組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對慢性間歇性低氧小鼠肝損傷的影響及其機制

汪金麗,金 宇,孫敏瓊,余孝海(安徽城市管理職業學院公共管理教研室,合肥 300;安徽醫科大學機能學實驗中心;通訊作者,E-mail:804830@qq.com)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)通常是患者睡眠時出現打鼾、嗜睡、睡眠紊亂等癥狀,是由于上氣道塌陷或阻塞,影響通氣,導致呼吸暫停引起[1],OSAS可以導致多種疾病,甚至致殘抑或死亡。OSAS的危害有很多,如高碳酸血癥、慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)等。OSAS最為典型的病理生理特征是產生胸內CIH現象,CIH可以引起多種代謝綜合征損傷波及多種器官,如肝臟、腎臟損傷等[2,3]。組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDACs)是一種常見的表觀遺傳調節劑,主要功能是調控組蛋白乙?；腿ヒ阴；?這種調節劑起到基因表達調節和染色體結構轉型的作用。研究表明,HDAC抑制劑有益于預防多種心血管疾病,通常根據其使用需要,研究各種HDACs的抑制劑,HDACs抑制劑將成為治療高血壓、冠心病、心肌梗死、心血管重構等一系列心血管疾病的新方向[4]。HDACs抑制劑SAHA是一種光譜型抑制劑,屬于HDAC Ⅰ類和Ⅱ類抑制劑,2006年作為第一個臨床使用HDAC抑制劑(美國FDA批準),開始主要應用于治療多發性骨髓瘤和常見T細胞淋巴瘤兩種疾病,最新研究發現SAHA具有保護間歇性低氧引起的心肌和血管損傷作用[5,6],但其對肝損傷分子保護機制不得而知。本研究擬建立間歇性低氧模型,觀察HDAC抑制劑SAHA對慢性間歇性低氧小鼠肝損傷是否具有保護作用,為后續的機制研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級C57BL/6J小鼠24只,8周,體質量21～27 g,購自江蘇集萃藥康生物公司提供,生產許可證號:SCXK(蘇)2023-0009。嚴格執行安徽醫科大學實驗動物保護條例,小鼠分籠飼養,每籠8只,晝夜節律12 h暗光循環,自由采食和飲水,動物房溫度18～25 ℃,通風良好。

1.2 主要儀器及試劑

測氧儀購自南京新飛分析儀器制造有限公司,酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司,濃度大于99.99%高純氮氣購自合肥市醫用氧氣廠,濃度大于99.9%壓縮氧氣購自合肥市醫用氧氣廠,天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)購自南京市建成生物工程研究所,兔抗c-Caspase-3抗體、兔抗Caspase-9抗體購自博奧森生物有限公司,TUNEL檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司,SAHA(S104711)購自美國Selleck Chemicals公司。

1.3 動物模型制備及實驗分組

小鼠被適應飼養3 d,隨機分成control組、CIH組和CIH+SAHA組,每組8只。根據氮氣稀釋原理,采用間歇性低氧誘導小鼠肝損傷模型[3],CIH組和CIH+SAHA組小鼠放入配備測氧儀的低氧艙內,測氧儀實時顯示數據,監測低氧倉內氧濃度,低氧艙內氧含量需保持在6%～21%。設定一個循環時間為9 min,先充入氮氣4 min,隨即充入氧氣5 min,每天8 h的間歇性低氧處理(8∶00—16∶00)。間歇性低氧第3周起,造模前CIH+SAHA組腹腔注射SAHA 50 mg/(kg·d),control組和CIH組造模前注射相同體積生理鹽水[1]。間歇性低氧處理4周后,處死小鼠,進行相關實驗。

1.4 血清學指標檢測

稱小鼠體質量,10%水合氯醛(0.05 mL/10 g)腹腔注射麻醉,眼眶靜脈叢采血,每只小鼠約1 mL,加入抗凝試管(已加入抗凝劑)靜置,低溫高速離心后取上清,按照說明書上的方法測定AST和ALT水平(全波長510 nm酶標儀)。

1.5 肝臟指數計算

小鼠稱體質量,腹腔注射麻醉后行頸部脫臼處死,迅速解剖小鼠,剖腹取肝臟,生理鹽水沖洗、濾紙吸干后稱肝質量,肝指數=肝質量(g)÷體質量(g)×100%。

1.6 HE染色肝組織病理學檢查

稱量肝質量后,用生理鹽水清洗,濾紙吸去表面水分,用多聚甲醛洗一次,4%多聚甲醛溶液固定,經過脫水機脫水,石蠟包埋,切片(約4 μm),按照HE脫蠟—染色—0.3%鹽酸分化—氨水稀釋—水洗步驟,中性樹膠封片,顯微鏡觀察肝組織病理變化并采集圖像。

