Treg細胞抑制慢性中耳炎模型小鼠中耳炎癥的進展

王 丹,楊啟梅,劉曉娜,陳菁華(西北婦女兒童醫院耳鼻喉科,西安 7006;陜西省人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科;通訊作者,E-mail:703379@qq.com)

慢性中耳炎(chronic otitis media,COM)是臨床上多發的兒童性疾病[1],主要分為慢性分泌性中耳炎和慢性化膿性中耳炎[2,3],疾病的發展會導致聽力損失、語言發育延遲以及永久性中耳損傷等[4]。研究表明,在COM的細菌感染中,大多數病例是由革蘭氏陰性菌引起[5]。脂多糖是革蘭氏陰性菌的一種成分,已在人類中耳積液(middle ear fluid,MEE)中檢測到[6],其在慢性中耳炎患者中的水平明顯高于急性中耳炎患者[7]。研究表明,COM與持續性細菌感染有關,在90%以上的COM患者的中耳黏膜(middle ear mucosa,MEM)活檢標本中均發現了不同的致病菌群[8]。據報道,咽鼓管(eustachian tube,ET)功能紊亂和持續的細菌感染與COM的發病機制密切相關[9]。通過ET阻斷產生的COM小鼠顯示出持續的漿液性中耳積液,同時伴有中耳腔內炎性細胞浸潤(尤其是淋巴細胞)和細胞因子產生的組織學變化[10]。

不可分型流感嗜血桿菌(non-typeableHaemophilusinfluenzae,NTHi)被認為是COM的主要病原體[11]。NTHi菌株可以在氣道內持續很長時間,當宿主的黏膜清除機制受損時,NTHi可以引起一系列的氣道感染[12]。目前,通常采用制造ET功能障礙和持續NTHi細菌感染構建COM動物模型,以用于研究COM的發病機制[12-14]。調節性T細胞(Treg),也被稱為抑制性T細胞,是由一個特定的細胞亞群組成,在功能上抑制免疫系統的過度激活,保持對自我抗原的免疫耐受[15],編碼Treg細胞轉錄因子叉頭盒P3(fork headbox protein 3,Foxp3)的基因是Treg分化和功能的主基因[16]。研究表明,Treg可針對體內的細菌、病毒和寄生蟲抗原被激活和擴大[17]。本研究通過ET阻斷和接種NTHi,建立了持續性NTHi感染的小鼠COM模型,以探究Treg對慢性中耳炎感染進展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)購自上海生工有限公司;巧克力瓊脂、多聚甲醛購自碧云天生物科技有限公司;27號針頭購自Hamilton公司(美國);山羊血清、牛血清白蛋白購自AusgeneX公司(澳大利亞);一抗TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β和CD4抗體、Foxp3抗體、CD25抗體均購自Abcam公司(美國);商用ELISA試劑盒購自R&D公司(美國);Ⅳ型膠原酶購自Sigma公司(美國);CD4+CD25+FOXP3+Treg調節性T細胞檢測試劑盒購自EXBIO公司(捷克);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 實驗動物與菌株 4周齡BALB/c小鼠購自陜西中醫藥大學【SCXK(陜)2021-001】,所有小鼠均在西北婦女兒童醫院醫學檢驗中心實驗動物屏障設施中適應性飼養1周,然后進行動物實驗,本研究動物實驗符合動物福利規范,獲得本院倫理委員會的批準(審批號:No.2021-9-06-1035)。具有活性的不可分型流感嗜血桿菌NTHi菌株由西北婦女兒童醫院醫學檢驗中心實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 NTHi誘導實驗性COM小鼠模型 根據文獻所述研究方法[18],NTHi菌株采用巧克力瓊脂于37 ℃和5%CO2下培養16 h,測定細菌濃度,加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)制備濃度為2×109CFU/mL的細菌懸液。采用異氟醚吸入法麻醉小鼠后,于小鼠頜下皮膚處切口,暴露右下鼓室,切開靠近鼓室的咽鼓管(ET),并將明膠海綿插入ET(形成ET阻塞)。然后用27號針頭在鼓膜上開2個微孔,將微吸管插入其中一個孔中,緩慢接種10 μL的NTHi細菌懸浮液,每3 d注射1次,共3次。通過對小鼠進行耳鏡監測,出現中耳積液和中耳黏膜組織增厚表示造模成功。本實驗設置模型組(n=40)和對照組(n=40),模型組為造模成功的小鼠,對照組為未進行ET阻斷和NTHi接種的小鼠。

