太子參-牡丹皮藥對治療糖尿病心肌病網絡藥理學機制探討

張文婷，徐瑾，王時光

1 安徽中醫藥大學第一臨床醫學院 安徽合肥 230012

2 安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230031

1974 年，Hamby等人首先對糖尿病心肌病給了明確的定義，認為在糖尿病患者中出現的一種特異性心肌病，表現為心肌結構和功能重構，其發病過程不取決于冠狀動脈疾病、高血壓病、瓣膜病或其他心肌病變，而是以心肌肥大、纖維化和低心肌收縮力的小血管病變等病理變化為主，最后進展為慢性心力衰竭[1]。糖尿病心肌病發生機理復雜，目前尚缺乏特異性的診斷手段。傳統的藥物療法包括了血糖調節和改善心功能。在中醫上，糖尿病心肌病被稱作“消渴病心病”，其主要原因是消渴病沒有得到及時的治療，導致其進一步發展和演變。消渴病的根本病機在于肺腎陰虛燥熱，如果沒有得到及時的治療，則會不斷耗氣傷陰，進而會影響到心臟，導致心脈瘀阻，從而導致心衰。益氣養陰、活血化瘀是中醫藥治療糖尿病及其并發癥的主要治則，因此治療消渴的首選治療思路以益氣養陰活血通絡思想指導進行組方，可控制糖尿病及其并發癥的進一步發展?；诖死碚撘罁?，丹蛭降糖膠囊選擇太子參、生地黃、牡丹皮、菟絲子、澤瀉、水蛭組成新安驗方。

太子參-牡丹皮藥對出自丹蛭降糖膠囊，既往試驗驗證其對于糖尿病心肌損傷有顯著的療效[2]。太子參始是《本草從新》中記載的一種具有益氣健脾，生津潤肺功效的中藥。太子參具有降糖調脂、心肌保護、免疫調節、抗氧化、抗應激、 抗疲勞、抗腫瘤等現代藥理作用[3]。牡丹皮是《神農本草經》中記載的一種具有清熱涼血，活血化瘀，散瘀消癰功效的中藥，牡丹皮具有消炎解熱、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗腫瘤等現代藥理學作用[4]。本研究基于藥物和疾病的藥理學網絡，試從分子水平上探討太子參-牡丹皮藥對治療糖尿病心肌病的作用機制，為中醫藥防治糖尿病心肌損傷提供理論依據。

材料與方法

1 太子參-牡丹皮藥對活性成分的獲取及靶點預測

獲取太子參-牡丹皮藥對的活性成分及靶點預測，首先通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數據庫選條件設定為口服藥物生物利用度（OB）≥15%，類藥性（DL）≥0.15，篩選出太子參和牡丹皮的活性成分。將篩選出的各個活性成分在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）網站中找出對應Canonical SMILES結構。并將各個結構輸入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）數據庫中，設置species為“Homo sapiens”，設定 probability＞0篩選出符合條件的各活效成分的作用靶點。得到各個活性成分作用的全部靶點。

2 糖尿病心肌病相關靶點的獲取

通過搜索“Diabetic Cardiomyopathies”這一關鍵字，在Disgenet數據庫（https：//disgenet.org）和GeneCards數據庫（https：//genecards.org）中搜索出對應的靶點基因，同時在GeneCards數據庫中得到糖尿病心肌病的候選靶點，選取評分（表示 DCM與靶點基因之間的關聯程度）大于等于5的靶點為 DCM的候選靶點。取兩數據庫中靶點進行整合，刪除重復靶點，構建糖尿病心肌病靶點數據庫。

3 構建藥物-活性成分-靶點網絡圖

利用Cytoscape 3.9.0軟件構建藥物-活性成分-靶點網絡圖，并對網絡圖進行分析。其中在該網絡圖中節點代表太子參、牡丹皮、活性成分、靶點等；邊代表上述節點之間的相互關系。

4 構建蛋白互作（PPI）網絡圖

運用Venny圖獲取疾病與中藥的交集靶點。在此基礎上，利用STRING 11.5平臺（https：// cn.stringdb.org）對二者的交集靶點進行拓撲分析，構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡。并通過Cytoscape 3.9.0軟件對于蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖進一步優化，利用內部插件Cytohubba篩選出核心靶點，并構建核心靶點網絡圖。

5 富集分析與通路分析

在Metascape數據庫（https：//cn.metascape.org）中選定物種為人，設置Min Overlap＝3，P Value Cutoff＝0.01，Min Enrichment＝1.5為篩選條件，將疾病與中藥的交集靶點基因輸入數據庫中，對上述靶點基因選擇生物過程（biological process）、細胞組成（cellular component）、分子功能（molecular function）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）上述四個部分進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和通路分析。GO分析結果以柱狀圖進行展示，KEGG結果以氣泡圖的形式進行展示。