1.7 Western blot檢測相關凋亡蛋白Caspase-9和c-Caspase-3

在冰盤上剪取肝臟組織,用RIPA裂解液裂解,利用BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE分離蛋白,轉PVDF膜,封閉孵育一抗,一抗包括鼠抗β-actin抗體(1∶1 000)、兔抗Caspase-9和c-Caspase-3抗體(1∶1 000稀釋),4 ℃過夜。加HRP標記的山羊抗小鼠IgG或HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育,ECL法曝光并顯影,觀察圖像并采集圖像,Image J軟件分析灰度值。

1.8 TUNEL實驗檢測細胞凋亡

將切片脫蠟,滴加一點工作液蛋白酶K,37 ℃孵育25 min。稍甩干后滴加破膜工作液,37 ℃孵育20 min,PBS洗滌玻片3次,每次5 min;按照TUNEL試劑盒說明配比工作液,滴加到玻片上并覆蓋組織,封片,400倍鏡下觀察并采集圖像,Image J軟件分析結果。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 SAHA對間歇性低氧小鼠肝細胞的影響

HE染色的小鼠肝組織病變顯示,control組肝臟組織鏡下細胞結構、形態正常,大小規整,排列整齊,肝細胞無明顯變性;與control組相比,CIH組肝細胞水腫、排列紊亂無序,細胞空泡化明顯,甚至出現變性及壞死,并伴有炎細胞浸潤、聚集現象;CIH+SAHA組胞質疏松化、細胞空泡化較少、肝竇擴張,表明肝損傷相對較輕(見圖1)。說明慢性間歇性低氧可以對肝組織細胞造成一定損傷,SAHA可減輕間歇性低氧造成的肝損傷。

圖1 慢性間歇性低氧對小鼠肝組織細胞的影響 (HE,×400)Figure 1 Effects of chronic intermittent hypoxia on liver tissue cells in mice (HE,×400)

2.2 SAHA對慢性間歇性低氧小鼠肝指數的影響

與control組相比,慢性間歇性低氧4周后,CIH組小鼠肝臟指數明顯升高(P<0.05),表明慢性間歇性低氧導致小鼠肝臟發生腫脹;而與CIH組比較,CIH+SAHA組小鼠肝臟指數顯著降低(P<0.05,見圖2),表明SAHA可以緩解小鼠肝臟腫脹。

注:與control組比較,*P<0.05;與CIH組比較,#P<0.05。圖2 慢性間歇性低氧對小鼠肝指數的影響Figure 2 Effects of chronic intermittent hypoxia on liver index in mice

2.3 SAHA對小鼠肝臟血清生化指標的影響

與control組比較,CIH組小鼠血清中ALT、AST水平明顯升高(P<0.01),表明慢性間歇性低氧導致小鼠肝臟損傷;與CIH組比較,CIH+SAHA組小鼠血清中ALT及AST水平明顯降低(P<0.01,見圖3),表明SAHA可以緩解小鼠肝臟損傷。

注:與control組比較,**P<0.01;與CIH組比較,##P<0.01。圖3 SAHA對小鼠血清ALT、AST活性的影響Figure 3 Effect of SAHA on serum ALT and AST activities in mice

2.4 SAHA對凋亡蛋白的影響

Western blot檢測顯示,間歇性低氧4周后,與control組相比,CIH組小鼠肝組織凋亡蛋白Caspase-9和c-Caspase-3的蛋白表達上調(P<0.01);與CIH組相比,CIH+SAHA組小鼠肝臟凋亡蛋白Caspase-9和c-Caspase-3的蛋白表達下調(P<0.05,見圖4)。表明SAHA可抑制凋亡蛋白水平。

注:與control組比較,**P<0.01;與CIH組比較,#P<0.05。圖4 間歇性低氧對小鼠肝臟凋亡相關蛋白表達量的影響Figure 4 Effect of intermittent hypoxia on apoptosis related protein expression in mouse liver

2.5 SAHA減輕小鼠肝組織細胞凋亡

TUNEL結果顯示,與control組相比,CIH組小鼠肝組織中TUNEL陽性細胞明顯增多(P<0.01);與CIH組相比,CIH+SAHA組小鼠肝臟中TUNEL陽性細胞降低(P<0.05,見圖5),說明SAHA治療可以減輕慢性間歇性低氧損傷導致的細胞凋亡。

注:藍色為正常細胞,綠色為凋亡細胞;與control組比較,**P<0.01;與CIH組比較,#P<0.05。圖5 TUNEL實驗檢測小鼠肝組織細胞的凋亡 (×400)Figure 5 Apoptosis of mouse liver tissue cells detected by TUNEL assay (×400)

