敲低CD73 的表達對人肺腺癌H1975 細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響及其機制△

肖文華，黃真，劉鳳娟，張弘，蘇紅，孫榮麗

1 青島大學青島醫學院，山東 青島 266042 康復大學青島中心醫院（青島市中心醫院）2 院長辦公室，3 藥物臨床試驗中心一期病房，4 呼吸與危重癥醫學科，5 基層醫療科，山東 青島 266042

中國國家癌癥中心統計報告顯示，肺癌是中國發病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌的常見病理類型為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC 中又以肺腺癌最為多見，占所有NSCLC 病理類型的50%以上，且呈持續上升趨勢[2]。肺腺癌患者的病死率一直處于較高水平，中晚期肺腺癌患者的5 年生存率不足20%[3]。CT 等影像學檢查的普及明顯提高了早期肺癌的診斷率，降低了病死率，但對于中晚期肺癌患者無明顯受益[4]。近年來，隨著免疫檢查點的發現及免疫檢查點抑制劑的應用，患者的預后和生活質量得到了明顯改善，且不良反應發生風險較低，表明免疫治療具有良好的發展前景[5-6]。盡管如此，仍然有一部分患者不能從現有的免疫治療中獲益。因此，積極探索新的潛在治療靶點至關重要。胞外5’-核苷酸酶（5’-nucleotidase ecto，NT5E），又稱為CD73，是一種多功能跨膜糖蛋白，參與細胞外腺苷的生成，與免疫、炎癥和腫瘤等多種病理、生理反應相關[7]。有研究表明，CD73 在多種腫瘤中高表達，且患者大多預后不良[8-11]，但其促進腫瘤發生、發展的具體作用機制尚未完全清楚，特別是CD73 促進肺腺癌發生發展的機制鮮有報道。本研究探討敲低CD73的表達對人肺腺癌H1975 細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，并進一步探索其可能的機制，以期為肺腺癌的發生、發展機制和治療方法的研究提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 細胞和試劑

人肺腺癌H1975 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。慢病毒HBLV-ZsGreen-PURO 購自上海漢恒科技公司。胎牛血清購自以色列Biological Industries 公司，Matrigel 基質膠、RPMI 1640 培養基、Transwell 細胞培養小室均購自美國Corning公司，CD73、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）p85a 抗體均購自英國Abcam 公司，磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）抗體均購自美國ImmunoWay 公司，磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，E-上皮鈣黏素（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。本研究經過青島市中心醫院醫學倫理委員會審批通過（KY202217502）。

1.2 人肺腺癌H1975 細胞培養與轉染

將人肺腺癌H1975 細胞培養在含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的RPMI 1640 完全培養基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中常規培養。細胞消化離心后置入完全培養基重懸，配制1.5×105/ml 的細胞懸液，并加入6 孔板中（每孔接種1 ml）。待細胞密度生長至50%左右，將原培養基棄去，每孔加入5 μg/ml 聚凝胺混合培養基1 ml。然后每孔加轉染慢病毒60μl[感染復數（multiplicity of infection，MOI）=40]，4 h 后將混合培養基補齊至2 ml。轉染24 h 后棄去含病毒的培養基，換為新鮮完全培養基，置于培養箱中繼續培養。轉染72 h 后置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，若細胞狀態穩定，換上濃度適當的含嘌呤霉素（本研究嘌呤霉素濃度為3 μg/ml）的新鮮完全培養基進行篩選培養，待無明顯細胞死亡后視為未轉染的正常細胞已全部殺死，此時更換新的完全培養基繼續培養，定期重復篩選。將轉染慢病毒HBLV-ZsGreen-PURO NC 的人肺腺癌H1975細胞作為H1975-NC 組，將轉染3 種不同位點敲低CD73表達的慢病毒HBLV-h-CD73短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）-ZsGreen-PURO 的人肺腺癌H1975 細胞分別作為H1975-shCD73-1 組、H1975-shCD73-2 組、H1975-shCD73-3 組，以未轉染人肺腺癌H1975 細胞作為空白對照組。

