CRISPR/Cas9系統在畜禽遺傳改良中研究進展

鮑艷春，戴伶俐，劉在霞，馬鳳英，王宇，劉永斌，谷明娟，娜日蘇，張文廣,6

綜 述

CRISPR/Cas9系統在畜禽遺傳改良中研究進展

鮑艷春1,2，戴伶俐2,3，劉在霞1,2，馬鳳英1,2，王宇4，劉永斌5，谷明娟1,2，娜日蘇1,2，張文廣1,2,6

1. 內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018 2. 內蒙古自治區農業基因組大數據工程研究中心，呼和浩特 010018 3. 內蒙古自治區農牧業科學院獸醫研究所，呼和浩特 010031 4. 內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特 010018 5. 內蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010021 6. 內蒙古農業大學生命科學學院，呼和浩特 010018

CRISPR/Cas9基因編輯技術作為一種高效的基因組編輯方法，在畜牧業遺傳改良領域得到了廣泛的應用。該技術以高效、精準的特點，為畜牧業發展帶來了一場革命。目前，基于CRISPR/Cas9的基因敲除、基因敲入和基因修飾等已被廣泛應用，實現了對畜禽物種的重要生產性狀進行精準改良。本文介紹了CRISPR/Cas9技術的工作原理及發展歷程，重點介紹了該技術在畜禽肌肉生長發育、絨毛纖維生長、乳品質成分、抗病育種以及動物福利中的研究進展，旨在為更深入地了解CRISPR/Cas9技術在畜禽基因編輯上的應用提供參考。

CRISPR/Cas9；基因編輯；畜禽；遺傳改良；經濟性狀

基因編輯是一種極具發展前景的生物工程技術，通過人為方式在有機體的基因組特定位置上刪除、添加或改變堿基，以達到編輯基因組的目的。理想的基因組編輯方法需要高效并準確地改變基因組序列，并盡量減少或避免產生脫靶效應[1]。隨著鋅指核酸內切酶(zinc-finger endonuclease，ZFN)[2]、類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator like effector nuclease，TALEN)[3]和成簇規律間隔短回文重復序列及其相關系統(clustered regularly inter spaced short palidromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)[4,5]等基因編輯技術的出現，為應對人類對蛋白質日益增長的需求問題提供了潛在的解決途徑。與ZFN和TALEN不同，CRISPR/Cas9系統具有成本低廉、操作簡單、高效以及可對多個靶基因進行同時編輯等優勢，目前已被廣泛應用于分子育種、疾病防治、遺傳改良和制藥等領域[6～11]。

近年來CRISPR/Cas9技術在畜牧業方面的應用帶來了諸多突破，包括生成轉基因動物、改良基因組特征、提高動物抗病能力以及改善農產品的品質等?？蒲腥藛T通過對特定基因進行編輯和調控，增強了動物的生產潛力和生態適應性。此外，該技術的可靠性也在不斷取得進展，例如通過堿基修飾來實現單堿基突變的插入，而無需依賴復雜的DNA供體。這意味著CRISPR/Cas9技術的應用更加簡便和高效。CRISPR/Cas9技術的快速發展極大地推動了畜禽養殖領域的革新和發展，為未來的畜牧業發展提供了更廣闊的應用前景。本文對CRISPR/Cas9技術的工作原理及進展進行了概述，著重介紹了目前該技術在主要家養動物基因組中的應用進展，為CRISPR/Cas9技術在畜禽遺傳改良的研究提供參考依據。

