型[17],但該類模型與臨床POF表現有待進一步考量。而Bahrehbar等[18]對比了白消安50 mg/kg+CTX 100 mg/kg連續10 d、CTX 100 mg/kg連續10 d、首次CTX 200 mg/kg +白消安50 mg/kg及后續9 d的CTX 50 mg/kg+白消安 5 mg/kg、單次CTX 200 mg/kg+白消安20 mg/kg,發現CTX 100 mg/kg連續10 d構建小鼠POF成模最佳。多項研究發現,在構建小鼠POF模型時,使用CTX暴露天數各有不同[10,19]。本研究為提高造模成功率及減少暴露藥物劑量,選擇10 d作為暴露天數。目前,關于CTX誘導POF小鼠模型所用劑量和停藥周期的優化組合,未見系統報道,且達到卵巢功能損害之最的最佳停藥周期亦不清楚。研究CTX誘導小鼠POF模型所用最佳造模劑量可提高模型穩定性,而探討最佳停藥周期將對POF模型治療時間窗的確定具有重要意義。

本研究通過腹腔注射不同劑量的CTX,首先觀察小鼠的一般狀況,與CON組相比,各CTX組先后出現不同程度的毛發脫落、活動量減少、體重下降和動情周期紊亂。CTX150組造模過程中小鼠體重下降過快,最終出現小鼠死亡情況,說明CTX150劑量過大,不適合進行POF造模,故剔除出后續數據統計。在停止CTX暴露后小鼠體重迅速回升,各CTX組間無統計學差異(P>0.05),但至停藥1周各CTX組小鼠體重仍顯著低于CON組,說明CTX對小鼠的毒性損傷仍在持續。當前并未見CTX對卵巢功能損害最佳干預時間的系統性研究報道,這也是本研究后續探討CTX停藥周期的原因之一。與成年女性相似,小鼠陰道黏膜上皮細胞也可隨著體內雌激素的變化而出現典型的動情周期,通過陰道涂片法可觀察出小鼠所處的動情周期,進而評估卵巢的功能變化[20]。CTX120和CTX100小鼠在停止暴露的1周內未見動情期,說明較高劑量的CTX明顯損傷了卵巢功能,導致動情周期紊亂[21];然而CTX80仍存在完整的動情周期,說明CTX80劑量不足,故對比后得出CTX80并非最佳模型誘導劑量。卵巢是重要的生殖器官,卵巢臟器系數反映了雌鼠的生殖功能[22]。在停藥1周時,CTX100組卵巢臟器系數最低(P<0.001),但各CTX組間差異無統計學意義(P>0.05);再結合上文Bahrehbar等[18]的研究基礎,以及考慮到盡量縮小藥物對實驗動物傷害的倫理要求,故在對比不同CTX劑量誘導POF小鼠模型效果后,得出以100 mg·kg-1·d-1連續暴露10 d作為CTX誘導小鼠POF模型的最佳造模劑量。

為進一步探討最佳停藥周期,本研究使用最佳環磷酰胺暴露劑量(100 mg·kg-1·d-1×10 d)重新造模進行后續研究。相比對照組,模型組小鼠在停止CTX暴露后的第1周AMH水平、E2水平、原始卵泡、初/次級卵泡、成熟卵泡計數均有所降低,而FSH水平、閉鎖卵泡計數均顯著升高(P<0.05),這與常規POF造模特性相符[12]。同樣的,在后續的第2、3、4W也呈現出類似的表現。卵巢臟器系數隨停藥的時間的延長呈現出第2W顯著升高(P<0.05),而從第3W開始下降,第4W低于第1W(表1),且更為客觀代表卵巢功能的各級卵泡計數也處于下降趨勢,這可能與卵巢組織的纖維增生有關[3],也從側面說明CTX對卵巢功能的損害具有持續性并進行性加重。結合血清性激素水平、卵巢臟器系數和卵巢病理,可以得出結論:使用CTX 100 mg/kg連續暴露10 d,對小鼠卵巢損害呈進行性加重,隨著停藥時間延長血清FSH出現一定程度下降和E2水平回升,但卵巢功能仍處于卵巢早衰狀態,具有良好的模型穩定性;考慮到干預治療時間窗,最佳成模時間為停藥后1周。

同時,我們發現一個有趣的現象,血清E2在對照組和模型組的組內比較顯示,1W和2W水平均顯著低于3W和4W(P<0.01),但1W和 2W間、3W和4W間的差異均無統計學意義(P>0.05);且FSH也表現出類似情況(表2)。由于1W和2W在同一批次行ELISA檢測,而3W和4W在另一批次檢測,這種差異可能由檢測批次不同而造成,為消除這種偏倚,后續試驗中如需對同一指標進行統計對比,則最好在同一批次進行。再者,考慮到FSH由垂體前葉嗜堿性細胞分泌,AMH由竇前卵泡和竇卵泡的顆粒細胞合成、分泌[23],結合本研究小鼠血清AMH隨停藥周期延長呈進行性下降,在小鼠POF模型中評估激素標志物時,建議優先使用AMH,次之FSH。Farzaneh等[24]對就診的96例患者測量血清AMH和FSH水平,發現與FSH相比,AMH的靈敏度更高(80% vs. 28.57%),特異性幾乎相同(78.89% vs. 78.65%)。此外,AMH(98.61%)和 FSH(87.5%)的陰性預測值也不同。但陽性預測值相同(17.39%)。得出AMH的診斷準確性高于FSH,AMH對POF的早期診斷更適用。顯然Farzaneh的研究結論也證實該現象,但仍須進一步研究佐證。本研究不足之處,未對模型組進行配種,驗證模型小鼠的生育能力和F1代的卵巢功能的影響,后續開展干預治療研究時應同步進行。

綜上所述,本研究通過比較CTX不同造模劑量和停藥周期構建的小鼠卵巢早衰動物模型,以100 mg·kg-1·d-1連續暴露10 d為CTX誘導小鼠POF模型的最佳造模劑量,最佳成模時間為停藥后1周。