尿石素A脂質體的制備:穩定性及體外消化研究

胡悅,張露,2*,王思宇,魏林峰,盧菲艷,曾佩瑤,鄒立強,溫慶輝,涂宗財,*

1(江西師范大學,國家淡水魚加工技術研發專業中心,生命科學學院,江西 南昌,330022)2(江西德上制藥股份 有限公司,江西 贛州,331200)3(南昌大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌,330022)

尿石素A是鞣花酸經腸道菌群代謝后產生的多酚類化合物[1]。研究發現,尿石素A具有延長線蟲壽命、增加小鼠肌肉功能、增強腸道屏障功能、抑制高糖誘導的神經元淀粉樣變性等生理活性[2-5]。鞣花酸普遍存在于石榴、堅果及漿果等食物中[6],但不同人群的腸道吸收功能和腸道菌群組成存在較大差異,導致個體間對尿石素A的吸收轉化效率不同,且鞣花酸向尿石素A的轉化隨著年齡增加會逐漸下降[3],因此,通過膳食方式直接補充尿石素A往往無法達到預期功效濃度。而尿石素A不溶于水和脂溶性溶劑,微溶于乙醇,直接補充尿石素A的生物利用率低[7]。為解決尿石素A生物利用度的問題,ZOU等[8]制備了尿石素A納米粒子劑型,發現制劑改變后可以顯著提高尿石素A的口服生物利用度。YI等[9]通過制備尿石素A聚乙二醇化脂質體來提高尿石素A的生物利用度和抗腫瘤療效,其他關于提高尿石素A水溶性和生物利用度的報道則較少。因此,急需尋找更多有效的方法來提高尿石素A的口服生物利用度。

作為食品高新技術,食品遞送體系近年來被廣泛應用于保護和遞送膳食多酚,具有顯著提高多酚類化合物的穩定性、生物利用度和腸道吸收等作用[10]。目前用于膳食多酚的遞送體系主要有脂質體、納米顆粒、水凝膠、乳液等,其中脂質體因良好的生物相容性、生物降解性而被廣泛應用。由于磷脂分子具有兩親性,當分散在水介質中時,其在剪切力作用下可以自發地組裝形成脂質體。親水性物質可以結合在水核中,親脂性物質可以結合在脂質雙層中,并在水相中自組裝成球型小泡[11]。因此,脂質體可以同時包裹親水性和親脂性生物活性物質,抵御不利的環境條件。另外,脂質體優良的生物相容性可使被包裹的活性物質不與外界環境接觸進而避免被氧化分解,同時通過控制活性物質在體內的釋放速率從而提高其穩定性和生物利用度[12]。

pH驅動法是一種綠色、無溶劑、低能耗的封裝方法。最初,PAN等[13]根據生物聚合物的“解離-復性”和多酚類物質從堿性到酸性環境經歷“去質子化-質子化”的過程發明了該方法,是一種基于親脂性多酚溶解度隨pH值改變的原理發展起來的新型載藥方法。以姜黃素為例,在酸性環境下,姜黃素分子不帶電且水溶解度極低,當pH值逐漸升高,大于姜黃素酚羥基的電解離常數時,酚羥基逐步電離,姜黃素分子帶電,水溶解度急劇升高,當姜黃素完全溶解于水后,將pH值調回酸性,姜黃素分子質子化,水溶解度極度下降,可與生物聚合物形成姜黃素納米粒子[14]。整個過程沒有額外的能量投入,使其具有成本效益;無有機試劑,避免了安全問題;簡單的酸堿滴定,提高了工作效率。因此,該方法易于推廣,具有較好的工業化前景等優點[15]。尿石素A分子(圖1-a)是一種具有二羥基-6H-二苯并吡楠-酮結構的親脂性多酚,其從堿性到酸性環境也會經歷“去質子化-質子化”的過程,但目前尚未有采用pH驅動法制備UA-LPs的相關研究報道。因此,本論文的目的是采用pH驅動法將尿石素A包埋于脂質體中,優化制備工藝,并對其微觀結構、穩定性進行分析,以期提高尿石素A的生物利用度,為尿石素A在食品和保健品領域的廣泛應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