1.3 蛋白質印跡法（Western blot）篩選敲低效果最明顯的轉染細胞

分別收集空白對照組、H1975-NC 組、H1975-shCD73-1 組、H1975-shCD73-2 組、H1975-shCD73-3組細胞至1.5 ml 離心管中，加入適量的放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液和苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）混合液（100∶1）于冰上裂解30 min 后低溫離心，取上清液，加入適量蛋白上樣緩沖液置于100 ℃金屬浴鍋中加熱10 min，提取總蛋白后進行電泳，然后轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封閉后加入適量抗體溶液進行孵育（抗體溶液根據說明書進行稀釋），然后將配制的發光液滴加在PVDF 膜條帶上，于暗室內進行曝光處理。曝光結束后采用ImageJ 軟件分析蛋白條帶相對灰度。選取敲低效果最明顯的轉染細胞進行后續實驗，作為H1975-sh 組。

1.4 CCK8 法檢測細胞增殖能力

選取H1975-NC、H1975-sh 組細胞，制備濃度為5×104/ml 的細胞懸液。接種至6 孔板中，每孔中加入100μl 細胞懸液，加入100μl 完全培養基培養4、24、48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK8 溶液，置于培養箱中靜置培養2 h，采用酶標儀檢測H1975-NC、H1975-sh 組細胞450 nm 處的吸光度（optical density，OD）值，酶標儀以H1975-NC 組為對照調零。

1.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

選取H1975-NC 組、H1975-sh 組細胞加入至6孔板中，并接種等量細胞（H1975-sh 組細胞可適當增加接種量）置于培養箱中培養，顯微鏡下觀察到6 孔板內長滿細胞后消毒，用200 μl 槍頭沿直尺垂直底部橫線從頂部向底部劃線。然后每孔加入2 ml 含1%胎牛血清的RPMI 1640 培養基后于鏡下拍照，拍照完畢后繼續于培養箱中培養，分別在培養24、48 h 時再次于鏡下拍照，觀察細胞遷移情況。

1.6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力

將Matrigel 膠加入RPMI 1640 培養基按照1∶40 稀釋，每個細胞培養小室中加入100 μl 稀釋好的Matrigel 膠，置于培養箱中靜置4 h 后取出，吸走小室內未凝固的培養液，每個小室下方加入600 μl 完全培養基。收集H1975-NC 組、H1975-sh組細胞，用不含血清的RPMI 1640 培養基制備濃度為2.5×105/ml 的細胞懸液，每個小室內加入200 μl 細胞懸液，每個實驗組設置3 個復孔，然后將孔板繼續置于培養箱中培養。培養16 h 后將孔板拿出，將小室浸入甲醇溶液中固定細胞，然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗風干后將小室浸入0.1%結晶紫溶液中染色，染色完成后用PBS 沖洗2 次，再將小室倒置晾干。最后將小室放在載玻片上置于顯微鏡下觀察，隨機選擇5 個視野進行拍照并計算侵襲細胞數目。

1.7 Western blot 檢測上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、PI3K/AKT 信號通路標志蛋白的表達水平

Western blot 檢測方法同1.3 部分，檢測H1975-NC 組、H1975-sh 組EMT 通路標志蛋白E-cadherin、vimentin 的表達水平以及PI3K/AKT 信號通路標志蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 的表達水平，計算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT。

1.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot 檢測細胞CD73 表達情況

慢病毒CD73shRNA 分別轉染人肺腺癌H1975 細胞后，熒光顯微鏡下觀察到穩定表達綠色熒光即表示轉染成功，通過嘌呤霉素篩選轉染成功細胞并殺死未轉染細胞，穩定傳代進行后續實驗（圖1）。采用Western blot 檢測空白對照組、H1975-NC 組、H1975-shCD73-1 組、H1975-shCD73-2 組、H1975-shCD73-3 組的CD73 表達情況，結果顯示，5 組細胞的CD73 表達情況比較，差異有統計學意義（P﹤0.01），其中H1975-shCD73-2 組細胞CD73敲低效果最明顯，選取該組（即H1975-sh 組）細胞進行后續實驗。（圖1、圖2、表1）

