沙棘乙酸乙酯萃取物化學成分分析及體外抑制幽門螺桿菌機理研究

馬賀,雷梅英,王家娟,麻玉雯,王樹林

(青海大學 農牧學院,青海 西寧,810016)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是一種帶有鞭毛的革蘭氏陰性微需氧細菌,通常會感染胃黏膜上皮細胞,導致胃炎、胃癌和胃及十二指腸潰瘍[1]。報告稱,全球感染幽門螺桿菌的人口約44億,超過世界一半以上的人口[2]。隨著生活水平及醫療水平的提高,發達國家感染率逐漸下降,但發展中國家感染率依然很高。早期治療以抗生素為主,通常采用標準三聯療法(包含克拉霉素和甲硝唑或阿莫西林與質子泵抑制劑的組合)。但是,由于抗生素的廣泛使用,標準三聯療法的療效急劇下降,根除率低至50%～70%[3]。幽門螺桿菌的抗生素耐藥性逐漸增強,除此之外,抗生素還會對人體產生副作用,增加治療成本。因此,人們積極尋找有效的抗幽門螺桿菌藥物,其中關于天然植物提取物抑制幽門螺旋桿菌的研究逐漸增多,其優點是對人體沒有副作用,且不會增加細菌耐藥性。

迄今為止,已發現的抗幽門螺桿菌植物有240余種。天然植物活性成分治療幽門螺旋桿菌感染已成為食品、藥學等學科領域的研究熱點。IBRAHIM等[4]使用羽穗草醇提物與連續萃取物(乙醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇)進行抑制幽門螺桿菌活性實驗,結果發現乙醚萃取物抗幽門螺桿菌效果最好,其對臨床分離出75%的幽門螺桿菌具有抑制作用。此外,研究報道腺毛巖白菜根乙酸乙酯相提取物抗幽門螺桿菌效果優于甲醇粗提物,可能是由于純化提高了活性成分的效力[5]。目前,已有多名學者從細胞水平上探究植物提取物對幽門螺桿菌的抑菌機制,如抗生物膜形成[6]、脲酶抑制[7]、增強細胞外膜通透性[8]、細菌結構破壞[9]等。沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科、沙棘屬落葉灌木,其作為一種天然植物資源,廣泛分布在亞洲和歐洲,果實富含維生素C、黃酮類、有機酸、生育酚和其他酚類化合物[10],具有很高的藥用及食用價值,在中國民間常用于治療胃部疾病。沙棘提取物在抗動脈粥樣化、抗腫瘤、保護肝臟、保護心血管、保護皮膚以及保護胃腸道等方面都有重要作用[10]。而關于沙棘對幽門螺桿菌抑制作用的相關研究相對較少,早在2005年,LI等[11]研究發現沙棘葉乙醇提取物和水提物對幽門螺桿菌有抑制作用。2015年,MAMEDOV等[12]對沙棘果油和沙棘籽油進行了抗幽門螺桿菌實驗,發現沙棘油對幽門螺桿菌的抑制效果不明顯。最近,常應九[13]發現沙棘果乙醇提取物對幽門螺桿菌具有較強的抑制活性,還發現沙棘果提取物通過非競爭性抑制方式抑制脲酶活性,降低脲酶相關基因表達。而關于沙棘果提取物抑制幽門螺桿菌的化學成分以及細胞水平上的抑菌機制鮮有報道。

本文前期工作對沙棘果進行乙醇超聲提取,得到乙醇粗提物后用有機溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對乙醇粗提物依次進行液-液萃取,分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相組分,對4種萃取組分進行抑制幽門螺桿菌活性測定,結果顯示,沙棘乙酸乙酯萃取物抑制幽門螺桿菌效果最好,其最小抑菌濃度為2.5 mg/mL,最小殺菌濃度為5 mg/mL。因此,本研究基于前期工作,利用高效液相色譜法測定了沙棘乙酸乙酯萃取物中的化學成分,并從膜結構、脲酶活性以及細胞微觀結構等方面深入探討其抑菌機制,為沙棘活性物質抗幽門螺桿菌研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

野生沙棘(屬中國沙棘亞種)鮮果采摘于青海省海東市(海拔高度3 000～3 300 m,36.37°N,102.27°E);幽門螺桿菌標準株(ATCC 43504),購自美國菌種保藏中心,保存于青海大學實驗室-80 ℃冰箱。