分別在末次注射后的第3天(M3 d組)、第14天(M14 d組)、第28天(M28 d組)和第56天(M56 d組),模型組和對照組均各取8只小鼠給予腹腔注射3%戊巴比妥麻醉處理并斷頭處死。對各只小鼠進行耳鏡監測,確認MEE狀態和鼓膜的變化。根據分級標準[19]進行炎癥嚴重程度評分:0分,灰色和半透明的鼓膜,沒有MEE;1分,灰色和不透明的鼓膜,有漿液性MEE或黏液性MEE;2分,黃色和不透明鼓膜,有膿性MEE;3分,不透明鼓膜,有漿液性MEE。收集各只小鼠MEE,取部分連續稀釋后將樣品置于巧克力瓊脂上,培養并計數細菌菌落。使用200 μL生理鹽水清洗小鼠中耳,分離收集小鼠中耳組織和中耳黏膜組織后續實驗備用。

1.2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測小鼠中耳黏膜組織炎性病變程度 各組小鼠中耳黏膜組織使用4%多聚甲醛固定48 h,并在0.12 mol/L的EDTA溶液(pH=7.4)中脫鈣后,再進行梯度乙醇脫水和二甲苯處理,然后包埋于石蠟切成4 μm厚度切片。按照試劑盒方法進行HE染色,使用Image J軟件檢測和分析黏膜厚度和MEM中的炎性細胞數量,采用光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 免疫組織化學檢測CD4+和Foxp3+細胞水平 取1.2.2項下制好的石蠟切片,于室溫下用3%的H2O2處理15 min。再將切片于含5%正常山羊血清的PBS緩沖液中封閉處理30 min,然后加入兔抗小鼠CD4抗體(1∶500)或兔抗小鼠Foxp3抗體(1∶500)于含1%牛血清白蛋白的PBS緩沖液于室溫下孵育12 h。PBS清洗后,切片與加入生物素化的山羊抗兔抗體(1∶1 000)的1%牛血清白蛋白的PBS緩沖液于室溫下孵育6 h。用PBS沖洗后,經過DAB液顯色,然后蘇木素染色、藍化、脫水和透明處理,最后中性樹膠封片,采用光學顯微鏡觀察并拍照,采用Image J軟件量化陽性染色強度。

1.2.4 ELISA檢測小鼠MEE中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平 取1.2.1項下收集的MEE,按照ELISA試劑盒方法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-10和轉化生長因子(TGF-β)的水平。

1.2.5 Western blot檢測小鼠中耳黏膜組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β蛋白表達水平 取方法1.2.1項下分離收集的各組小鼠中耳黏膜組織,加入RIPA裂解液提取組織總蛋白,采用BCA試劑盒對總蛋白定量。再經過12%的SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶,轉移至PVDF膜,然后加入5%的脫脂牛奶封閉。加入一抗TNF-α(1∶500)、IL-1β(1∶1 000)、IL-10(1∶500)和TGF-β(1∶500)于4 ℃下孵育過夜。再加入稀釋后的二抗于室溫下孵育2 h,經過ECL顯色和曝光后成像。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,GAPDH作為內參蛋白。

