長時間鎂脅迫對芹菜葉綠素熒光特性與抗氧化能力的影響

虎麗霞,張 婧,高彥強,毛爾曄,韓康寧,楊 滟,頡建明

(甘肅農業大學 園藝學院,甘肅 蘭州 730070)

芹菜(ApiumgraveolensL.)是傘形花科二年生草本植物,富含維生素、揮發油、糖類等營養物質和多種酚類物質,其酚類物質主要包括黃酮類、酚酸類物質,具有很強的抗氧化作用[1-3]。隨著生產中氮、磷、鉀化肥的大量施用,植物中其他元素的缺乏現象日趨嚴重;過量施用鉀肥影響芹菜對鈣、鎂的吸收,造成缺鎂,導致芹菜葉脈黃化,嚴重降低芹菜品質和產量[4]。鎂是植物生長必需的中量元素,是植物體內多種酶的活化劑,是葉綠素分子中唯一的金屬元素,對植物光合作用有重要影響。鎂還影響植物碳氮代謝、抗氧化系統等[5-7],并且在提高作物產量和改善品質等方面也發揮著重要作用[8]。陳偉立等[9]研究表明,砂糖橘植株缺鎂會導致葉片葉綠素含量降低,過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)含量增加,過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性提高。林麗琳[10]通過研究鎂對不同基因型西瓜若干生理生化代謝指標的影響發現,缺鎂、低鎂、高鎂脅迫導致西瓜葉片各生長期的諸多生理指標均降低,顯著影響西瓜植株的正常生長。王紀忠等[11]的研究表明,隨著缺鎂脅迫癥狀加重,草莓幼苗的生物量、葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)和POD活性均降低,相對電導率、MDA含量增加,嚴重影響了草莓植株的正常生長。生產中常采用葉面噴施質量分數0.5%或1.0%硫酸鎂水溶液的方法緩解缺鎂脅迫,但過量施用鎂肥會降低植物生物量、葉綠素含量和光合作用[8,12]。目前,鎂脅迫對植物生長影響的研究主要集中在小白菜[5]、西瓜[6]、砂糖橘[9]、草莓[11]、黃瓜[12-13]等作物上,鮮有芹菜中鎂脅迫的相關報道。本試驗研究鎂缺乏和鎂過量脅迫對芹菜葉片光合能力和抗氧化能力的影響,為鎂元素的平衡施用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以美國西芹為試驗材料,在甘肅省蘭州市甘肅農業大學園藝學院現代溫室進行。

1.2 試驗設計

以MgSO4·7H2O為鎂源,根據前期鎂濃度篩選試驗結果,以日本山崎全營養液處理為對照(CK,1.0 mmol·L-1Mg2+),設鎂缺乏(0、0.5 mmol·L-1)和鎂過量(2.5 mmol·L-1)處理。其他元素營養液濃度為Ca(NO3)2·4H2O 236 mg·L-1、KNO3708 mg·L-1、NH4H2PO4192 mg·L-1、EDTA-NaFe 30 mg·L-1、H3BO32.86 mg·L-1、MnSO4·4H2O 2.13 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.08 mg·L-1、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02 mg·L-1。待芹菜幼苗長至四葉一心時,將其移栽定植于水培箱(長37 cm、寬25 cm、高20 cm)中,每箱11株幼苗,每個處理4箱,每5 d更換1次營養液,pH值6.5±0.05,水溫18～20 ℃,自然光照條件下培養。于2022年5月3日定植,用自來水緩沖適應3 d,于5月7日開始鎂脅迫處理,7月13日收獲,處理時間為65 d。葉綠素含量和葉綠素熒光參數在取樣當天測定,其余指標在取樣后測定。鎂脅迫處理65 d芹菜葉片表型見圖1。

圖1 鎂脅迫處理65 d的芹菜葉片生長形態Fig.1 Growth morphology of celery leaves treated under magnesium stress for 65 days

