“山茱萸—菟絲子”治療慢性腎小球腎炎作用機制探討*

孟令裕，王圣治

1 遼寧中醫藥大學 遼寧沈陽 110847

2 遼寧中醫藥大學附屬醫院 遼寧沈陽 110032

慢性腎小球腎炎（ chronic glomerulonephritis，CGN），以蛋白尿（0.3～3.4g/d）、血尿、高血壓和水腫為基本臨床表現，常見于多種病理類型，發生于任何年齡，但以中青年為主，男性多見。多數起病緩慢、隱匿。早期病人可有倦怠乏力、腰部疼痛和食欲缺乏，伴或不伴有輕度浮腫，實驗室檢查多為輕度尿異常，腎功能正?；蜉p度受損這種情況可持續數年，甚至數十年，腎功能逐漸惡化，最后進入終末期腎衰竭，是我國終末期腎衰的首要病因。CGN的治療以防止或延緩腎功能進行性惡化、改善或緩解臨床癥狀及防治心腦血管并發為主要目的。目前CGN的治療主要包括積極控制高血壓和減少尿蛋白；限制食物中蛋白及磷的入量；糖皮質激素和細胞毒藥物以及避免加重腎臟損害的因素。2021年KDIGO指南[1]指出減少蛋白尿對控制腎小球原發疾病、減少腎小球高灌注、減輕足細胞損傷、腎小球瘢痕形成、減少血清白蛋白流失進而降低血栓栓塞和感染的風險以及減輕患者癥狀和代謝并發癥從而提高生活質量都有至關重要的作用。其中以腎素-血管緊張素抑制劑（renin-angiotensinsystem inhibitors RASI）為首選藥物，尿蛋白較多的患者可考慮糖皮質激素和細胞毒藥物。

CGN為現代醫學所定義的疾病，中醫對CGN沒有確切的病名，但從臨床表現和病位關系來看，CGN與中醫學中的“腎風”“風水”“虛勞”“水腫”“腰痛”等疾病中的某些證型無論是病因病機還是證候都極為相似。本病病因病機以肺，脾，腎虛為本；以風、寒、濕、熱、濁毒、瘀血交阻腎絡為標?？梢娬撔皯偈窃摬“l病的核心環節，因此，中醫在治療上，應堅持“治本”與“治標”并重。尤其在緩解蛋白尿方面，近年來有大量研究證實，RASI聯合中醫自擬方或中成藥其減輕蛋白尿、保護腎臟的療效明顯高于單純RASI治療[2-3]。蛋白質是構成細胞乃至整個人體的物質基礎，這與中醫所說的“精”相對應，屬于人體內精微物質，因此蛋白尿所對應的中醫概念是“精氣外泄”，當治以開源節流。一方面補充精氣，腎虛是發為本病的基礎，而從五行相生理論來看，腎屬水，肝屬木，水能生木，肝為腎之子，從位置上，肝腎同屬下焦，乙癸同源，經脈相通，故補子而壯母；腎病日久，精氣外泄，精血虧虛，而在生理功能上腎藏精，肝藏血，肝腎同源，精血同源，故補肝腎以益精養血。另一方面固攝精氣減少流失。因此選擇既能補肝腎又能固精的藥物成為治療CGN的關鍵，山茱萸：味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經、主入肝，補益肝腎，收澀固脫；菟絲子：味辛、甘，性平，歸肝、腎、脾經，補益肝腎，固精縮尿。在郭恩綿[4]教授治療CGN的用藥規律中，得出山茱萸-菟絲子這一藥對，為這一理論提供了有力的事實根據，然而，關于山茱萸-菟絲子這一藥對減少蛋白尿作用機制尚不明確。網絡藥理學是一種基于生物網絡的藥物-靶點-疾病關聯分析的新技術，通過構建“多基因-多靶點-多通路”交互網絡，實現藥物作用機理的可視化[5-6]。因此，本研究擬采用網絡藥理學等方法，尋找“山茱萸-菟絲子”對治療CGN的作用靶點，并從整體、細胞和分子水平闡明“山茱萸-菟絲子”對改善 CGN蛋白尿的干預機制，以期為臨床應用提供新思路。