1 CRISPR/Cas9技術發展歷程和原理

日本科學家在1987年對大腸桿菌()的基因進行研究時，首次在位于基因3′端側翼區發現了5個高度同源的特殊結構，由29個核苷酸序列排列成的重復序列組成。由于當時在原核生物中還未發現與這些序列同源的序列，因此對這些序列的生物意義是未知的[12]。1991年，Pavletich等[13]通過解析Zif268蛋白與DNA結合的晶體結構，首次揭示了鋅指蛋白與DNA識別的分子機制。隨后，1996年Kim等[14]首次成功制造了嵌合型核酸內切酶——鋅指核酸酶。2002年，CRISPR首次被正式命名，并發現這種新型的DNA序列家族在細菌和古細菌中廣泛存在[15]，具有抵御病毒或外源物質入侵的功能，其存在形式及作用機理均不相同。同年，利用ZFN技術成功地在果蠅()中實現了基因的誘變[16,17]。之后，Barrangou等[18]確認CRISPR/Cas系統是一種原核生物特有的天然適應性防御機制。2010年，Christian等[19]將TALE蛋白和酶嵌合創造出了一種新的基因組編輯技術——TALEN。直到2011年，CRISPR/Cas9的作用機制才被揭示。當病毒首次入侵機體時，細菌會將外源基因的一段序列整合到自身CRISPR序列的間隔區；在病毒再次入侵時，CRISPR序列會轉錄生成前體crRNA(pre-crRNA)，pre-crRNA通過加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別后，介導Cas蛋白結合并且對其進行切割，從而保護機體免受病毒的入侵[20,21](圖1)。2013年，在哺乳動物細胞中成功實現了II型Cas9系統進行基因編輯的研究[22]。由于傳統的基因篩選方法(如RNAi)在哺乳動物細胞中進行基因敲除較為困難，因此，Koike-Yusa等[23]于2014年首次將全基因組CRISPR/ Cas9應用于小鼠()胚胎干細胞中，成功鑒定出一些與抗毒素相關的基因。2016年，Komor等[24]發現傳統的CRISPR/Cas9通常需要通過引發雙鏈斷裂(double strand break，DSB)來實現DNA修飾。然而，DSB可能引發細胞的修復機制，并導致不可預測的變異。因此，該團隊開發了一種新方法，稱為堿基編輯器(base editing，BE)，旨在精確修改基因組DNA的單個堿基。具體而言，通過使用Cas9蛋白和特定的單鏈RNA引導子，將化學修飾核苷酸修飾酶(cytidine deaminase)定向到目標堿基上，并將目標堿基從胞嘧啶(C)改變為嘧啶(T)。這項技術為CRISPR/Cas9的發展提供了一個創新性突破。在此基礎上，該團隊又開發了一種名為“Target-AID”的單核苷酸編輯系統，它通過引入特定的修飾酶，能夠直接將一種堿基轉化為另一種堿基。Anzalone等[25]設計了適用于特定目標序列的編輯引導RNA，將Target-AID定向到目標堿基上，再使用Target-AID修飾酶將目標堿基替換為編輯后的堿基。由于傳統的CRISPR/Cas9系統通常需要數個小時完成基因編輯，Liu等[26]提出了一種新策略，即使用籠狀RNA策略(caged RNA，cgRNA)。該策略在RNA序列中添加光敏基團，限制了Cas9酶的功能，直到引入光源。光源激活后，光敏基團解離，使得Cas9酶能夠在幾秒內快速切割目標DNA。這種新方法被稱為超快速CRISPR基因編輯方法(very fast CRISPR，vfCRISPR)。這一研究成果為CRISPR/Cas9領域帶來了變革性的科學進展。目前，科研人員仍在努力研發更為高效且具有更低脫靶率的基因編輯技術(圖2)。