1.3 指標測定

1.3.1 葉綠素含量、葉綠素熒光參數測定

葉綠素含量的測定參照李靜[14]的方法。葉綠素熒光參數測定參照胡琳莉[15]的方法,使用調制葉綠素熒光成像儀IMAGIN-PAM(Heinz WaItz, Germany)測定芹菜葉片葉綠素熒光參數,每個處理隨機選取3株,暗適應30 min后,剪下第2片功能葉,測定相關指標。設定檢測光0.1 μmol·m-2·s-1、光化光81 μmol·m-2·s-1、飽和脈沖光2 700 μmol·m-2·s-1,脈沖光時間0.8 s,間隔20 s。非光化學猝滅(qN)的計算方法參照文獻[16],光化學猝滅(qL)的計算方法參照文獻[17],光合電子傳遞速率(ETR)的計算方法參照文獻[18]。

1.3.2 快速葉綠素熒光誘導動力學參數測定

利用植物效率分析儀Handy PEA(Hansatech,UK)測定芹菜葉片OJIP曲線并計算相關參數,包括I點相對可變熒光(Vi)、J點相對可變熒光(Vj)、電子受體還原能量(Sm)、以吸收光能為基礎的性能指數(PI abs)、初級PSⅡ光化學的最大量子產率(φPo)、從QA到QB的電子傳輸通量的量子產率(φEo);每光子吸收的PSⅡ最終電子受體還原的量子產率(φRo)、QA還原率(dV/dto)、單位反應中心(RC)吸收光能(ABS/RC)、RC耗散能量(DIo/RC)、RC最大捕獲還原QA的能量(TRo/RC)、RC電子傳遞能量(ETo/RC)、單位面積(CSm)吸收的光能(ABS/CSm)、CSm熱耗散能量(DIo/CSm)、CSm吸收俘獲能量(TRo/CSm)、CSm電子傳遞通量(ETo/CSm)。參照李鵬民等[19]和Stirbet[20]的方法對OJIP曲線進行JIP-test分析。

1.3.3 總酚、類黃酮含量與酚類代謝關鍵酶活性測定

總酚和類黃酮含量的測定采用鹽酸-甲醇提取法[21],苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定參照王學奎[22]和Liu等[23]的方法,肉桂酸羥化酶(C4H)活性和4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)活性的測定參照范存斐等[24]的方法,多酚氧化酶(PPO)活性的測定參照高云[25]的方法。

1.3.4 MDA、脯氨酸、H2O2、超氧陰離子含量與抗氧化酶活性測定

MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[22];脯氨酸(Pro)和H2O2含量,以及SOD、POD和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定參照陳剛等[26]的方法;超氧陰離子含量和CAT活性的測定參照高俊鳳[27]的方法;H2O2和超氧陰離子組織化學染色參照Ma等[28]的方法。

1.4 數據分析

使用Microsoft Excel 2019軟件統計數據,使用SPSS 20.0軟件進行差異顯著性分析,使用Origin 2021軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 鎂脅迫對芹菜葉片葉綠素含量和葉綠素熒光參數的影響

2.1.1 葉綠素含量

由圖2可知,鎂缺乏和鎂過量脅迫明顯降低了芹菜葉片的葉綠素含量。與CK相比,芹菜葉片的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素(a+b)含量在0、0.5和2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理時均顯著下降,葉綠素a含量分別降低24.84%、12.81%、24.99%,葉綠素b含量分別降低38.86%、28.40%、70.28%,葉綠素(a+b)含量分別降低28.38%、16.75%、36.44%。

Chla、Chlb、Chl(a+b)分別為葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b。柱狀圖上無相同小寫字母的表示各處理間差異顯著(P<0.05)。Chla, Chlb and Chl (a+b) are chlorophyll a, chlorophyll b and chlorophyll (a+b), respectively. Different lowercase letters above the bars represent significant differences (P<0.05) among treatments.

2.1.2 葉綠素熒光參數

鎂脅迫對芹菜葉片葉綠素熒光特性有顯著影影響,與CK相比,0、0.5、2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理時,Fv/Fm、qP、qL和ETR均顯著下降,Fv/Fm分別降低4.39%、3.32%、3.06%,qP分別降低7.61%、5.54%、5.22%,qL分別降低21.33%、14.43%、10.48%,ETR分別降低29.00%、11.92%、25.74%。和CK相比,2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理的實際光化學產量Y(Ⅱ)顯著降低,下降17.80%;qN顯著升高,上升46.91%(表1)。