資料與方法

1 山茱萸-菟絲子藥對有效活性成分的篩選和靶點預測

采用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）（網址：https：//www.tcmsp-e.com/）分別對山茱萸和菟絲子中的全部化學成分進行檢索（以口服生物利用度（oral bioavai-lability，OB）≥30%并且類藥性指數（drug like index，DL）≥0.18為篩選條件），得到山茱萸和菟絲子中的有效活性成分和相應的基因靶點，并通過 Uniprot數據庫（網址：https：//www.uniprot.org/）對相應的基因名稱標準化（檢索時設定篩選條件：基因來源物種為“Human”）[7]。

2 CGN疾病靶點預測

在 GeneCards的數據庫（網址：https：//genealacart.genecards.org/）中，輸入“Chronic Glomerulonephritis”作為關鍵字，收集與CGN相關的基因靶點。通過Venny2.1.0（網址：https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到山茱萸-菟絲子-CGN三者交集靶點，即山茱萸-菟絲子藥對治療CGN的潛在靶點。

3 山茱萸菟絲子藥對-CGN成分靶點-靶點網絡構建

利用Cytoscape3.9.1構建中藥有效成分-交集靶點網絡圖。

4 蛋白質互相作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網絡分析及核心靶點預測

將1.2中得到的山茱萸-菟絲子-CGN三者交集靶點導入到STRING數據庫（網址：https：//cn.stringdb.org/），以基因來源為“homo sapiens”并且中等置信度數值為0.4為條件去除不符合標準的靶點，獲得了PPI網絡，并將其以 TSV格式存儲起來。將此文件導入到Cytoscape3.9.1中構建可視化PPI網絡圖，在此基礎上，利用 MCODE插件對PPI網絡進一步篩選。

5 基因富集分析

將1.2中得到的山茱萸-菟絲子-CGN三者交集靶點入到 Metascape數據庫（網址：http：//metascape.org/）中，進行GO與KEGG通路富集分析[8-14]。以P＜0.05為篩選條件對山茱萸-菟絲子藥對對CGN的作用機制進行分析，并將其結果在微生信網絡平臺（網址：http：//www.bioinformatics.com.cn/）上進行可視化分析。

6 “成分-靶點-通路”網絡構建

從1.5篩選出的KEGG通路中以P的數值大小為條件，篩選出排名前20的通路，通過Cytoscape 3.9.1構建山茱萸-菟絲子治療CGN的“成分-靶點-通路”網絡圖。

結 果

1 山茱萸-菟絲子藥對有效成分及靶點篩選

從 TCMSP數據庫中得到了226個山茱萸成分和29個菟絲子成分。再通過ADME參數篩選并且刪去重復值之后，得到了30個活性成分，其中20個來自山茱萸，11個來自菟絲子，β-谷甾醇（beta-sitosterol）是二者共有的成分。

山茱萸萸-菟絲子藥對的組成在表1中有說明；在此基礎上，以TCMSP為基礎，進行了相應的篩選，最終得到了235個藥物潛在靶點。

表1 山茱萸-菟絲子藥對部分成分信息

2 活性成分-交集靶點網絡構建

通過在GeneCards數據庫中檢索關鍵字“Chronicglomerulonephritis”，我們發現CGN有1874個潛在靶點。利用在Venny2.1.0網站上獲得的27個藥物-疾病交集靶點，見圖1?；谒幬?疾病交集靶點，從TCMSP數據庫中篩選山茱萸-菟絲子藥對對應的活性成分，采用 Cytoscape3.9.1構建山茱萸-菟絲子藥對活性成分與藥物-疾病交集靶點所構成的成分-靶點網絡圖。見圖2。

圖1 藥物-疾病交集靶點

圖2 成分-靶點網絡圖

3 PPI網絡及關鍵成分、靶點分析

將Venny2.1.0中得到的27個藥物-疾病交集靶點導入 STRING數據庫，得到一個包含22個節點和64條邊的PPI網絡圖。將相應的 PPI網絡圖從 STRING數據庫中以TSV格式下載，然后導入Cytoscape3.9.1中，獲得 PPI網絡圖，如圖3所示。利用 MCODE插件對其進行集群分析，獲得了 AR，BAX，CASP3，JUN，NOS2，PPARG，PRKCA，PTGS2，TGFB1，9個核心靶點，并得到核心靶點網絡圖，見圖4。并找到核心靶點所對應的藥對活性成分包括槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、芝麻素、苦參堿、豆甾醇、甘露醇、羥基芫花素、四氫鴨腳木堿，并用Cytoscape3.9.1構建核心成分-核心靶點網絡圖，見圖5。