尿石素A(純度>97%),上海畢得醫藥科技股份有限公司;大豆卵磷脂,北京索萊寶科技有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、NaOH,美國Sigma公司;無水乙醇、乙腈、乙酸、乙醇,天津市大茂化學試劑廠;所有使用的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ESJ200-4電子分析天平,上海精科天美科學儀器有限公司;TG16A-WS高速臺式離心機,上海聚亮光學儀器有限公司;U-2910紫外可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;Zetasizer Nano-ZSP 納米粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司;HH-4數顯電子恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;XMTD-204水浴鍋,江蘇科析儀器有限公司;Chromaster Organizer液相,北京日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 尿石素A堿性穩定性和回復性分析

稱取尿石素A溶解于pH值為12的NaOH溶液中并攪拌5 min制備成尿石素A母液備用,每隔10 min取出4 mL尿石素A母液,以pH值為12的NaOH溶液為空白對照測其在250～350 nm的紫外吸收光譜。同時,每隔10 min取出5 mL尿石素A母液調節pH至7,采用高效液相色譜檢測其含量,色譜柱為Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),以1%的甲酸水和乙腈(30∶70,V∶V)為流動相,流速為0.8 mL/min,柱溫箱溫度為25 ℃,紫外檢測波長為256 nm。

1.3.2 尿石素A脂質體的制備

采用pH驅動法制備尿石素A脂質體(urolithin A liposomes,UA-LPs)[16]。稱取一定量的尿石素A溶解于pH值為12的NaOH溶液中并攪拌5 min制成不同質量濃度的尿石素A母液(0.2、0.6、1、1.4、1.8、2 mg/mL),稱取大豆卵磷脂(soybean phosphatidyl choline, SPC)分散于pH 7.2 10 mmol/L的PBS中,磁力攪拌1 h制備成不同質量濃度的粗脂質體(10、15、20、40 mg/mL),將粗脂質體用均質機在85 MPa條件下均質3次,得到不同濃度的空白納米脂質體(LPs)。最后將不同濃度的LPs與尿石素A母液以1∶1體積比混合,并立即調節pH至7,制備成尿石素A終質量濃度為0.5 mg/mL,SPC質量濃度為5、10、15、20 mg/mL的UA-LPs。按同樣方式制備SPC質量濃度20 mg/mL,尿石素A終質量濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1 mg/mL的UA-LPs。

1.3.3 UA-LPs包埋率及負載率的測定

將UA-LPs于12 000 r/min下離心10 min分離游離尿石素A(固體結晶)。取上清液用體積分數10%二甲基亞砜的無水乙醇稀釋20倍后,測其在256 nm處的吸光度,用回歸曲線(y=0.086 8x+0.076,R2=0.999 9)計算尿石素A的包埋率及負載率,計算如公式(1)和公式(2)所示:

(1)

(2)

1.3.4 UA-LPs粒徑與Zeta電位測定

采用Zetasizer Nano ZSP測定脂質體的平均粒徑、多分散系數(polydispersity index,PDI)以及Zeta電位變化。樣品用超純水稀釋10倍,每個樣品測定3次,磷脂的折光率為1.490,分散相(水)的折光率為1.33。

1.3.5 UA-LPs微觀形貌測定

將UA-LPs稀釋成尿石素A質量濃度為0.5 mg/mL,然后取5 μL樣品溶液于新剝離云母片表面,自然干燥后利用原子力顯微鏡測量[17]。

1.3.6 UA-LPs穩定性分析

pH穩定性:將UA-LPs的pH分別調節至3、5、7、9和11,用激光粒度儀記錄不同pH環境下UA-LPs的平均粒徑及電位變化,并采用公式(1)計算其包埋率。

熱穩定性:將UA-LPs分別于40 ℃和80 ℃處理30、60、90、180 min,放置冷水中冷卻至室溫后,用激光納米粒度儀測其平均粒徑及電位變化,采用公式(1)計算包埋率的變化。

1.3.7 UA-LPs的體外模擬消化

通過模擬胃、小腸的消化來研究UA-LPs的消化特性,具體步驟如下[16]:

胃階段:稱取2 g NaCl用500 mL超純水溶解,然后緩慢加入7 mL濃HCl溶液,用超純水定容至1 L,即得模擬胃消化溶液,并用模擬胃消化液溶解胃蛋白酶(3.2 mg/mL,現配現用)。往樣品中加入6 mL預熱至37 ℃的胃消化液(包含胃蛋白酶),調pH至2.5后在搖床中100 r/min孵育2 h。

小腸階段:胃消化結束后,加入12 mL提前預熱至37 ℃的PBS(10 mmol/L,pH 6.5),繼續在37 ℃水浴10 min,后用NaOH溶液將pH值調至7.0。加入含胰酶(24 mg/mL,2 mL)、膽鹽(50 mg/mL,2.8 mL)和鹽溶液(0.5 mol/L CaCl2和7.5 mol/L NaCl的混合溶液,1.2 mL)的模擬小腸消化液到胃消化液中,繼續在水浴鍋中模擬消化2 h,在此過程中,使用NaOH溶液將消化液的pH值保持在7.0。

UA-LPs釋放率:取模擬體外消化后的樣品于256 nm測定吸光度,計算消化液中尿石素A的濃度。同時取一定量消化后的樣品12 000 r/min離心10 min,評價上清液中尿石素A的含量,在消化液中可溶解的部分被認為是在膠束中能被吸收的部分。尿石素A的轉化率和生物可接受率通過公式(3)和公式(4)計算:

(3)

(4)

1.4 數據統計及分析

所有實驗均重復3次,結果表示為平均值±標準差。使用SPSS 13.0軟件對實驗數據進行分析,采用單因素方差分析(One-way ANOVA),通過Duncan法評價不同組間的顯著性差異,P<0.05認定具有顯著性差異。采用Origin Pro 2019制圖。

2 結果與分析

2.1 尿石素A堿穩定性和回復性分析

多酚類化合物的水溶解度隨pH值變化而改變的特性是pH驅動法包埋疏水性多酚的基礎條件,但多酚在堿性環境下易發生降解,故考察尿石素A在堿性條件下的穩定性是采用pH驅動法進行包埋的重要前提。尿石素A在pH值為12的強堿性環境下的穩定性結果如圖1-b所示,尿石素A在pH值為12的NaOH溶液中孵育60 min后,其紫外吸收峰略有下降,且孵育時間越長,在296 nm和318 nm處的紫外吸光強度降低得越多,在296 nm處的吸收值從0 min的2.905降低到了孵育60 min的2.476,在堿性條件下,尿石素A分子的酚羥基會逐步電離去質子化導致其帶電,最大吸收峰的下降可能是因為尿石素A的酚羥基在堿性條件與溶劑中溶解的少量氧分子發生反應,氧化成醌或者半醌中間體(圖1-e),從而導致尿石素A的結構改變[18]。

為驗證堿性條件下尿石素A結構的回復性,將尿石素A溶于pH值為12的NaOH溶液,每隔10 min取出相同體積的樣品調pH至中性,并采用高效液相色譜檢測其降解程度,結果如圖1-c所示,發現出峰時間未有明顯變化,但隨著時間的變化峰面積呈逐漸下降的趨勢,在孵育60 min后,其峰面積下降了約43%(圖1-d),這可能是因為在強堿性環境下尿石素A分子中的酚羥基數量上升,電離態的羥基基團易受到攻擊[16]的原因。但在10 min內尿石素A僅降解2.55%,說明尿石素A在一定時間內從強堿性條件恢復至中性條件并不會對其結構及含量有較大影響,驗證了pH驅動法包埋尿石素A的可行性,因此在后續實驗中,尿石素A堿溶液采取現配現用的方式,并將LPs與尿石素A母液混勻、調回pH至中性的時間控制在10 min內。

a-尿石素A結構式;b-尿石素A在60 min內紫外吸收強度變化;c-尿石素A在不同時間內的堿性恢復性; d-尿石素A在堿性環境下的降解率;e-尿石素A在堿性條件下的結構變化

2.2 不同SPC濃度UA-LPs包埋率及負載率的測定

固定尿石素A質量濃度為0.5 mg/mL,不同質量濃度SPC(5～20 mg/mL)對尿石素A包埋率的影響如圖2-a所示。隨著SPC添加量的上升,其包埋率分別為(60.01±0.12)%、(68.19±1.01)%、(86.88±2.03)%和(98.11±0.26)%。