結 果

1 太子參-牡丹皮藥對活性成分的獲取及靶點預測

通過TCMSP數據庫的篩選，篩選出8個太子參活性成分，11個牡丹皮活性成分，共得到19個活性成分，見表1。通過Swiss Target Prediction數據庫篩選出太子參8個活性成分共435個靶點，牡丹皮11個活性成分中有7個活性成分在Swiss Target Prediction中預測到靶點，包括槲皮素（quercetin）、5-[亞甲基]巴比妥酸（5-[[5-（4-methoxyphenyl）-2-furyl]methylene]barbituric acid）、苯甲酰芍藥苷（benzoyl paeoniflorin）、堪非醇（kaempferol）、谷甾醇（sitosterol）、丁子香萜（Mairin）、芍藥苷（paeoniflorin_qt），共381個靶點。兩中藥共預測到了815個靶點，通過去除重復項后得到277個靶點。

表1 太子參-牡丹皮藥對活性成分

2 糖尿病心肌病關鍵靶點的篩選

在Disgenet數據庫中查到與糖尿病心肌病相關的靶點共220個，在GeneCards數據庫中查到與糖尿病心肌病相關的靶點共5977個，選擇打分值≥5 的2334個靶點作為糖尿病心肌病候選靶點，將兩數據庫中的靶點進行合并，通過去除相同靶點后共得到2424個靶點。將靶點與太子參-牡丹皮藥對活性成分的277個靶點繪制成韋恩圖，見圖1，將該共有的靶點與太子參-牡丹皮藥對活性成分的靶點進行匹配映射，得到共同靶點109個。也就是太子參-牡丹皮藥對主要以作用上述關鍵靶點為主，起到預防和治療糖尿病心肌損傷作用。

圖1 藥物與疾病的韋恩圖

3 構建藥物-活性成分-靶點網絡圖

將中藥、活性成分以及靶點導入Cytoscape軟件，進行藥理學網絡圖的構建，見圖2。其中根據各節點的度值，設置各節點的面積大小，度值越大，各節點的面積越大，表明活性成分與靶點作用越大，說明二者之間聯系越大，在發揮防治糖尿病心肌損傷的作用貢獻越大。該網絡中山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、刺槐素（acacetin）、木犀草素（luteolin）的度值排名靠前，說明這些有效成分在治療糖尿病心肌病的潛在靶點更多。

圖2 藥物-活性成分-靶點網絡圖

4 構建蛋白互作（PPI）網絡圖

將疾病與中藥的交集靶點導入STRING 11.5平臺進行拓撲分析，篩選出關鍵靶點，通過Cytoscape對網絡圖進行優化分析，見圖3。并利用其內部插件Cytohubba，根據度值篩選出前20個核心靶點，分別為腫瘤壞死因子（TNF）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、腫瘤抑制蛋白（TP53）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）、雌激素受體1（ESR1）、熱休克蛋白90α家族A類成員 1（HSP90AA1）、過氧化物合酶2（PTGS2）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、沉默信息調節因子1（SIRT1）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、 過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPARA）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、堿性成纖維細胞生長因子（FGF2）、激酶插入區受體（KDR）、糖原合成酶激酶3B（GSK3B），對前20個核心靶點再次進行網絡圖構建，見圖4。

圖3 蛋白互作網絡圖

圖4 前20核心靶點

5 GO分析與KEGG分析

通過Metascape數據庫將藥對與疾病的共同靶點進行富集和通路分析，根據條件篩選出的結果中選擇前10個生物過程包括磷酸化的正向調節、蛋白質磷酸化的正向調節、激酶活性的調節、激酶活性的正向調節等。前10個細胞組成包括膜筏、膜微結構域、胞膜、質膜筏等。前10個分子功能包括核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、類固醇結合、轉錄因子結合等。選擇前20個信號通路，這些通路包括癌癥通路（Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Rap1 signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。將GO分析結果以柱狀圖形式展示，見圖5。通過KEGG分析選擇前20個富集結果較強的信號通路，其中縱坐標表示通路名稱，橫坐標代表基因比率。通路中富集的基因數目以圓圈的大小表示，基因數目越多圓圈越大。圓圈顏色的深淺代表Pvalue，其中顏色越深代表可信度越高，見圖6。

圖5 GO分析柱狀圖

圖6 KEGG氣泡圖

討 論

糖尿病心肌病在中醫上被稱為“消渴病心病”“心悸”“怔忡”等。主要由于糖尿病久治不愈，逐漸影響及心，病機演變主要為陰虛燥熱逐漸耗氣傷陰，導致痰瘀互結最終進展為陰陽兩虛。主要有4個重要致病因素包括虛、痰、瘀、水[5]。運用網絡藥理學方法發現太子參和牡丹皮通過多種活性成分、多個靶點和多條通路來發揮防治糖尿病心肌病的作用。