圖3 PPI網絡

圖4 核心靶點網絡圖

圖5 核心成分-核心靶點網絡圖

4 GO與KEGG通路富集分析

在Metascape數據庫中導入27個山茱萸-菟絲子藥對治療CG的潛在靶點，以P＜0.01為篩選條件，在（Gene Ontolog，GO）數據庫中獲得細胞組分（cellular component，CC）24條、生物過程（biological process，BP）394條、分子功能（molecular function，MF）38條，以-LogP為篩選條件從大到小排序，各選取前10條信息繪圖，見圖6。以P＜0.01為篩選條件，在KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫中獲得信號通路82條以-LogP為篩選條件從大到小排序，選取前20條通路繪圖，見圖7。

圖7 KEGG信號通路分析

5 “成分-靶點-通路”網絡構建

通過Cytoscape3.9.1構建“信號通路-靶點-活性成分”網絡圖，見圖8。其中度值最高的3個成分為槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚；度值前8的靶點：CASP3、BAX、BCL2、CASP8、JUN、 PRKCA、 NOS2、TGFB1。

圖8 成分-靶點-通路網絡圖

討 論

現階段臨床對于CGN的治療可概括為兩方面。一方面是依據腎活檢病理結果予免疫抑制治療，抑制免疫反應對腎小球的損傷，長期用藥不良反應較多，如骨質疏松、肥胖、股骨頭壞死等；另一方面是針對以蛋白尿、血尿、高血壓和水腫為臨床表現的腎炎綜合征的對癥治療，最佳治療策略尚不清楚。中醫對CGN的治療以證為辨證要點，認為CGN蛋白尿關鍵在于腎虛失于封藏，陰精外泄。治法上應采取平補肝腎，固攝陰精的基本治療原則以治本。方選滋腎露，山茱萸：味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經、主入肝，補益肝腎，收澀固脫，為君藥；菟絲子：味辛、甘，性平，歸肝、腎、脾經，補益肝腎，固精縮尿，為臣藥。兩者乃平補肝腎，固精止遺之藥要。山茱萸與菟絲子兩藥君臣相伍，補陽固精與滋陰益精并施，藥味雖少但功效顯著，陰陽同調，既補充腎精又減少腎精流失，以達到固腎填精的作用。

細胞及動物相關實驗研究已證實山茱萸、菟絲子中的活性成分，如山茱萸多糖、菟絲子多酚等具有抗氧化、免疫調節、抑制免疫因子釋放、降低炎癥水平、抑制細胞凋亡作用。丁國明等[15]用胃嘌呤溶液灌胃制備慢性腎功能衰竭大鼠模型，證實山茱萸提取物通過下調慢性腎衰竭大鼠的炎癥因子包括TNF-α、IL-6 水平；通過降低慢腎衰大鼠體內織 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、NOX1、活性氧（ROS）及 p-細胞外信號調節激酶（p-ERK）的水平抑制 對氧化酶（oxidase）/ROS/ERK信號通路在慢性腎衰竭中誘導凋亡的水平，進而抑制腎臟的纖維化，起到腎臟保護的作用。菟絲子中的槲皮素可通過上 調Bcl-2和下調Bax的表達，抑制腎損傷小鼠腎臟細胞凋亡，并降低炎性因子IL-1β和IL-6的釋放，發揮其對LPS誘導小鼠急性腎損傷的保護作用；石柳柳等研究發現槲皮素可降低炎性因子IL-1β和IL-6的釋放，通過上調Bcl-2和下調Bax的表達[16]。