1.2.6 流式細胞術檢測分析小鼠中耳黏膜組織CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞水平 參考文獻[20]方法,取1.2.1項下收集的小鼠新鮮中耳黏膜組織,采用0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶解離處理組織,分離并培養制作獲得單細胞懸浮液,調整細胞密度為1.0×106個/mL用于流式細胞術檢測。單細胞懸浮液中加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD4單克隆抗體mAb、藻紅素(PE)標記的抗Foxp3 mAb和別藻藍蛋白(APC)標記的抗CD25 mAb,然后4℃下避光處理30 min,PBS洗滌后流式細胞儀上機檢測分析CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+比例,采用Cell Quest軟件分析Treg的免疫熒光強度。

1.2.7 注射抗CD25 mAb模擬體內Treg耗竭并檢測T細胞和炎性因子水平 參考文獻[21]方法,在ET阻斷和NTHi接種處理后第14,28,42天,每只小鼠腹腔注射125 μl抗-CD25 mAb(作為抗-CD25組,n=8),PBS組小鼠腹腔注射等體積PBS(n=8)。在治療第56天后,小鼠腹腔注射3%戊巴比妥麻醉處理后斷頭處死,立即分離收集脾臟、頸部淋巴結和中耳黏膜組織,采用IV型膠原酶解離處理制作獲得單細胞懸浮液。按照1.2.6所述檢測脾臟、頸部淋巴結和中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg陽性細胞百分比;按照1.2.1所述收集各只小鼠MEE,培養并計數細菌菌落;按照1.2.3所述檢測中耳黏膜組織單細胞懸浮液中TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β的水平。

1.3 數據分析

2 結果

2.1 NTHi成功誘導構建小鼠COM模型

與對照組相比,模型組小鼠均在3 d后出現中耳積液且為膿性,在第14天炎癥嚴重程度和細菌數量均至最高值;從第28天至第56天,小鼠炎癥嚴重程度和中耳積液細菌數量均呈一定程度下降,但相較于對照組仍處于較高水平(P<0.05,見表1)。

表1 兩組小鼠中耳炎癥嚴重程度和中耳積液細菌數量比較Table 1 Comparison of the severity of middle ear inflammation and the number of bacteria in middle ear effusion between the two groups of mice

2.2 NTHi誘導的COM小鼠中耳黏膜組織炎性細胞浸潤和黏膜厚度增加

HE染色結果顯示,對照組小鼠中耳黏膜組織正常;與對照組比較,模型組小鼠接種后第3天,小鼠中耳黏膜組織出現炎性細胞浸潤,炎性細胞數量和黏膜厚度增加(P<0.05),到第14天至最高值;接種后第28天至第56天,小鼠中耳黏膜厚度和炎性細胞浸潤程度增加趨勢稍有減緩(P<0.05,見圖1)。

注:與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖1 NTHi誘導的COM小鼠中耳黏膜組織炎癥和黏膜厚度變化Figure 1 Changes of inflammation and mucosal thickness in mucosal tissue of COM mice induced by NTHi

2.3 NTHi誘導的COM小鼠中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞水平升高

免疫組化結果顯示,模型組小鼠接種后第3天,中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細胞陽性染色水平升高,從接種后第28天至第56天,中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細胞陽性染色水平升高趨勢稍有緩解(見圖2)。流式細胞術檢測結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠接種后第3天,中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+細胞水平升高(P<0.05),到第14天至最高值;接種后第28天至第56天,與對照組相比仍處于較高水平(P<0.05,見圖3)。

圖2 免疫組織化學檢測小鼠中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細胞變化Figure 2 Changes of CD4+ and Foxp3+ cells in mouse middle ear mucosa detected by immunohistochemistry

注:與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖3 流式細胞術檢測小鼠中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+細胞變化Figure 3 Changes of CD4+CD25+Foxp3+ cells in mouse middle ear mucosa detected by flow cytometry