圖1 噬菌體CRISPR/Cas9適應性免疫系統

CRISPR基因序列主要由前導序列(leader)、重復序列(repeat)和間隔序列(spacer)構成。前導序列位于CRISPR基因上游，被認為是CRISPR的啟動子，其富含AT堿基[17]。重復序列的長度約為20～50 bp，包括5～7 bp回文序列[27]，其轉錄產物能夠形成發卡結構，從而穩定RNA的二級結構[20]。間隔序列是由細菌捕獲的外源性DNA序列[15]。目前，在細菌免疫防御中根據Cas蛋白的作用將CRISPR系統分為兩大類，又分為6種不同類型(I～VI)，并且子類型的數目還在持續增長[17]。I類系統包括的I、III和IV型系統的crRNA效應復合物由多個亞基組成，而II類系統包括的II型、V型和VI系統的crRNA效應復合物僅由單亞基組成[28,29]。Cas9蛋白是II類系統所需的唯一蛋白質，Cas9與crRNA-tracrRNA雙鏈體結合，可用于高效的基因組編輯。這種雙RNA結構與Cas9蛋白形成RNP復合體，識別與crRNA互補的PAM序列，將DNA雙鏈解鏈，crRNA將與互補鏈雜交，而另一條DNA鏈則保持游離狀態。之后，Cas9蛋白負責準確切割目標PAM序列，再切割與crRNA互補的DNA單鏈，最終在Cas9的作用下DNA發生DSB，導致切割位點上的小片段序列的插入和/或缺失[30]，此外，它還可以通過機體的同源定向修復機制導致外源DNA的表達沉默，從而實現對病毒的防御[5,11,15,31]。Yu等[32]將CRISPR/Cas9系統成功運用于基因組編輯，借助其在病毒防御中的原理，為基因編輯和研究領域帶來了新的可能性和機遇。主要流程如下：(1)構建相關基因的sgRNA文庫，并將sgRNA整合到慢病毒中，制備慢病毒文庫；(2)使用低感染度感染細胞，使sgRNA整合到細胞基因組中。隨著基因組DNA的復制，sgRNA被復制并傳遞給細胞后代。通過抗生素或其他特定篩選條件，篩選出感染病毒的細胞；(3)根據特定的表型需求，如耐藥性、增殖能力、存活能力和帶有特定標記基因等，選擇適當的細胞；(4)提取細胞核基因組，準備進行下一步的建庫。通過高通量測序對建庫的細胞核基因組進行測序；(5)通過各種生物信息學分析方法，從測序數據中獲取目標基因的相關信息，進一步研究和理解其功能(圖3)。

2 CRISPR/Cas9技術在畜禽遺傳改良中的應用

近年來，基因組編輯技術CRISPR的迅速發展使得該技術在畜禽的多方面應用提供了可能性，通過CRISPR/Cas9技術，畜禽肌肉生長可以得到促進，這使得肉類產量得到提高。綿羊毛和山羊絨的質量也得到改良，使得纖維產品更具商業價值。此外，通過編輯動物基因，牛奶和羊奶的品質可以得到改善，從而提供更健康和高營養價值的乳制品。該技術還有助于提高畜禽的抗病能力，減少疾病對養殖業的影響，進而提高養殖效益。此外，通過增強畜禽的生長和健康狀況，CRISPR/Cas9技術也有助于改善動物福利。

圖2 基因編輯技術發展歷程圖

圖3 CRISPR/Cas9系統工作的主要流程

2.1 在畜禽肌肉生長和發育上的研究進展

肌肉抑制素(myostatin，MSTN)是一種肌肉生長抑制因子，它對肌肉的生長和發育起到負調控的作用?；蛲蛔?、缺失或敲除可以導致肌肉細胞增殖和分化的增加，從而促進肌肉的生長和發育[33]。通過CRISPR/Cas9基因編輯以及優化Cas9:sgRNA (向導RNA)傳遞系統，成功實現了綿羊()的雙等位基因敲除，與野生型(WT)綿羊相比，敲除綿羊具有更大的肌肉質量和肌肉纖維直徑，但其肉質品質和口感等方面未受到影響[34]。同樣，在牛()中也實現將sgRNA和Cas9的合成mRNA體外顯微注射到受精牛胚胎，出生健康犢牛的突變率高達99.9%，表現出雙等位基因突變和雙肌肉表型[35]。在山羊()中也有各項研究表明，抑制基因的表達，可促進雙肌肉表型的形成[36～41]。在豬()的研究中，Li等[42]使用特異性靶向編輯技術，通過設計特定的sgRNA，對兩廣小花豬胚胎中的MSTN信號肽進行基因編輯。編輯后的小豬與未編輯的小豬相比，顯示出明顯增加的肌肉量，同時其發育和健康狀態與未編輯的小豬無明顯差異。在雞()中，使用D10A-Cas9 nickase介導的方法，選擇性地引入DSB，從而生成了基因敲除的雞群，這些敲除突變雞的肌肉生長顯著增加，生長和繁殖均正常[43]。在馬()中，一般會通過編輯基因來增強肌肉生長和改善運動表現[44]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術除對基因進行編輯之外，還在肌原細胞分化蛋白1(myogenic differentiation 1，MYOD1)[45]、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)[46]、胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)[47,48]和抗肌肉生長因子抗體(follistatin，FST)[49]等編碼與肌肉發育或分化相關蛋白的基因功能調控上得到了應用。