布氏肉湯培養基、1×PBS(pH 7.2～7.4)、尿素、KI,索萊寶生物科技有限公司;N-苯基-1萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)、戊二醛固定液,上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),天津富宇精細化工有限公司;EDTA,天津市致遠化學試劑有限公司;結晶紫、甲酚紅,上海展云化工有限公司;胎牛血清,浙江天杭生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜級),西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;磷酸,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;YM50立式壓力蒸汽滅菌器,上海三申醫療器械有限公司;Varioskan LUX多功能酶標儀,美國Thermo Fisher公司;JSM-7900F場發射掃描電鏡,日本電子株式會社;LC-10 Avp 高效液相色譜,日本Shimadzu有限公司;THZ-103B恒溫培養搖床,上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 沙棘乙酸乙酯萃取物制備

采用95%乙醇超聲提取,得到乙醇提取物浸膏,浸膏經過石油醚萃取后,萃余相用乙酸乙酯萃取并將萃取物減壓濃縮,將萃取物放置在通風櫥將溶劑揮干,得到乙酸乙酯萃取物,置于4 ℃冰箱備用。

1.4 幽門螺桿菌培養

將H.pylori菌種接種至含有6%胎牛血清(體積分數,下同)和少量抗生素的布氏肉湯培養基中[13],在37 ℃微需氧環境下培養2～3 d,使用微需氧產氣袋和2.5 L密閉培養盒達到所需微需氧環境。

1.5 沙棘乙酸乙酯萃取物抑菌機理的研究

1.5.1 對生物膜形成的影響

參考文獻[14]并稍做修改。將H.pylori培養48 h,用含6%胎牛血清布氏肉湯培養基稀釋菌液,使OD600值為0.15后加入96孔板中。在上述孔中加入不同質量濃度(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)乙酸乙酯萃取物,并以未加乙酸乙酯萃取物的處理組作對照。37 ℃靜置培養48 h后,抽吸培養基,用PBS沖洗2次,37 ℃孵育10 min至干燥。將250 μL 0.1%結晶紫加入孔,染色反應5 min后吸去結晶紫并用PBS洗滌2次,在37 ℃烘箱烘至干燥,加入洗脫劑無水乙醇于570 nm處測定吸光值,按公式(1)計算生物膜形成率:

(1)

式中:A樣品與A對照分別為沙棘乙酸乙酯萃取物處理組和對照組在570 nm處的吸光值。

1.5.2 細胞外膜滲透率的影響

采用NPN攝取法測定沙棘乙酸乙酯萃取物對幽門螺桿菌外膜的滲透能力[8]。將H.pylori培養48 h后,4 500 r/min離心10 min,并在PBS中洗滌2次后重懸于PBS,使其OD600=1.0±0.02。在菌懸液中加入不同質量濃度(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)的乙酸乙酯萃取物,以DMSO作為對照,在37 ℃生化培養箱中培養4 h,用PBS洗滌2次,在96孔板中加入菌液和40 μmol/L NPN后,在37 ℃孵育30 min后進行熒光測量。熒光測量使用多功能酶標儀,激發波長為350 nm,發射波長為420 nm,激發帶寬5 nm。所有測定均為3個重復。

1.5.3 細胞膜完整性的影響

參考TANG等[15]的方法,檢測胞質成分(如DNA、RNA和蛋白質)的釋放來評價細菌細胞膜的完整性。將培養48 h的H.pylori菌液,6 000 r/min離心10 min,用PBS洗滌2次后再次離心5 min,得到菌體。將菌體重懸到PBS中,使得OD600=1.0±0.02。將H.pylori菌懸液與乙酸乙醇提取物(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)混合,在37 ℃下孵育12 h,離心取上清液。采用酶標儀在260 nm和280 nm處測定吸光值,以DMSO作為對照,以PBS作為參比。

1.5.4 膜蛋白的影響

根據LI等[16]的方法稍作修改。將培養48 h的H.pylori菌液,在4 500 r/min離心10 min收集菌體,用PBS洗滌菌體2次,菌體重懸在PBS中,使其OD600=1.0±0.02。吸取200 μL菌液與50 μL不同濃度的0.9%生理鹽水配制的KI(0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mol/L)或乙酸乙醇提取物(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)在25 ℃孵化1 h,以DMSO作為對照。在激發波長(色氨酸)280 nm、(酪氨酸)296 nm處測定細菌的熒光發光值。

1.5.5 脲酶活性的影響

參考文獻[7]并稍做修改,將H.pylori培養48 h后,收集菌體,并用0.9%生理鹽水稀釋至OD600=1.00±0.02,將菌液與含有不同濃度的乙酸乙酯萃取物(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)的培養基混合。在37 ℃培養2 h后,加入1.5 g/L尿素、1 g/L EDTA與0.2 g/L甲酚紅混合溶液,在37 ℃下孵育20 min。以DMSO作為對照。采用酶標儀在590 nm處測定吸光值。每組實驗重復3次。