表1 鎂脅迫下芹菜葉片的葉綠素熒光參數

2.1.3 葉綠素熒光動力學曲線和JIP-test參數

快速葉綠素熒光誘導動力學曲線可以反映植物PSⅡ的原初光化學反應和光合機構電子傳遞狀態等過程的變化。圖3表明,與CK相比,鎂缺乏(0、0.5 mmol·L-1)和鎂過量(2.5 mmol·L-1)時芹菜葉片OJIP曲線發生明顯的變形,其中I相和P相大幅下降。

圖3 鎂脅迫下芹菜葉片的葉綠素熒光動力學曲線Fig.3 Chlorophyll fluorescence kinetics curve of celery leaves under magnesium stress

表2顯示,鎂缺乏(0 mmol·L-1)處理的芹菜葉片Vi較CK提高4.39%,φRo降低27.43%;鎂過量(2.5 mmol·L-1)處理的芹菜葉片Vj較CK提高11.60%,PI abs、φEo分別降低25.25%、16.88%,差異均達到顯著水平。鎂缺乏和鎂過量脅迫對其他參數無顯著影響。

表2 鎂脅迫下芹菜葉片的JIP-test參數

2.1.4 PSⅡ單個反應活性中心能量分配和單位截面積能量分配

從表3可知,與CK相比,0、0.5、2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理的ABS/RC、ABS/CSm均顯著下降,DIo/RC、DIo/CSm均顯著升高,ABS/RC分別降低3.67%、4.26%、3.63%,ABS/CSm分別降低6.79%、5.63%、6.97%,DIo/RC分別提高10.50%、9.04%、11.08%,DIo/CSm分別提高11.65%、4.24%、14.83%。

表3 鎂脅迫下芹菜葉片PSⅡ的單個反應活性中心能量分配和單位截面積能量分配

2.2 鎂脅迫對芹菜酚類物質和代謝關鍵酶活性的影響

2.2.1 總酚與類黃酮含量

由圖4可知,鎂缺乏(0 mmol·L-1MgSO4·7H2O)處理下,芹菜葉柄總酚含量、葉片和葉柄的類黃酮含量明顯降低,較CK分別下降61.33%、14.57%、34.60%;鎂過量(2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O)處理下芹菜葉片和葉柄的總酚含量、葉柄類黃酮含量明顯降低,較CK分別下降16.00%、18.60%、33.91%,葉片類黃酮含量較CK提高164.70%,差異均達到顯著水平。葉片總酚、類黃酮含量整體高于葉柄。

數據以鮮重計。柱狀圖上無相同小寫字母的表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Data was detected based on fresh weight. Different lowercase letters above the bars represent significant differences (P<0.05) among treatments. The same as below.

2.2.2 酚類代謝關鍵酶活性

由圖5可見,鎂脅迫對酚類代謝關鍵酶活性有顯著影響。0、0.5、2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理時芹菜葉片和葉柄的PPO活性較CK均顯著下降,葉片PPO活性分別降低54.35%、14.44%、50.32%,葉柄PPO活性分別降低74.78%、67.11%、42.34%。與CK相比,鎂過量(2.5 mmol·L-1)處理時芹菜葉片的PAL活性顯著升高,提高16.06%。鎂缺乏(0 mmol·L-1)和鎂過量(2.5 mmol·L-1)處理時芹菜葉片C4H活性均顯著高于CK,分別提高19.34%和24.09%。4CL活性的變化趨勢與PAL活性相似。

圖5 鎂脅迫下芹菜中酚類代謝關鍵酶的活性Fig.5 Key enzymes activities of phenolic metabolism in celery under magnesium stress

2.3 鎂脅迫對芹菜抗氧化系統的影響

2.3.1 MDA與Pro含量

與CK相比,鎂缺乏和鎂過量處理的芹菜葉片、葉柄的MDA和Pro含量均顯著增加,變化趨勢相同(圖6)。0、0.5、2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理的葉片MDA含量較CK分別增加15.36%、6.65%、13.87%,葉柄中MDA含量分別增加146.91%、31.84%、217.70%。0、0.5、2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理的葉片Pro含量較CK分別增加53.18%、27.74%、28.32%,葉柄中Pro含量分別增加73.71%、28.21%、81.00%。葉片MDA、Pro含量整體高于葉柄。

圖6 鎂脅迫下芹菜的丙二醛與脯氨酸含量Fig.6 Contents of malondialdehyde and proline in celery under magnesium stress