當SPC添加量低于10 mg/mL時,不足以包封分散在體系中的尿石素A,這是由于一定量的磷脂所形成的脂質體對尿石素A的包埋能力是有限的,當尿石素A的含量超過脂質膜的飽和度時,導致其包埋率下降[19]。隨著添加量的上升,分散在體系中的卵磷脂足以包封體系中的尿石素A,并逐漸飽和[20]。對尿石素A負載率影響結果如圖2-b所示,隨著SPC添加量的上升,其負載率分別為(5.46±0.01)%、(3.25±0.05)%、(2.80±0.07)%和(2.39±0.01)%,說明SPC的濃度越大,其負載率越低。

a-包埋率;b-負載率

2.3 不同SPC濃度UA-LPs的粒徑及Zeta電位測定

脂質體的穩定性通常受其粒徑與Zeta電位影響,脂質體分散性PDI值也是考察脂質體物理穩定性的重要指標,研究表明,脂質體粒徑越小、電位絕對值越高,脂質體越穩定,PDI通常小于0.20為優良[21]。由圖3-a所示,固定尿石素A的質量濃度為0.5 mg/mL,隨著SPC濃度的增加,UA-LPs與LPs粒徑均呈不斷上升的趨勢,當SPC質量濃度為20 mg/mL時,LPs粒徑為131.5 nm,UA-LPs粒徑大小為97.5 nm。UA-LPs均比空白脂質體的粒徑小,這可能是尿石素A與大豆卵磷脂相互結合導致粒徑減小。

如圖3-b所示,UA-LPs的PDI指數相較LPs略有上升,但SPC濃度越大PDI指數越小,當SPC的質量濃度從5 mg/mL增加到20 mg/mL時,UA-LPs的PDI從0.40下降到0.27,說明20 mg/mL SPC制備的UA-LPs脂質體分散性最好,這有可能是因為磷脂濃度過低不利于包埋尿石素A導致其環境不均一。

圖3-c表明,不同SPC濃度UA-LPs 的Zeta電位相較LPs絕對值均有所增加,穩定性更好,當SPC質量濃度為20 mg/mL時,LPs電位為-24.8 mV,UA-LPs電位為-40.3 mV。這可能由于尿石素A分子的極性羥基與磷脂極性頭基的膽堿相互作用,產生的偶極子取向增加了脂質體的表面負電荷[22]。綜合考慮選擇SPC最大添加量為20 mg/mL。

a-平均粒徑;b-PDI;c-Zeta電位

2.4 不同芯材濃度UA-LPs的包埋率、負載率、粒徑及Zeta電位測定

固定SPC質量濃度為20 mg/mL,不同濃度尿石素A對UA-LPs包埋率、負載率的影響如圖4-a、圖4-b所示。在芯材質量濃度小于0.5 mg/mL時,其包埋率無顯著差異,均在97%左右,隨著尿石素A質量濃度(0.1～0.5 mg/mL)的增大,其負載率由0.4%上升至2.36%,當尿石素A添加量從0.5 mg/mL增加至0.7 mg/mL時,其包埋率從96.6%顯著下降至69.8%,證明尿石素A的添加量為0.5 mg/mL時,達到該脂質膜的最佳飽和度。隨著尿石素A質量濃度(0.5～1 mg/mL)的增加,負載率則由2.36%上升至3.04%,說明隨著尿石素A含量的增加,其負載率逐漸上升。

如圖4-b所示,固定SPC質量濃度為20 mg/mL,尿石素A質量濃度(0.1～1 mg/mL)的增加對UA-LPs平均粒徑的影響較小,粒徑均維持在90 nm左右,而UA-LPs粒徑均比LPs小,初步推測可能原因是尿石素A與大豆卵磷脂相互結合導致粒徑減小。

a-包埋率及負載率;b-平均粒徑;c-PDI;d-Zeta電位

圖4-c表明,隨著尿石素A質量濃度(0.1～1 mg/mL)的增加, UA-LPs的PDI呈現逐漸上升趨勢,其中尿石素A質量濃度為0.1 mg/mL時,PDI為0.20,尿石素A質量濃度為1 mg/mL時,PDI為0.27,均小于0.3,代表UA-LPs的分散性都較良好。