過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是調控脂肪細胞分化的關鍵因子，可通過激活脂肪細胞分化調節因子(如FABP4和CCAAT增強子結合蛋白)以及增強和基因的表達來促進脂肪細胞分化，從而調控脂肪沉積。Gu等[50]通過隨機插入和CRISPR/Cas9轉基因克隆程序在兩個豬模型中成功地肌肉特異性過表達了過氧化物酶增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)，該編輯豬肌內脂肪含量顯著增加，瘦肉比例無變化。此外，在肉牛中成功地實現了對基因的位點定向突變的同時進行了位點的定向敲入，突變對生長性狀和肌肉發展產生了顯著的影響[51]，而敲入對這些性狀的影響較小[52]。

2.2 在絨毛生長發育中的研究進展

綿羊和山羊作為重要的畜禽資源，為人類提供了用于生產各種服裝和紡織品的寶貴的纖維來源。成纖維細胞生長因子5 (fibroblast growth factor 5，FGF5)是影響羊毛長度的主要因子。目前，通過CRISPR/Cas9技術成功生成了敲除綿羊。該敲除綿羊所有細胞系都存在基因突變，同時還檢測到5、13和33個堿基對的基因缺失，這些結果導致FGF5蛋白高級結構發生變化，影響其正常功能，從而引起敲除綿羊的羊毛長度明顯長于WT綿羊[53]。另外，Li[54]等和Wang等[55]的研究也確認了這一事實，即CRISPR/Cas9介導的基因缺失不僅導致其活性的喪失，還能促進綿羊毛和山羊絨的生長，從而增加它們的長度和產量。刺鼠信號蛋白(agouti signaling protein，ASIP)是調節皮膚和毛發色素的蛋白，其主要功能是調控皮膚和毛囊中色素產生。Zhang等[56]成功地干擾了中國美利奴羊ASIP的正常功能，導致羊毛的顏色發生了變化，這一突破為產生具有理想羊毛顏色的品種培育提供了機會。

有研究表明，在位點敲入血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，并使用和的組合能夠顯著提高CRISPR/Cas9介導的同源定向修復效率，通過該技術獲得了一只在位點整合了基因的具有突出絨毛性能的絨山羊[57]。此外，通過將胸腺素4 (thymosin β4，Tβ4)基因特異性插入山羊趨化因子受體(chemokine receptor 5，CCR5)基因位點，培育出了高產絨山羊，羊絨產量提高了74.5%[58]，細度和質量不受影響。在雙基因敲除絨山羊模型中，Wang等[59]使用CRISPR/Cas9技術，在受精卵中引入了設計好的特異性靶向RNA和DNA片段。這些靶向RNA和DNA片段與目標基因的特定區域匹配，并促使CRISPR/Cas9系統發生基因編輯作用，成功地敲除了基因和基因，這使得絨山羊的肌肉發育得到顯著改善，并且觀察到了更多的次級毛囊的形成和更長的羊絨纖維，從而提高了絨山羊的商業價值和經濟效益。