通過對藥物-活性成分-靶點網絡圖的分析可知網絡中的重要節點為山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、刺槐素（acacetin）、木犀草素（luteolin）。山奈酚是一種天然黃酮類化合物，可上調 SIRT1，抑制NF-κB 核轉位，并激活核因子E2相關因子（Nrf2），從而抑制糖尿病引起的心肌炎癥和氧化應激[6]。并可通過抑制 ASK1/MAPK 及AGE-RAGE/MAPK 信號通路，發揮保護糖尿病心肌病作用[7]。槲皮素是一種天然類黃酮，存在于多種植物中。槲皮素可以通過Nrf2通路抑制高糖誘導的細胞焦亡小體激活和線粒體損傷，從而改善糖尿病心肌細胞損傷[8]。槲皮素可對糖尿病大鼠心肌細胞中caspase 9和3的激活減少，防止過度凋亡[9]。通過減少糖尿病心肌病小鼠模型中的炎癥反應和甘油磷脂代謝失調來改善心臟損傷[10]。刺槐素是一種天然黃酮類化合物，在多種心血管疾病中是一種抗氧化劑和抗炎劑。在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病心肌病大鼠模型中，通過PPAR-α/AMPK信號通路，對抗高葡萄糖誘導的Bax和 IL-6增加和Bcl-2的減少。表明通過抑制氧化應激、炎癥和細胞凋亡發揮心臟保護作用[11]。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，通過抑制NF-kB介導的炎癥和激活Nrf2介導的抗氧化反應來預防糖尿病性心肌病，還可以預防STZ 誘導的糖尿病小鼠的心臟纖維化、肥大和功能障礙[12]。此外通過上調磷酸化蛋白AMPK和AKT/GSK-3通路，同時降低蛋白酶體活性，從而預防小鼠糖尿病心肌病[13]。還可以抑制JNK調節的miR-22并阻斷自噬[14]。

通過蛋白互作網絡圖分析可得TNF、AKT1、SRC、TP53等靶點在作用過程中發揮主要作用。 TNF與糖尿病心肌病的發生發展有緊密聯系，TNF- α在糖尿病患者中過度表達。過量的TNF- α可介導免疫反應，誘導細胞凋亡，抑制心肌收縮，參與心肌重構。TNF-α轉基因小鼠的過度表達導致心臟增大、心臟功能障礙和心肌纖維化[15]。Akt在調節心血管功能（如心臟生長、心肌收縮功能和冠狀血管生成）方面具有明確的作用。PI3K-Akt-FoxO3a 通路可以預防STZ誘導的糖尿病大鼠心功能惡化和結構性心肌病，并減少糖尿病心肌細胞的凋亡。AKT-Foxo1磷酸化水平的降低與DCM胰島素抵抗和細胞凋亡的發生密切相關，在抑制細胞凋亡、改善DCM心功能方面具有重要作用[16]。 在糖尿病心肌病中Akt通路的激活為細胞提供了生存信號，通路激活后顯著降低心肌細胞凋亡和心肌損傷[17]。SRC它參與心臟肥大的多種信號通路，如G蛋白偶聯受體信號轉導。一些研究人員報告稱，c-Src在糖尿病相關心血管疾病的病理生理學中發揮著重要作用[18]。TP53在糖尿病心肌病中誘導糖酵解和凋亡調節因子 （TIGAR），TIGAR在糖尿病心肌病小鼠中提高HG誘導的ROS和細胞凋亡水平[19]。

通過KEGG富集分析，太子參-牡丹皮藥對可直接干預癌癥、MAPK、PI3K-Akt等信號通路。絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信號通路有效地參與了DCM的發病機制。AMPK 的激活對糖尿病病癥中的缺血性損傷、心臟肥大和心臟細胞凋亡具有許多心臟保護作用。p38作為MAPK的成員，已知被激活并參與心臟肥大、心肌纖維化和細胞凋亡 。靶向p38MAPK是控制DCM心臟細胞凋亡的另一種治療策略[20]。Akt發揮保護細胞，可以通過抑制多個靶點的有關細胞凋亡信號通路。研究顯示，心肌細胞的生長、代謝和凋亡，與PI3K/Akt信號通路密切相關。并可以通過PIK3CA對心臟起到保護作用[21]。Sirt1位于PI3K-Akt的上游，激活Sirt1-Fox1、PI3K-Akt等信號通路可抑制心肌細胞OS和細胞凋亡，從而達到緩解和治療DCM的目的[22]。PI3K/Akt有3 種激活途徑，包括胰島素、GSK-3和 哺乳動物雷帕霉素靶標（mTOR） 。阻斷糖尿病大鼠的PI3K/Akt通路可顯著降低調節細胞凋亡的eNOS和mTOR蛋白的表達。PI3K/AKT/mTOR通路參與調節內質網應激 （ERS） 誘導的細胞死亡[23]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法從分子水平探討太子參-牡丹皮藥對對治療糖尿病心肌病的機制，太子參-牡丹皮藥能通過多種活性成分、多靶點、多途徑對糖尿病心肌病起到保護作用，為糖尿病心肌病的未來防治提供新思路。