圖4-d表明,隨著尿石素A質量濃度(0.1～1 mg/mL)的增加,UA-LPs的電位變化無顯著性差異(P>0.05),保持在-43 mV左右,而LPs電位為-24.8 mV。說明負載不同濃度尿石素A的UA-LPs的電位相較LPs的絕對值均有所增加,穩定性上升,這可能由于尿石素A在制備過程中從不帶電狀態轉為帶負電,使得脂質體的表面帶更多負電荷[14]。根據以上數據分析,綜合考慮選擇尿石素A的最大添加量為0.5 mg/mL。

2.5 微觀形貌

為進一步表征UA-LPs形貌,通過原子力顯微鏡觀察UA-LPs的外觀圖,如圖5所示。在掃描范圍內,可以觀察到單個囊泡呈球形或者橢球結構,且分布較均勻,UA-LPs的平均粒徑在100 nm左右,與激光納米粒度儀測定的結果相一致。

圖5 UA-LPs原子力顯微鏡圖Fig.5 Atomic force microscopy of UA-LPs

2.6 UA-LPs穩定性分析

2.6.1 熱穩定性

2.6.1.1 包埋率

UA-LPs在40 ℃和80 ℃溫度下孵育30～180 min后的包埋率變化如圖6所示。

在40 ℃下,隨著時間的推移,同一種壁材濃度的UA-LPs的包埋率均呈現逐漸下降趨勢,經180 min后,SPC為5 mg/mL的UA-LPs的包埋率從60.0%下降至23.5%,SPC為20 mg/mL的UA-LPs的包埋率從98.1%下降至53.9%(圖6-a),證明高濃度的壁材在40 ℃下能更多的保留住包封的尿石素A。孵育30 min后,不同壁材濃度的UA-LPs的包埋率分別為34.2%、52.8%、71.2%和97.8%,說明加熱時間相同時,UA-LPs的包埋率均隨著SPC濃度的增加而增加。圖6-b表明熱處理溫度為80 ℃時,隨著處理時間的延長,同一種壁材濃度的UA-LPs的包埋率也具有顯著下降趨勢(P<0.05),孵育180 min后,SPC為5 mg/mL的UA-LPs的包埋率從60.0%下降至15.7%,而SPC為20 mg/mL的UA-LPs的包埋率從98.1%下降至39.1%,仍保留將近45%的尿石素A。與40 ℃相比,相同壁材濃度的UA-LPs在80 ℃下熱穩定性更差,說明UA-LPs的熱穩定性隨著溫度的升高而降低。這可能是由于溫度升高,磷脂水解速率加快,導致脂質體破裂,包埋的尿石素A滲漏量增加[22]。為排除尿石素A自身在加熱過程中的降解對實驗帶來的干擾,本文評價了尿石素A在40和80 ℃溫度下孵育30～180 min后的紫外吸收強度,由圖6-c、圖6-d可知,在兩種溫度下,尿石素A 的紫外吸收強度均隨著時間的延長無顯著性變化(P<0.05),證明尿石素A本身熱穩定性較好。

a-40 ℃對不同壁材濃度UA-LPs包埋率的影響;b-80 ℃對不同壁材濃度UA-LPs 包埋率的影響; c-40 ℃對尿石素A紫外吸收強度的影響;d-80 ℃對尿石素A紫外吸收強度的影響;

2.6.1.2 粒徑、PDI和電位

如圖7-a所示,在40 ℃ 處理180 min后, SPC質量濃度為5 mg/mL的UA-LPs的粒徑增大了68.3 nm,SPC質量濃度為20 mg/mL的UA-LPs的粒徑僅增大24.5 nm;80 ℃ 處理180 min后,SPC質量濃度為5 mg/mL的UA-LPs粒徑增大了85.9 nm,SPC質量濃度為20 mg/mL的UA-LPs粒徑增大了41.8 nm(圖7-d)。說明在不同溫度下,隨著加熱時間的增加,不同SPC濃度的UA-LPs平均粒徑均有逐漸增大的趨勢,且溫度越高其粒徑增大的越多,這是因為較高的溫度處理可能會破壞芯材層與壁材層之間相互作用,使其結構較為松散從而引起粒徑增大[23]。