2.3 在乳品質改良上的應用進展

人體對牛奶或羊奶過敏主要是由于人體免疫系統對奶中的蛋白質產生異常免疫反應所造成的。β-乳球蛋白(beta-lactoglobulin，BLG)被認為是一種重要的致敏性物質，因此可以通過基因編輯技術對乳品質進行改善?？蒲腥藛T使用CRISPR/Cas9基因編輯技術，通過對牛的基因進行修改來改變牛奶的成分和性質。例如：Alessio等[60]將引入轉座子中，催化合成ω-3和ω-6酸，然后，通過CRISPR/ Cas9技術，實現靶向敲除BLG蛋白，成功地修改了牛的基因，提高了牛奶中的脂肪和蛋白質含量。Silaeva等[61]著重于減少牛奶中引起過敏的成分，在BLG中引入雙鏈gap，從而產生了過敏原含量更低的牛奶。Singina等[62]在牛胚胎成纖維細胞中成功獲得了敲除BLG蛋白和β-乳球蛋白樣蛋白基因細胞集落，未來將被用于生產缺乏BLG蛋白的牛。在山羊上，將Cas9 mRNA和sgRNA共注射到胚胎中生成BLG蛋白敲除山羊，發現在雙鏈sgRNA引導的靶向實驗的編輯效率比單鏈sgRNA低，并且基因以及其他乳蛋白編碼基因在敲除山羊乳腺中的相對表達顯著降低，此外，大部分編輯的胎兒是嵌合體，表明編輯效果可以在多個組織中實現[63]。

山羊奶含有豐富的不飽和脂肪酸，是合成乳脂的必需因子。而硬脂酰輔酶A去飽和酶1 (stearoyl- CoA desaturase 1，SCD1)是催化單不飽和脂肪酸合成的關鍵酶，對乳脂代謝至關重要。Tian等[64]使用CRISPR/Cas9技術在山羊乳腺上皮細胞(goat mam-mary epithelial cells，GMEC)中敲除了SCD1酶，導致三酰甘油、膽固醇含量降低和脂肪酸的去飽和酶指數減少，但對其他乳汁成分沒有影響。通過乳脂質組學分析發現，SCD1敲除降低了三酰甘油和二酰甘油水平，并在甘油脂和甘油磷脂代謝途徑中引起了差異。此外，Tian等[65]還揭示了SCD1通過影響脂質代謝基因表達和脂質代謝途徑來調控山羊乳脂和不飽和脂肪酸的合成。MicroRNA(miRNA)可通過調節脂肪酸代謝途徑中的關鍵基因來調控乳腺細胞的脂肪酸代謝，敲除和后，可以上調靶基因，同時上調并影響脂肪酸代謝關鍵基因的表達。這些作用有助于調節脂滴、甘油三酯和膽固醇的合成，并對C18:0、C18:2以及C20多不飽和脂肪酸的含量產生了影響[66～68]。敲除GMEC中的ASIP蛋白也可以促進中長鏈脂肪酸合成增加，而敲除丙二酰/乙酰轉移酶(malonyl/ acetyltransferase，MAT)降低甘油三酯和中鏈脂肪酸的含量?？傮w而言，這些因子在調節GMEC的脂質代謝中起著關鍵作用，這可能會進一步影響山羊奶中脂質的成分。

2.4 在畜禽抗病力研究中的應用

全球范圍內畜禽傳染病會降低動物生產能力和質量，導致農業經濟巨大損失。宿主可以通過特定的基因編碼的抗微生物肽或蛋白質，直接破壞或抑制病原微生物，或者阻斷病原微生物進入宿主細胞所需的受體。此外，還可以通過干擾病原微生物的生命周期過程，阻礙正常生存和復制，從而降低其對宿主的傷害程度。這兩種策略都是宿主自身的機制來保護自己免受感染。因此，如何從源頭上進行疾病的預防是目前農牧業面臨的關鍵問題[69]。