3 討論

CIH是OSAS最為典型的病理生理學特征,具有危險性高、容易被忽視的特點。OSAS與很多疾病息息相關,例如:糖尿病、高血壓和代謝綜合征等。研究表明:35%～45%的肥胖患者伴有OSAS,超過4%的普通人群也伴有OSAS[7]。本實驗結果顯示:經過4周的間歇性低氧處理,小鼠肝指數顯著升高且肝組織細胞損傷明顯,肝組織細胞凋亡相關蛋白Caspase-9和c-Caspase-3的表達水平顯著升高,同時肝組織細胞凋亡增加;SAHA給藥處理可以顯著降低間歇性低氧肝指數,降低ALT、AST水平以及Caspase-9和c-Caspase-3蛋白表達水平,減輕肝組織的細胞凋亡情況,其機制可能與SAHA抑制凋亡相關蛋白Caspase-9/Caspase-3水平相關。

HDACs抑制劑按結構分為異羥肟酸鹽(SAHA和TSA)、短鏈脂肪酸(丁酸鹽、丁酸苯酯和丙戊酸)、環肽和氨基苯甲酰胺(FK-228)四大類。HDAC酶是調控血管緊張、血管生成和內皮功能障礙的有關血管內皮穩態的關鍵調節劑之一[8]。其中異羥肟酸鹽SAHA具有明顯的促自噬及抗炎效應[9-13]。研究表明,SAHA可以促進自噬作用從而改善機體心肌缺血再灌注損傷,在動物模型刀豆蛋白A誘導的急性肝損傷模型中SAHA也具有一定的保護作用[14]。SAHA是一種應用于臨床的組蛋白去乙?；敢种苿?美國FDA批準),該藥最初被應用于癌癥疾病的治療[15]。隨著研究的深入,發現SAHA具有促進細胞自噬功能,此功能(促自噬效應)不僅發生在抗腫瘤過程中,而且在減輕組織器官炎癥性損傷過程和抑制巨噬細胞相關炎癥中也發揮了重要的作用[16]。另外,目前所知HDACs在各項生理過程中扮演重要角色,與細胞分化、增殖和凋亡等密切相關。隨著研究HDACs的逐步深入,科學家們研究出的各類組蛋白去乙?；敢种苿?已逐步被應用于各類臨床實驗研究,例如,HDACIs在急慢性炎癥性腸病、各類類風濕關節炎等多種炎癥性疾病中具有一定的治療效果[17-21]。

本實驗通過對實驗小鼠給予一定劑量的SAHA干預處理,結果顯示SAHA對Caspase-9和Caspase-3等凋亡相關蛋白表達產生顯著抑制作用,表明SAHA通過抑制凋亡水平、降低ALT、AST水平減輕肝損傷。在其他動物模型中也有相似結果,有研究發現SAHA具有一定的免疫調節作用,其原理是SAHA通過抑制Caspase相關信號通路,抑制細胞凋亡減輕缺血-再灌注肝損傷[22]。為了解SAHA對于間歇性低氧小鼠肝組織損傷保護機制,本實驗選取Caspase-9和c-Caspase-3凋亡蛋白進行研究,外界因素誘導線粒體外膜通透性改變,導致Caspase-9被激活,被激活后的Caspase-9進一步促進并誘導肝細胞凋亡;同時Caspase-9被激活后形成自身切割可以生成Caspase-3和Caspase-7,Caspase-3作為凋亡標志分子和標志物,是細胞凋亡和損傷的標志,其可能機制是細胞線粒體外膜通透性改變而引起細胞凋亡,從而導致一定程度的肝損傷[23]。

CIH對肝臟的損傷表現為病理性改變,肝臟細胞出現不同程度的纖維化、損傷、炎癥等。低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)是在缺氧情況下機體內重要的轉錄因子,分為α亞基和β亞基兩種類型,α亞基在一般低氧環境結構穩定,但是常氧環境下不穩定而降解,降解后與β亞基結合而發揮作用;在缺氧狀態下,HIF-1α mRNA表達升高,促使HIF-1α活性及相關蛋白穩定性增加,恢復氧氣后HIF-1α蛋白逐漸降解,HIF-1α和相關基因作用共同來完成細胞缺氧-復氧的調節[24,25]。

綜上所述,SAHA可以降低凋亡蛋白c-Caspase-3和Caspase-9表達,抑制凋亡水平,降低AST、ALT的水平和小鼠肝指數。SAHA可能通過抑制凋亡相關蛋白Caspase-9和Caspase-3的表達,從而改善慢性間歇性低氧小鼠模型所引起的肝損傷。