圖1 熒光顯微鏡顯示慢病毒CD73 shRNA轉染人肺腺癌H1975細胞

圖2 Western blot檢測各組人肺腺癌H1975細胞CD73表達情況

表1 各組人肺腺癌H1975 細胞CD73 蛋白表達水平的比較（±s）

表1 各組人肺腺癌H1975 細胞CD73 蛋白表達水平的比較（±s）

組別空白對照組H1975-NC組H1975-shCD73-1組H1975-shCD73-2組H1975-shCD73-3組F值P值CD73蛋白表達水平0.942±0.053 0.887±0.047 0.446±0.063 0.312±0.049 0.513±0.145 36.23<0.01

2.2 敲低CD73 的表達對人肺腺癌H1975 細胞增殖能力的影響

采用CCK8 實驗檢測H1975-NC 組、H1975-sh組細胞的增殖能力，結果顯示，轉染4 h，H1975-NC組細胞與H1975-sh 組細胞OD 值比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）；轉染24、48、72 h，H1975-sh 組細胞OD 值均明顯低于H1975-NC 組細胞，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表2）

表2 轉染不同時間H1975-NC組、H1975-sh組細胞OD值的比較

2.3 敲低CD73 的表達對人肺腺癌H1975 細胞遷移能力的影響

采用細胞劃痕實驗檢測H1975-NC、H1975-sh組細胞遷移能力，結果顯示，培養24、48 h，H1975-sh組細胞的劃痕面積愈合率分別低于H1975-NC 組細胞，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表3、圖3）

圖3 轉染不同時間H1975-NC組、H1975-sh組細胞遷移情況

表3 轉染不同時間H1975-NC 組、H1975-sh 組細胞劃痕面積愈合率的比較

2.4 敲低CD73 的表達對人肺腺癌H1975 細胞侵襲能力的影響

采用Transwell 侵襲實驗檢測H1975-NC 組、H1975-sh 組細胞侵襲能力，結果顯示，轉染16 h后，H1975-sh 組細胞侵襲數目為（146±15），少于H1975-NC 組細胞的（254±22），差異有統計學意義（t=7.176，P﹤0.05）。（圖4）

圖4 Transwell侵襲實驗檢測H1975-sh組、H1975-NC組細胞侵襲情況

2.5 敲低CD73 的表達對EMT 通路標志蛋白E-cadherin、vimentin 表達的影響

Western blot 檢測各組人肺腺癌H1975 細胞EMT 通路標志蛋白的表達情況，結果顯示，空白對照組、H1975-NC 組、H1975-sh 組細胞E-cadherin、vimentin 蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P﹤0.01）；其中H1975-sh 組細胞E-cadherin 蛋白的相對表達量高于空白對照組和H1975-NC 組細胞，差異均有統計學意義（t=20.95、10.62，P﹤0.05）；H1975-sh 組細胞vimentin 蛋白的相對表達量低于空白對照組和H1975-NC 組細胞，差異均有統計學意義（t=31.30、7.77，P﹤0.05）。（表4）

表4 各組人肺腺癌H1975 細胞EMT 通路標志蛋白E-cadherin、vimentin 相對表達量的比較（±s）

表4 各組人肺腺癌H1975 細胞EMT 通路標志蛋白E-cadherin、vimentin 相對表達量的比較（±s）

組別空白對照組H1975-NC組H1975-sh組F值P值E-cadherin蛋白0.216±0.033*0.394±0.110*1.214±0.076 134.50<0.01 vimentin蛋白1.000±0.034*0.732±0.138*0.091±0.037 91.03<0.01

注：*與H1975-sh組細胞比較，P<0.05

2.6 敲低CD73 的表達對PI3K/AKT 通路蛋白表達情況的影響

采用Western blot 檢測H1975-NC 組、H1975-sh組人肺腺癌H1975 細胞PI3K/AKT 信號通路蛋白的表達情況，結果顯示，H1975-sh組細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 均低于H1975-NC 組細胞，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表5）