2.4 NTHi誘導的COM小鼠中耳積液和中耳黏膜組織中炎性因子水平升高

ELISA檢測結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠接種后第3天,中耳積液中促炎因子IL-1β和TNF-α的水平達到最高(P<0.001),在第14天抑炎因子IL-10和TGF-β的水平達到最高(P<0.001),在第28,56天,IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平均呈下降趨勢,但與對照組相比仍處于較高水平(P<0.01,見圖4)。Western blot檢測小鼠中耳黏膜組織中炎性因子水平結果變化趨勢與ELISA檢測結果一致(見圖5)。

注:與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001。圖4 ELISA檢測小鼠中耳積液中炎性因子表達水平變化Figure 4 Expressions of inflammatory factors in the middle ear effusion of mice detected by ELISA

注:與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001。圖5 Western blot檢測小鼠中耳黏膜組織中炎性因子表達水平變化Figure 5 Expressions of inflammatory factors in mouse middle ear mucosa detected by Western blot

2.5 Treg細胞消耗對COM小鼠細菌清除和炎癥的影響

流式細胞術結果顯示,與PBS組小鼠相比,抗-CD25組小鼠中耳黏膜、脾臟和頸部淋巴結組織中CD4+CD25+Foxp3+細胞比例均顯著降低(P<0.05,見圖6)。細菌計數和炎性因子檢測結果顯示,與PBS組小鼠相比,抗-CD25組小鼠中耳積液中細菌數和中耳黏膜組織中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平均降低(P<0.01,見圖7)。

圖6 抗CD25 mAb對小鼠中耳黏膜組織、脾臟和頸部淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+細胞的影響Figure 6 Effect of anti-CD25 mAb on CD4+CD25+Foxp3+ cells in middle ear mucosa tissue, spleen and cervical lymph nodes of mice

注:與PBS組相比,**P<0.01。圖7 抗CD25 mAb對小鼠中耳積液細菌數和中耳黏膜組織中炎性因子水平的影響Figure 7 Effects of anti-CD25 mAb on bacterial count and inflammatory factors in middle ear effusion of mice

3 討論

慢性中耳炎(COM)是中耳和乳突腔的一種慢性炎癥,通常由復發性急性中耳炎發展而來,涉及多微生物的感染[22]。NTHi被認為是呼吸道感染疾病的重要病原菌,也是急性中耳炎的主要病原體[23]。先前有研究報道[24],接種NTHi誘發了栗鼠的急性中耳炎,但在14 d后,僅能檢測到少量具有活性的NTHi,而在大鼠急性中耳炎模型中8 d后檢測不到NTHi的存在。以上動物造模過程中并沒有實施ET阻斷處理,而中耳的感染進程也僅限于幾個星期。在本研究中,通過將NTHi接種至中耳并采用ET阻斷處理成功建立了COM小鼠模型。結果顯示,COM小鼠的中耳黏膜增厚,且出現炎性細胞浸潤;在造模后第56天,COM小鼠中耳黏膜組織仍存在炎癥病理狀態,且在COM小鼠的中耳積液中均檢測到NTHi的存在。

CD4+CD25+Foxp3+Treg作為T淋巴細胞亞群的成員,主要對機體免疫反應起到負調控作用,通過免疫抑制作用讓機體產生免疫耐受性,以防止自身免疫疾病的發生,同時還會導致炎癥反應趨向慢性發展[25]。研究顯示,在健康黏膜中觀察到T細胞輔助亞群的平衡在炎癥黏膜中發生改變,CD4+/CD8+T細胞的比例根據慢性鼻炎炎癥的嚴重程度而增加[19]。本研究結果表明,與對照組相比,模型組COM小鼠中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細胞和CD4+CD25+Foxp3+細胞比例均發生不同程度的升高,這表明Treg在COM發生過程中已發揮免疫效應。也有報道顯示,Treg細胞與炎癥反應的發生密切相關,且具有一定的抗炎作用,研究認為Treg細胞通過對機體免疫系統過度活化和病理性自身免疫反應的抑制,發揮免疫調節功能,維持機體免疫平衡,同時還可以發揮抗炎作用[26]。本研究中,與對照組比較,模型組COM小鼠隨著造模時間的延長,小鼠中耳積液和中耳黏膜組織中促炎性因子IL-1β和TNF-α水平迅速升高,這些促炎因子激活機體先天和獲得性免疫系統清除侵入的抗原;同時也檢測到抑炎因子IL-10和TGF-β水平的升高,這可能提示機體內T淋巴細胞亞群CD4+CD25+Foxp3+Treg發揮免疫抑制作用,通過分泌或誘導產生抑炎因子IL-10和TGF-β,以維持機體內炎癥反應的平衡,促使機體恢復正常免疫和生理水平,避免產生自身免疫性傷害。