黑色素瘤分化相關蛋白5 (melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)、線粒體抗病毒信號(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)蛋白和干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)均為細胞對抗病原微生物感染相關的蛋白質，它們在細胞內形成一個信號傳遞網絡，促進免疫反應的激活和病原微生物的清除。雞的先天免疫系統具有兩種主要的病原體識別受體，即Toll樣受體3(toll-like receptor 3，TLR3)和MDA5，通過敲除雞DF-1成纖維細胞中和MDA5蛋白，與WT細胞相比，發現雙敲除細胞中AOAV-1病毒的復制率明顯提高[70]。粘病毒抵抗基因(myxovirus resistance，Mx)被證明具有廣泛的抗病毒和GTP酶活性。為了研究雞對新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染的影響，使用CRISPR/Cas9基因編輯系統構建了敲除基因的DF-1細胞系。發現敲除的細胞中NDV的病毒滴度更高，并促進了一些免疫因子的表達。表明在防止病毒侵入中發揮了重要的作用[71]。此外，敲除基因后，牛乳腺上皮細胞對鳥分枝桿菌副結核病(subsp.，MAP)菌株細胞溶解物的炎癥反應減弱，表現出更低的炎癥因子的產生，這暗示在MAP感染誘導的牛乳腺炎癥反應中發揮重要作用，可能對抗MAP菌株感染具有潛在保護作用[72]。敲除也影響牛乳腺上皮細胞的形態、增殖、遷移和β-酪蛋白分泌，能夠減少乳腺炎的發生[73]。對患有糖原分支酶缺乏癥(glycogen branching enzyme deficiency，GBED)的馬進行基因組篩查，檢測到這些馬在GBE1基因有一個點突變，隨后，使用CRISPR/ Cas9系統來針對這個點突變進行修復，成功地恢復了基因的正常表達和功能，并實現了對GBED馬的治療，這項研究也暗示，CRISPR/Cas9系統是對畜禽遺傳疾病進行研究和治療的有效工具[74]。

豬β-防御素2(porcine beta-defensin 2，PBD-2)是一種重要的天然免疫分子，具有廣譜的抗菌活性和免疫調節功能。研究人員使用CRISPR/Cas9和Cre/loxP系統生成無標記的PBD-2敲入豬的基因座，再通過體細胞核移植產生克隆仔豬，發現PBD-2在轉基因仔豬不同組織中的表達水平顯著高于WT仔豬，并且克隆豬的豬耳成纖維細胞的抗菌特性顯著增加[75]。在一項關于非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)研究中，發現了5種豬干擾素誘導的跨膜蛋白(SwIFITM1a、-1b、-2、-3和-5)敲除增強了ASFV的復制，這表明SwIFITMs對ASFV具有強烈的抗病毒作用[76]。自然抵抗相關巨噬細胞蛋白1 (natural resistance-associated macrophage protein 1，NRAMP1)在抗菌免疫中發揮重要作用。通過使用Cas9剪切酶的單個活性位點，在牛的基因組中插入NRAMP1蛋白，顯著降低離靶效應并提高基因編輯的精確性，獲得了具有強抗結核病的轉基因牛[77]。利用CRISPR/Cas9技術建立組蛋白脫乙酰酶9(histone deacetylases 9，HDAC9)敲除BHK-21細胞，發現在口蹄疫病毒感染后各病毒相關指標均增長，這說明HDAC9在宿主抗病毒先天免疫應答中有至關重要的作用[78]。

馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)是家禽中一種常見的傳染性疾病，對家禽產業造成了嚴重的經濟損失。通過敲除MDV關鍵基因，研究人員成功阻斷了MDV的復制和傳播，從而有效抑制了馬立克病病毒的感染。這項研究為控制馬立克病的傳播和疫苗開發提供了新的思路和方法[79]。在牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)方面，一篇研究探討了黃病毒科瘟病毒屬內不同病毒在宿主細胞中的進入機制。該報道顯示，牛補體調節蛋白46 (complement regulatory protein 46，CD46BOV)在不同病毒中具有不同的作用。CD46BOV作為HoBi樣瘟病毒(HoBi-like pestiviruses，HoBiPeV)的主要細胞進入因子，而不是起源于肯尼亞的長頸鹿瘟病毒(giraffe pestivirus，GPeV)。此外，他們還發現，、、和的病毒分離株能夠通過使用硫酸乙酰肝素進入宿主細胞來適應細胞培養條件。這表明不同的牛瘟病毒使用不同的宿主細胞進入機制[80]。偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是一種嗜神經病毒，可引起豬的神經系統疾病。在PRV進入宿主細胞的過程中，血小板反應蛋白3 (thrombospondin 3，THBS3)起著重要作用。THBS3是一種新的PRV的共受體，可以與PRV的包膜糖蛋白相互作用，啟動PRV進入細胞的過程。通過在不同細胞中敲除或過表達THBS3來驗證其在PRV感染中的作用，結果顯示THBS3通過與PRV的特定蛋白相互作用，促進了病毒與宿主細胞的結合和膜融合[81]。

通過多基因編輯可以使家畜對多種主要病毒具有抗性。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reprodu-ctive and respiratory syndrome virus，PRRSV)和傳染性腸胃炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是兩種對全球養豬產業造成重大經濟損失的高傳染性病毒。對CD163和pAPN進行雙基因敲除的豬，發現DKO豬對PRRSV和TGEV具有完全耐藥性。在肉質和繁殖性能方面，野生型和雙基因敲除豬沒有差異，并且敲除豬對豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)的易感性也降低了[82]。

2.5 在動物福利改善中的研究進展

執行動物福利的必要性是基于人們對動物的道德責任和尊重。動物是有感知和情感的生物，應該受到適當的關愛和保護。隨著現代畜牧業的發展，基因編輯技術可以避免牲畜遭受一些比如犢牛去角、雄性閹割、奶牛去尾、墮胎或剔除不需要的性別等不必要的痛苦[83]。

安格斯牛的1號染色體上P等位基因的變異由212 bp的DNA重復序列組成，取代了無角位點的10 bp序列導致了其自然無角。Hennig等[84]通過CRISPR/Cas9技術采用雙sgRNA刪除了一個包括在無角位點缺失的10 bp的133 bp區域，隨后進行133 bp缺失胚胎的移植，最終獲得了缺失133 bp的雙等位基因胎兒，但均顯示出角芽發育，因此還需進一步研究尋找其他引發無角表型的因素。

通常，為了削除腥臭味，用于豬肉供應的雄性仔豬會進行手術閹割。然而，這可能導致雄性仔豬的感染和身體的痛苦。Flórez等[85]將KiSS-1轉移抑制因子(KiSS-1 metastasis suppressor，KISS1)作為目標，通過使用CRISPR/Cas9技術，在豬的基因組中編輯了基因，成功地導致其功能受損，編輯后的豬表現出下丘腦性性腺功能減退癥(hypogo-nadotropic hypogonadism)的特征，即性腺功能不正常。該研究為提供一種無需進行去勢的方法來控制豬的繁殖特征提供了可能性。

熱應激可能導致動物的脫水、電解質紊亂、增加患病風險等健康問題，還可能導致如減少活動和出現不安行為等行為改變，并且導致如生長速度減緩、產蛋量下降。因此，亟需采取相應的措施解決熱應激對家養動物的影響，從而保障健康、行為和生產能力。催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)和熱休克蛋白(heat shock 70 kDa protein 1-like，HSPA1L)的突變可賦予牛良好的體溫調節和細胞保護能力。通過基因編輯技術將這些特定基因轉移給無法適應高溫氣候的品種，有望減少熱應激對牛類生產的影響[86]。