溫度對不同壁材濃度UA-LPs的PDI影響如圖7-b、圖7-e所示。熱處理180 min后,在40 ℃條件下,SPC質量濃度為5 mg/mL的UA-LPs的PDI粒徑從0.4上升至0.48,SPC質量濃度為20 mg/mL的UA-LPs的PDI從0.26升至0.28。在80 ℃下,SPC質量濃度為5 mg/mL的UA-LPs的PDI從0.4上升至0.49,SPC質量濃度為20 mg/mL的UA-LPs 的PDI從0.26升至0.45。這說明在較低溫度下,隨著時間的推移,不同SPC濃度UA-LPs的PDI均無較大影響。而較高溫度會對高壁材濃度UA-LPs的PDI有一定的影響。

a-40 ℃對不同壁材濃度UA-LPs粒徑的影響;b-40 ℃對不同壁材濃度UA-LPs PDI的影響;c-40 ℃對不同壁材濃度UA-LPs電位的影響; d-80 ℃對不同壁材濃度UA-LPs粒徑的影響;e-80 ℃對不同壁材濃度UA-LPs PDI的影響;f-80 ℃對不同壁材濃度UA-LPs電位的影響

圖7-c、圖7-f為不同溫度對不同壁材濃度UA-LPs的電位影響。40 ℃水浴加熱180 min后,隨著SPC質量濃度(5～20 mg/mL)的增加,UA-LPs的電位絕對值分別下降了5.0、6.5、8.4、9.1 mV。80 ℃加熱180 min后,隨著SPC濃度的增加,UA-LPs的電位絕對值分別下降了16.4、18.8、19.6、20.4 mV。說明在同一溫度下,加熱時間的延長對高壁材濃度制備的UA-LPs電位的影響低于低壁材濃度制備的UA-LPs,且相同壁材濃度的UA-LPs在高溫下的熱穩定性更差。這是因為經過加熱后磷脂的水解和氧化會改變脂質體的雙層結構,從而影響脂質體穩定性[24]。

2.6.2 pH穩定性

為驗證尿石素A的穩定性,本文測定了不同pH對尿石素A紫外吸收強度的影響,如圖8-a所示,當pH值從3增加至9時,紫外吸收強度值分別為0.34、0.48、0.50、0.71,呈現上升趨勢,這可能是因為尿石素A的溶解度在堿性條件下隨著pH值的增大而增大,從而導致其吸光值增加。根據激光共聚焦顯微鏡結果顯示,在pH 3～9條件下,UA-LPs的形態仍較好(如圖8-b所示),故可以排除UA-LPs本身因破乳導致尿石素A泄露的影響,因此在評價UA-LPs的pH穩定性的時候,可以排除尿石素A本身溶解度的增加對包埋率結果的影響。

a-不同pH對尿石素A的影響;b-不同pH下UA-LPs 激光共聚焦顯微鏡圖

不同pH條件下不同壁材濃度UA-LPs的穩定性如圖9所示。如圖9-a所示,當SPC質量濃度為20 mg/mL時,隨著pH值由3增加至7,其粒徑由115.8 nm降低至109.3 nm,這種現象可能是由于脂質體在酸性介質中溶脹能力較強,導致囊泡增大[25]。當pH值由7增加至9時,粒徑變化不顯著(P>0.05),說明堿性環境對UA-LPs粒徑的影響較小。當pH值為3時,隨著SPC質量濃度的增加(5～20 mg/mL),其粒徑分別為117.2、114.4、113.4和115.8 nm(P>0.05),說明在同一個pH值下,壁材濃度的變化對其粒徑的影響較小。

如圖9-b所示,當SPC質量濃度為20 mg/mL時,隨著pH值由3增加至9,UA-LPs的PDI指數從0.48先降至0.34后增加到0.57,但數值總體變化差異不大。pH值分別為3和7時,不同壁材濃度的UA-LPs的PDI間無顯著性差異(P>0.05),但在pH值為5和9時,呈不同的變化趨勢,但最高和最低PDI的差異均在0.1之內,證明不同pH環境對不同SPC濃度的UA-LPs分散性影響較小。