1.5.6 細胞微觀結構的影響

參考文獻[9]并稍做修改。用不同質量濃度(0、2.5、5 mg/mL)乙酸乙酯萃取物處理OD600=0.5的細菌培養液。用5 mL乙酸乙酯萃取物與15 mL菌液在37 ℃孵育12 h,取5 mL菌液于10 mL離心管中,以4 500 r/min離心10 min,棄去上清液,加2.5%戊二醛溶液固定,渦旋振蕩5 min,在4 ℃冰箱黑暗處放置12 h,4 500 r/min離心5 min。棄去上清液加入1×PBS(pH 7.2～7.4)渦旋振蕩5 min,4 500 r/min離心10 min,棄去上清液,重復操作洗滌3次。離心后,用30%乙醇渦旋振蕩5 min,靜置5 min,4 500 r/min室溫離心5 min,棄去上清液。再依次使用50%、70%、80%、90%和100%乙醇進行洗脫。將樣品放在載玻片上,進行冷凍真空干燥,干燥后將樣品固定在樣品臺上,真空下濺射鍍金,然后用場發射掃描電鏡觀察。

1.6 乙酸乙酯萃取物化學成分分析

采用配備waters 2996紫外檢測器的waters 2695型高效液相色譜儀測定乙酸乙酯萃取物的化學成分。根據參考文獻[17]并稍做修改,測定乙酸乙酯萃取物中6種黃酮類物質,異鼠李素、槲皮素、山奈酚、兒茶素、沒食子酸和蘆丁。色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速1 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長280/360 nm,流動相甲醇-0.1%磷酸,標準品進樣量10 μL,樣品進樣量10 μL,沒食子酸和兒茶素在280 nm檢測波長下測定;蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素在360 nm檢測波長下測定。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 六種黃酮類物質的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of six flavonoids

蘋果酸測定根據王芮東等[18]的方法并稍做修改,色譜柱ODS(4.6 mm×250 mm,35 μm),流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,檢測波長210 nm,流動相甲醇-0.01 mol/L KH2PO4(3∶97,體積比)(用磷酸調節pH值為2.80),等度洗脫20 min。

通過對比樣品中不同化合物與異鼠李素、槲皮素、山奈酚、兒茶素、沒食子酸、蘆丁和蘋果酸等標準品的保留時間,定性確定化合物種類。通過測定不同濃度標準品的峰面積進行標準曲線的繪制,求得回歸方程和相關系數?；衔锏暮恳悦縢萃取物中含有的mg形式表示(即mg/g)。

1.7 數據統計分析

所有數據用平均值±標準差形式表示,使用SPSS 22.0 進行數據分析,采用Origin 2021進行繪圖。處理組數據與對照組數據進行t檢驗,*、**、***分別表示處理組與對照組相比,在0.05、0.01、0.001水平上差異顯著,即P<0.05、P<0.01和P<0.001。

2 結果與分析

2.1 沙棘乙酸乙酯萃取物對生物膜形成的影響

幽門螺桿菌分泌蛋白質、多糖、胞外DNA和其他分子,在胃黏膜定居后產生胞外聚合物,這些聚合物被細菌包裹并黏附在一起形成生物膜。與浮游細菌相比,能形成生物膜的菌落對不利環境(如抗生素、高酸性)具有很高的抵抗力[19]。生物膜的存在使得幽門螺桿菌對抗生素的耐藥性增強,因此減少生物膜合成可使幽門螺桿菌抵抗力減弱。如圖1所示,當萃取物質量濃度≥0.625 mg/mL時,生物膜形成率與對照存在差異(P<0.01),說明在此濃度時,萃取物對生物膜的形成產生影響,降低了生物膜的形成。生物膜形成率隨著萃取物濃度的增加而降低,當萃取物質量濃度為5 mg/mL時,生物膜形成率低至28.23%。

圖1 乙酸乙酯萃取物對生物膜形成的影響Fig.1 Inhibition of EA on biofilm formation

本結果表明,沙棘乙酸乙酯萃取物對幽門螺桿菌生物膜形成具有很強的抑制率,說明沙棘乙酸乙酯萃取物通過抑制幽門螺桿菌生物膜的形成減弱其對外環境的抵抗力,更容易被殺死。此外,PRASAD等[6]觀察到菖蒲水提物能夠抑制幽門螺桿菌生物膜的形成。因此,破壞幽門螺桿菌生物膜的形成是一種抑制或殺死幽門螺桿菌的方式,沙棘乙酸乙酯萃取物還可以與抗生素一起使用,能更有效地抑制幽門螺桿菌。