3 結語與展望

盡管CRISPR/Cas9技術在基因組編輯領域的應用被認為是一項具有巨大潛力的革命性進展，但在學術領域和公眾之間仍存在分歧，這些分歧包括技術應用的安全性和可靠性問題。首先，安全性方面的問題主要涉及到對編輯動物基因組的全面評估。這包括檢查編輯基因對動物本身以及周圍環境的潛在影響，并評估潛在的風險。此外，還需要關注導入基因組的穩定性和遺傳多樣性的維持，以避免不可逆的遺傳塑造和遺傳缺陷。通過全面的安全評估，可以確保編輯動物在健康和繁殖能力方面與非編輯群體一致，并減少任何可能的不良遺傳影響。其次，可靠性方面的問題涉及到技術本身的精確性和效率。CRISPR/Cas9技術在基因編輯方面具有準確性和高效性的優點，但仍需繼續改進。除此之外，也需要集中精力解決編輯技術中的潛在誤差和副作用，以提高技術的可靠性和預測性。CRISPR/Cas9技術在基因編輯畜禽動物中未來發展的重要方向為進一步研究基因功能和基因網絡的理解，以及CRISPR/ Cas9與其他基因編輯技術的結合。這些方向將有助于進一步拓寬畜禽遺傳改良的可能性?？傮w而言，隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術的不斷發展和改進，相信它將在畜牧業遺傳改良中發揮越來越重要的作用，并為提高畜禽生產效率和質量做出貢獻。

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Progress on CRISPR/Cas9 system in the genetic improvement of livestock and poultry

Yanchun Bao1,2, Lingli Dai2,3, Zaixia Liu1,2, Fengying Ma1,2, Yu Wang4, Yongbin Liu5, Mingjuan Gu1,2, Risu Na1,2, Wenguang Zhang1,2,6

CRISPR/Cas9 gene editing technology, as a highly efficient genome editing method, has been extensively employed in the realm of animal husbandry for genetic improvement. With its remarkable efficiency and precision, this technology has revolutionized the field of animal husbandry. Currently, CRISPR/Cas9-based gene knockout, gene knock-in and gene modification techniques are widely employed to achieve precise enhancements in crucial production traits of livestock and poultry species. In this review, we summarize the operational principle and development history of CRISPR/Cas9 technology. Additionally, we highlight the research advancements utilizing this technology in muscle growth and development, fiber growth, milk quality composition, disease resistance breeding, and animal welfare within the livestock and poultry sectors. Our aim is to provide a more comprehensive understanding of the application of CRISPR/Cas9 technology in gene editing for livestock and poultry.

CRISPR/Cas9; gene editing; livestock and poultry; genetic improvement;economic traits

2024-01-17;

2024-02-25;

2024-02-29

內蒙古自治區自然科學基金項目(編號：2021ZD05)，內蒙古自治區科技計劃項目(編號：2021GG0008)，內蒙古自治區科技重大專項項目(編號：2021ZD0009)，內蒙古農業大學動物科學學院高水平成果培育專項(編號：BZX202201)和內蒙古自治區直屬高?；究蒲袠I務費(編號：BR221024)資助[Supported by the Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region (No. 2021ZD05), the Science and Technology Plan Project of Inner Mongolia Autonomous Region (No. 2021GG0008), the Major Science and Technology Project of Inner Mongolia Autonomous Region (No. 2021ZD0009), the High Level Achievement Cultivation Project of College of Animal Science of Inner Mongolia Agricultural University (No. BZX202201) and the Basic Research Expenses of Universities Directly of Inner Mongolia Autonomous Region (No. BR221024)]

鮑艷春，博士研究生，專業方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: byc107054@163.com

谷明娟，博士，講師，研究方向：肉牛分子育種。E-mail: gmj0119@yeah.net

娜日蘇，博士，副教授，研究方向：牛羊遺傳育種與繁殖。E-mail: narisu@swu.edu.cn

張文廣，博士，教授，研究方向：數量基因組學與生物信息學。E-mail: actgnmbi@aliyun.com

10.16288/j.yczz.24-021

(責任編委: 姜雨)