CD4+T細胞可通過TGF-β誘導的Foxp3的表達轉化為CD4+Treg[27]。1型調節性T細胞(Tr1細胞)通過產生高水平的IL-10來抑制抗原特異性免疫反應,而Tr1細胞在激活后可暫時表達Foxp3;調節T細胞3型(Th3)通過產生高水平的TGF-β以驅動外周抗原特異性Foxp3調節細胞的分化,在誘導和維持外周耐受方面發揮了關鍵作用[28]。在本研究中,這些Treg被認為與NTHi感染中的持續炎癥有關。眾所周知,Treg在控制感染性疾病(包括病毒、寄生蟲和細菌)方面發揮著重要作用,Treg在宿主防御中發揮著兩種不同的關鍵免疫作用(保護性或有害性)[29]。Treg細胞已成為機體對細菌、真菌和病毒免疫抵抗的重要組成部分,其發揮的免疫防御功能有效減輕了機體組織損傷程度,但另一方面也導致機體對入侵病原體的免疫反應降低,致使病原體在宿主體內持久存在[30]。研究表明,結核分枝桿菌對機體的持久性感染與Treg細胞在損傷組織內持續增殖和聚集密切相關,而當對Treg細胞適當消耗后,小鼠對結核分枝桿菌的負擔顯著下降[31]。嚴唯[32]研究發現,煙曲霉菌感染小鼠肺部后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞參與了抑制宿主炎癥反應過程,但同時也抑制了宿主對煙曲霉菌的清除作用;當模型小鼠腹腔注射CD25中和抗體后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例下降,受感染的小鼠肺部對煙曲霉菌的負荷也下降。在本研究中,COM小鼠腹腔注射抗-CD25 mAb后,第56天CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例顯著下降,同時MEE中的細菌數量也顯著減少,這表明機體過度免疫后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的適當降低,能夠促進宿主對細菌的清除作用,該結果與嚴唯[32]的研究結果一致。

本研究證明了Treg細胞在慢性中耳炎中發揮免疫保護和抑制自身免疫性傷害兩種不同免疫作用,同時發現在中耳局部的免疫應答中Treg細胞發揮主要免疫作用,但炎癥作為一種可能涉及全身組織器官的反應,慢性中耳炎所引起的全身和局部免疫應答中Treg細胞是否仍處于主導免疫角色未可知,這也是本研究的局限性之一。同時,本研究未對慢性中耳炎小鼠Treg細胞發揮免疫效應可能涉及到的分子信號通路做深入的解析,與T細胞分化相關的PI3K/Akt/mTOR信號通路[15],以及與中耳炎相關的TGF-β信號通路[33],都有可能是慢性中耳炎中Treg細胞發揮免疫作用的分子機制,這也是未來研究需要深度解析的方向。

綜上所述,本研究成功構建NTHi可持續感染的COM小鼠模型,Treg細胞在慢性中耳炎的炎癥平衡維持中具有重要作用,抑制炎癥的進展,但過度的Treg細胞抑制了宿主對細菌的清除作用。