表5 H1975-NC 組、H1975-sh 組人肺腺癌H1975 細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 的比較（±s）

表5 H1975-NC 組、H1975-sh 組人肺腺癌H1975 細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 的比較（±s）

組別H1975-NC組H1975-sh組t值P值p-PI3K/PI3K 1.298±0.322 0.416±0.211 2.33 0.017 p-AKT/AKT 2.485±0.805 0.694±0.364 7.33 0.042

3 討論

肺癌嚴重危害人類健康，是全球腫瘤相關死亡的主要原因之一，其發病率和病死率均呈上升趨勢[12]。由于吸煙、職業危害、人口老齡化及環境等因素的影響，肺癌發病率居高不下。盡管現有治療手段較前已經取得了非常大的進展，但肺癌仍是中國發病率和病死率最高的惡性腫瘤，確診時已發生遠處轉移的晚期肺癌患者的5 年生存率僅為6%[13-15]。新靶點的發現和免疫治療的出現將肺癌患者的5 年生存率提升至15%～50%[15]，明顯延長了晚期肺癌患者的生存時間。盡管如此，也只有部分患者能從中獲益。因此，探索新的潛在治療靶點和進一步明確肺癌的發生、發展機制尤為重要。

CD73 可將腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）水解為腺苷后與其受體結合，通過降低T 細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞等免疫細胞的免疫活性來減少免疫因子，增強主要免疫抑制因子的活性，從而引起免疫抑制，促進腫瘤的發生、發展[10]。此外，CD73 還可充當黏附分子，可以調節細胞與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的相互作用，從而促進腫瘤細胞的侵襲、轉移[16]。CD73 在多種腫瘤中高表達，說明其對腫瘤的發生、發展發揮重要作用，但具體機制仍有待進一步探索。

EMT 是各種生理、病理過程中的重要環節，與胚胎和器官的生長發育、組織再生和纖維化、腫瘤進展和腫瘤干細胞特性密切相關[17]。EMT 過程中，上皮相關基因E-cadherin的表達受到抑制，而間質相關基因vimentin的表達增強[18]，且受到諸多如轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、WNT/β-catenin、Notch、Hedgehog 和受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）等信號通路的共同調節[18-19]。有研究表明，PI3K/AKT 信號通路可促進EMT 的發生并導致腫瘤進展[20-23]，但CD73 是否能促進肺腺癌EMT 的發生及其具體機制目前尚不完全清楚。

本研究探討CD73 在肺腺癌細胞中的生物學作用及其機制，利用慢病毒CD73shRNA 轉染人肺腺癌H1975 細胞構建CD73敲低細胞株，選取CD73敲低效果最明顯的細胞進行后續細胞增殖、遷移、侵襲實驗，結果顯示，敲低CD73的表達后，人肺腺癌H1975 細胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到抑制，說明CD73可以促進肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。為進一步探討CD73 促進腫瘤細胞發生發展的具體機制，本研究采用Western blot檢測各組細胞上EMT 通路上皮標志蛋白E-cadherin、間質標志蛋白vimentin 以及PI3K/AKT 信號通路標志蛋白的表達差異，結果顯示，H1975-sh 組細胞E-cadherin 蛋白的相對表達量高于空白對照組和H1975-NC 組細胞，vimentin 蛋白的表達量低于空白對照組和H1975-NC 組細胞，差異均有統計學意義（P﹤0.05），表明敲低CD73的表達促進了E-cadherin 蛋白的表達，抑制了vimentin 蛋白的表達，從而表明敲低CD73的表達抑制了肺腺癌細胞EMT 的發生；此外，PI3K/AKT 磷酸化程度反映該信號通路的激活程度，本研究結果顯示，H1975-sh組細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 均低于H1975-NC 組細胞，表明CD73 可能通過PI3K/AKT 信號通路促進肺腺癌EMT 的發生，進而導致肺腺癌進展。

綜上所述，CD73 能促進肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與PI3K/AKT 信號通路和EMT 過程有關。