以上研究利用TCMSP數據庫、Venny2.1.0網站等網絡藥理學研究工具，篩選出30個山茱萸-菟絲子藥對活性成分，235個藥物潛在靶點，27個與CGN的疾病靶點取交集后得到的交集靶點。交集靶點在Cytoscape3.9.1中的MCODE插件篩選出9個核心靶點，包括AR、BAX、CASP3、JUN、NOS2、PPARG、PRKCA、PTGS2、TGFB1，并找到核心靶點所對應的藥對活性成分包括槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、芝麻素、苦參堿、豆甾醇、甘露醇、羥基芫花素、四氫鴨腳木堿。β-谷甾醇是一種植物甾醇，與膽固醇結構相似，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降脂、抗腫瘤等作用[17]，對腎臟有保護作用。有研究發現β-谷甾醇可通過激活NRF-2的抗氧化酶調節活性保護腎毒性小鼠模型的腎臟功能，并清除其體內產生的過量過氧化物和有毒物質[18]。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物[19]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、控制血糖、免疫調節等作用[20]。有研究表明槲皮素可抑制2型糖尿病大鼠的腎臟肥大[21]；通過調節氧化應激和INOs（誘導型一氧化氮合酶）/p38MAPK 信號通路，緩解腺嘌呤誘導的慢性腎衰大鼠模型血管鈣化；調節輔助T細胞水平 即提高Th1細胞比例，減少TH2細胞比例，增強系統性紅斑狼瘡小鼠細胞免疫功能，起到保護腎功能的作用[22]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌、降膽固醇、保護神經、鎮痛、抗糖尿病等作用，在治療糖尿病、骨關節炎、黑色素瘤等疾病中的作用機制得到部分驗證[23]，但其在CGN中的作用尚未得到證實。

GO分析中BP注釋表明山茱萸-菟絲子藥對可能通過參與血液循環、細胞對有機環化合物的反應、磷酸化的正向調控等生物過程作用于CGN；CC注釋表明山茱萸-菟絲子藥對可能通過參與血液微粒、膜筏、膜微域、絲氨酸型內肽酶復合物、絲氨酸型肽酶復合物等細胞組分調控上述過程。

KEGG pathway富集分析顯示山茱萸-菟絲子活性成分治療CGN的靶點主要富集在IL-17 信號通路、鈣信號通路、細胞凋亡、p53 信號通路，在生理條件下，p53是一種通過抑制細胞分裂，促進細胞衰老甚至凋亡，抑制異常細胞增殖的因子，參與到細胞周期的調控中。有研究表明腎臟病理中，腎臟組織中細胞周期蛋白P53陽性率越高，蛋白尿、高血壓的嚴重程度就越高，對腎功能的損害也越大[24]。

白介素-17（interleukin-17，IL-17）是一個重要的促炎癥細胞因子，是由CD4+T淋巴細胞中除輔助T細胞1（Th1）和輔助T細胞2（Th2）亞群以外的第三亞群——輔助T細胞17（Th17）分泌的特征性細胞因子[25]，包含6個結構相關的細胞因子，即IL-17A到IL-17F，其中以IL-17A最為多見[26]。在多種炎性反應及自身免疫性疾病病理過程中發揮關鍵作用，多方面研究證實CGN發病與 CD+4T細胞 Th1/Th2細胞平衡紊亂、Th17功能改變密切相關[27-32]。其在腎小球腎炎中的作用也得到越來越多的證實[33]。有動物研究證實，抗腎小球基底膜腎小球腎炎的動物腎的Th17占活化T細胞的比率升高[34]；又臨床研究指出，抗中性粒細胞胞漿抗體 （antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關性血管炎患者的血清IL-17A水平及髓過氧化物酶（myeloperocidase，MPO）和PR3特異性的Th17數均增高[35-36]?？梢奍L-17的異常增高與自身免疫相關腎小球腎炎的發生有著密切的聯系。 Huh JR等，用IL-17A 缺陷的小鼠制成的抗MPO腎小球腎炎模型證實了 IL-17A的作用。IL-17A缺陷的小鼠腎病變輕，IL- 17A能促進中性粒細胞向腎小球聚集，提高對MPO的獲得性自身免疫[37]。有力的證實了IL-17A確實是介導自身免疫性腎炎的關鍵因素。由此可推測抑制Th17細胞的分化、減少IL-17的分泌，研發IL-17A或IL-17R的抗體可成為治療CGN的新思路。

綜上，本文基于網絡藥理學技術深入挖掘得到“山茱萸萸-菟絲子”治療 CGN的藥物有效成分、其對CGN的潛在作用靶點以及藥物可能發生作用的分子通路，這為揭示中藥治療CGN多靶點-多通路的復雜作用機理提供了理論依據，未來可對其中的關鍵成分和核心靶點進行體內和體外實驗驗證。