2.2 沙棘乙酸乙酯萃取物對細胞外膜滲透率的影響

革蘭氏陰性菌由內膜和外膜兩層膜包被,完整的外膜是滲透屏障。NPN在水環境中有微弱的熒光,但在非極性或疏水性環境中有強熒光[20]。外膜結構一旦損壞,NPN可以進入磷脂層,從而產生明顯的熒光現象。因此,幽門螺桿菌對NPN的攝取能力反應了細胞外膜結構及通透性的變化。

由圖2可見,乙酸乙酯萃取物處理后,細胞內NPN的熒光強度持續增加。0.625～5 mg/mL樣品處理組熒光強度明顯高于對照組(P<0.01),說明經過萃取物處理后,幽門螺桿菌外膜通透性增強。與對照組相比,高劑量組(5 mg/mL處理組)NPN攝取率提高2.45倍,說明乙酸乙酯萃取物在殺菌濃度下破壞了細菌膜,細胞外膜通透性明顯增加。此結果與ZHOU等[8]發現HF-18肽能夠增加幽門螺桿菌外膜通透性的研究結果類似,都是通過增強細胞外膜通透性,進而影響幽門螺桿菌的生長。

圖2 不同質量濃度乙酸乙酯萃取物對幽門螺桿菌 細胞外膜的影響Fig.2 Effect of different concentrations of EA on the outer cell membrane of H. pylori

2.3 沙棘乙酸乙酯萃取物對細胞膜完整性的影響

細胞膜的完整性是細菌生長的關鍵因素。蛋白質和核酸是存在于細胞膜和細胞質的生物大分子,蛋白質主要提供結構功能,而核酸攜帶大量的遺傳信息。細胞滲漏的評價指標包括細胞內容物核酸在260 nm處的吸光度和蛋白質在280 nm處的吸光度,可以作為評價膜完整性的指標[15]。

從圖3可知,萃取物質量濃度為0.625 mg/mL時,核酸雖有泄露,但與對照比,差異不顯著(P>0.05),說明在此濃度的萃取物對核酸泄露的影響不顯著。與對照比,在2.5 mg/mL時,核酸泄露嚴重(P<0.05)。在5 mg/mL時,核酸泄露極其嚴重(P<0.05),是對照的3.28倍。隨著萃取物濃度的增加,蛋白質泄露逐漸增加。與對照比,在

a-細胞內核酸泄露測定;b-細胞內蛋白質泄露測定

0.625 mg/mL時,蛋白質雖有泄露,但差異不顯著(P>0.05),說明蛋白質泄露不明顯。當質量濃度達到2.5 mg/mL時,蛋白質泄露率達到45.15%。當質量濃度為5 mg/mL時,蛋白質泄露最為嚴重,泄露率高達98.72%?？傊?當乙酸乙酯萃取物質量濃度達到2.5 mg/mL時,細胞內容物泄露嚴重,這可能是因為細胞膜結構遭到破壞甚至細胞裂解死亡。此結果與TANG等[15]發現黑胡椒提取物破壞李斯特菌和沙門氏菌細胞膜完整性的結果類似。

2.4 沙棘乙酸乙酯萃取物對膜蛋白的影響

沙棘乙酸乙酯萃取物可以使細胞外膜通透性增加及細胞膜受損,研究某些特定蛋白質的在膜中的位置可以進一步解釋細菌細胞膜蛋白的結構是否發生改變。色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等氨基酸殘基是膜蛋白中主要的熒光載體。KI是一種熒光猝滅劑,可以猝滅膜蛋白表面殘基的熒光,但對位于膜蛋白內部或縫隙中殘基的熒光光譜不產生影響[21]。因此,測定Trp和Tyr熒光光譜的變化可以定性地確定兩種氨基酸在膜中的位置。

如圖4-a和圖4-b所示,隨著KI含量的增加,Trp和Tyr殘基沒有明顯的猝滅作用,表明Trp和Tyr殘基主要位于膜內,結果與WU等[21]研究結果一致。

隨著萃取物濃度增加,Trp和Tyr殘基的最大發射強度逐漸降低(圖4-c和圖4-d),這表明沙棘乙酸乙酯萃取物與膜蛋白發生了相互作用,改變了膜蛋白的結構,使Trp、Tyr的位置從細胞膜內到細胞膜外,將殘基暴露出來,從而使更多的沙棘乙酸乙酯萃取物能夠與Trp和Tyr接觸并猝滅其熒光。根據本研究結果,沙棘乙酸乙酯萃取物可能通過與細胞膜上的蛋白質相互作用而改變膜蛋白的構象,進而影響細胞膜的通透性。

a-不同濃度KI對色氨酸熒光光譜的影響;b-不同濃度KI對酪氨酸熒光光譜的影響;c-不同濃度沙棘乙酸乙酯萃取 相對色氨酸熒光光譜的影響;d-不同濃度沙棘乙酸乙酯萃取相酪氨酸熒光光譜的影響