如圖9-c所示,5 mg/mL的UA-LPs的電位絕對值隨著pH值的增加(3～9)從-39.5 mV降低至-49.0 mV,其Zeta電位絕對值變大,穩定性上升;在其他SPC濃度下,電位均隨pH增加呈相同的變化趨勢。上升主要歸因于磷酸基團在堿性環境下電離。相比之下UA-LPs受堿性環境的影響較小,能夠提高多酚在堿性條件下的穩定性。在同一個pH下,壁材濃度的變化對其表面電位絕對值的影響較小,整體來看,高濃度壁材的脂質體在不同的pH條件下,粒徑改變幅度較小,Zeta電位更穩定。

在pH=3時,隨著SPC質量濃度(5～20 mg/mL)的增加,其包埋率分別為47.8%、66.9%、72.5%和79.1%,呈現逐漸上升趨勢(圖9-d),證明壁材濃度越高,UA-LPs的pH穩定性越好。隨著pH值的變化(3～9),20 mg/mL的UA-LPs的包埋率由79.1%增加至99.7%,說明UA-LPs在酸性條件下包埋率較低,這可能是由于磷脂的水解常數與環境的pH值密切相關,在強酸環境中,磷脂的水解常數增加,水解速率增大,從而影響脂質體的包埋率[26]。

a-粒徑;b-PDI;c-電位;d-包埋率

2.7 體外模擬消化

采用體外模擬消化模型考察不同SPC濃度制備的UA-LPs在消化過程中的轉化率及生物利用率。轉化率為尿石素A在消化后仍保持潛在生物活性形式的百分比,而生物可接受度決定了尿石素A在消化液中溶解并因此可被吸收的部分,是評價營養素吸收率的重要指標[27]。其結果如圖10所示,未包埋的尿石素A在經過胃腸模擬消化后的轉化率為18.2%,包埋后,尿石素A的轉化率隨SPC濃度的增加分別為21.4%、25.3%、53.7%和77.5%,由此可見,經過包埋后可以將尿石素A與消化液隔離,改善其轉化率。高濃度壁材的脂質體轉化率更高,這是因為SPC濃度越高,所形成壁材越穩定,其更能阻止尿石素A與中性或堿性的環境相互作用,從而減少尿石素A的降解[28]。

圖10 UA-LPs模擬消化后的轉化率及生物可接受度Fig.10 Conversion and bio-acceptability of UA-LPs after simulated digestion

未包埋的尿石素A經胃腸模擬消化后的生物可接受度為25.9%,隨SPC濃度的增加,UA-LPs的轉化率分別為29.6%、29.8%、61.3%和79.6%,經過包埋后尿石素A的生物可接受度均比未包埋有所提高,其中SPC為20 mg/mL的脂質體將尿石素A的生物可接受度提高了2.07倍,說明SPC濃度越高,所制備的UA-LPs的生物可接受度越高。這是因為脂質體的磷脂消化產物可以增加用于結合疏水生物活性的非極性結構域數量來進一步增加混合膠束的增溶能力。從而使得尿石素A的生物可接受度增加[29]。

3 結論

通過研究芯材和壁材濃度對UA-LPs的包埋率、粒度、電位和穩定性等影響以及微觀形貌分析。確定了UA-LPs制備工藝條件為尿石素A 0.5 mg/mL、大豆卵磷脂20 mg/mL,在此條件下,尿石素A的包埋率為(98.11±0.26)%,UA-LPs的平均粒徑為(97.46±0.83) nm,多分散系數為0.27±0.01,Zeta電位為(-40.3±1.06) mV。原子力顯微鏡分析顯示UA-LPs呈均勻分布的小球狀,熱穩定性研究結果表明,高壁材濃度的UA-LPs的熱穩定性更好,在80 ℃孵育180 min后仍有40%的尿石素A負載率,在堿性環境下的穩定性也更高。體外模擬消化實驗結果表明,UA-LPs能夠顯著提高尿石素A的轉化率以及生物可接受度,下一步我們將通過動物實驗來驗證UA-LPs對生物體內利用率的影響。從而為拓寬尿石素A在食品和醫藥領域的應用提供依據。