2.5 沙棘乙酸乙酯萃取物對脲酶活性的影響

脲酶是幽門螺桿菌在胃內成功定植的關鍵因素之一,在高酸環境下,幽門螺桿菌可以產生大量脲酶[22]。脲酶可以將尿素分解為氨,氨能中和胃酸,創造出適合幽門螺桿菌生長的環境。因此,通過抑制脲酶的活性可以達到抑制幽門螺桿菌生長的目的。由圖5可見,幽門螺桿菌脲酶活性與乙酸乙酯萃取物劑量之間呈現劑量依賴遞減,在0.625～5 mg/mL時脲酶活性與對照相比,脲酶活性極顯著降低(P<0.01)。在質量濃度為5 mg/mL時脲酶活性降低了

圖5 沙棘乙酸乙酯萃取物對幽門螺桿菌脲酶活性的影響Fig.5 Effect of EA on the urease activity of H. pylori

87.89%。結果表明,沙棘乙酸乙酯萃取物對幽門螺桿菌脲酶活性具有明顯的抑制作用。此結果與常應九[13]報道的沙棘水提物抑制脲酶活性的結果相一致。LEE等[7]研究表明來檬提取物通過降低脲酶活性能夠抑制幽門螺桿菌的生長繁殖。

2.6 沙棘乙酸乙酯萃取物對幽門螺桿菌細胞結構的影響

如圖6-a所示,對照組幽門螺桿菌細胞呈桿狀,邊界清晰,表面光滑。經2.5 mg/mL的沙棘乙酸乙酯萃取物處理12 h后,細胞表面粗糙,細胞表現為畸形,出現褶皺(圖6-b)。5 mg/mL沙棘乙酸乙酯萃取物處理12 h后,細胞形態被破壞,部分細胞呈球狀,部分細胞裂解,細胞表面黏附顆粒(圖6-c)。這一結果說明沙棘乙酸乙酯萃取物可以抑制幽門螺桿菌生長,改變細胞形態,破壞細胞膜結構,最終導致細胞死亡。此結果與YANG等[9]報道的山奈酚破壞細胞形態結果表現一致,也從另一個方面驗證了沙棘乙酸乙酯萃取物可以改變膜結構。

a-對照組;b-2.5 mg/mL樣品處理組;c-5 mg/mL樣品處理組

2.7 沙棘乙酸乙酯萃取物化學成分

由表2結果可知,沙棘乙酸乙酯萃取物中不含有兒茶素,其他5種黃酮類物質都存在于沙棘乙酸乙酯萃取物中,其中蘆丁和異鼠李素含量較高?，F有研究表明蘆丁[23]、異鼠李素[24]、槲皮素[25]和山奈酚[26]均能抑制幽門螺桿菌生長,其最小抑菌濃度分別為600、3.9、128、14.312 μg/mL。沒食子酸含量在乙酸乙酯萃取物占比較低,但其也具有抗幽門螺桿菌的能力[27]。從表2中可以看出,蘋果酸的含量最高,同時蘋果酸也具有抑制幽門螺桿菌的能力。

表2 沙棘乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質和蘋果酸的化學物質含量Table 2 Content of flavonoids and malic acid in EA

從圖7-c中可以觀察到,在保留時間為29.27 min時,出現最高峰,其化學結構未得到鑒定,將其定義為未鑒定的化合物,這種未鑒定的化合物也可能具有抑制幽門螺桿菌的效果。

a-6種黃酮類物質標準品色譜圖;b-蘋果酸標準品色譜圖;c-沙棘乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質色譜圖;d-沙棘乙酸乙酯萃取物中蘋果酸色譜圖

3 結論

綜上所述,沙棘乙酸乙酯萃取物通過破壞幽門螺桿菌生物膜、改變膜結構域蛋白質、增加細胞外膜及內膜的通透性、改變細胞結構和降低脲酶活性抑制幽門螺桿菌生長。沙棘乙酸乙酯萃取物中的化學成分主要是蘋果酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素,已有研究報道這些物質均具有抗幽門螺桿菌活性。但關于沙棘乙酸乙酯萃取物對幽門螺旋桿菌的抑制效果是單一物質的高抑菌效果,還是這些物質的協同作用,需要進一步深入研究。