2.3.2 超氧陰離子含量

由圖7-A可知,鎂缺乏(0 mmol·L-1)處理時芹菜葉片的超氧陰離子含量顯著低于CK,下降13.00%,鎂過量(2.5 mmol·L-1)處理時超氧陰離子含量顯著高于CK,升高8.75%;0、0.5、2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理時芹菜葉柄的超氧陰離子含量均顯著高于CK,分別提高30.86%、30.52%、73.49%。圖7-B所示為芹菜葉片超氧陰離子含量的染色鑒定結果,0 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理的葉片染色最淺,2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理的葉片染色最深。

圖7 鎂脅迫下芹菜的超氧陰離子含量Fig.7 Superoxide anion content in celery under magnesium stress

2.3.3 H2O2含量

與CK相比,鎂缺乏(0、0.5 mmol·L-1)和鎂過量(2.5 mmol·L-1)時芹菜葉片的H2O2含量均顯著增加,分別提高42.40%、31.13%、74.96%;2.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O處理的葉柄H2O2含量較CK顯著增加,提高87.38%(圖8-A)。H2O2含量染色結果顯示,鎂缺乏和鎂過量處理的芹菜葉片染色均有所加深(圖8-B)。

圖8 鎂脅迫下芹菜的過氧化氫含量Fig.8 Hydrogen peroxide content in celery under magnesium stress

2.3.4 抗氧化酶活性

由圖9可知:與CK相比,鎂缺乏(0、0.5 mmol·L-1)和鎂過量(2.5 mmol·L-1)時芹菜葉片、葉柄的SOD活性均顯著下降,葉片中SOD活性分別降低24.22%、11.80%、22.33%,葉柄中SOD活性分別降低33.40%、27.95%、47.96%;與CK相比,鎂缺乏(0、0.5 mmol·L-1)處理的芹菜葉片POD活性均顯著升高,分別提高22.54%、32.75%;CAT和APX活性的變化趨勢與SOD活性相似。

圖9 鎂脅迫下芹菜的抗氧化酶活性Fig.9 Antioxidant enzyme activities of celery under magnesium stress

3 討論

3.1 鎂脅迫對芹菜葉綠素熒光特性的影響

鎂是植物葉綠體的中心原子,其含量高低直接影響葉綠體光能轉換與利用[29]。葉綠素主要分布在葉綠體類囊體薄膜上,其結構與形態的異常則直接影響作物葉片PSⅠ和PSⅡ的功能[30]。凌麗俐等[8]研究表明,鎂缺乏脅迫時紐荷爾臍橙葉片葉綠素含量顯著降低,鎂過量脅迫對減緩老葉葉綠素含量下降具有顯著效果。謝小玉等[12]通過研究鎂對溫室黃瓜光合特性的影響發現,缺鎂脅迫的黃瓜葉片葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素含量均極顯著降低,多鎂脅迫則增加了黃瓜葉片葉綠素a、葉綠素b含量,降低了胡蘿卜素含量。田斌等[31]研究表明,鎂缺乏和鎂過量脅迫均使大麥葉片葉綠素含量降低。本研究表明,鎂缺乏和鎂過量脅迫時芹菜葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)含量均顯著降低,可能是活性氧傷害抑制葉綠素和蛋白質的合成,降低葉綠素含量,抑制光合作用。

鎂脅迫影響植株葉綠素合成,從而影響光合作用。鎂缺乏脅迫下龍眼幼苗葉片光合色素、Fv/Fm均下降,光補償點和CO2補償點提高,光飽和點和CO2飽和點下降,PSⅡ活性下降[32]。鎂缺乏脅迫使紅葉石楠葉片光能轉換、電子傳遞效率和PSⅡ活性降低,使其用于光化學的能量更低[29]。鎂缺乏和鎂過量脅迫的紐荷爾臍橙不同葉齡光化學效率Fv/Fm、相對電子傳遞速率均顯著降低[8]。本研究結果表明,鎂缺乏和鎂過量脅迫時芹菜葉片Fv/Fm、qP、qL、ETR均顯著下降,鎂過量脅迫的Y(Ⅱ)顯著下降,qN顯著升高,說明鎂過量脅迫對芹菜葉綠素熒光參數的影響顯著大于鎂缺乏脅迫。這與前人的研究結果相似,表明在鎂脅迫下,葉綠素吸收的光能用于光合作用的部分減少,以熒光形式散發的能量的增加,光合效率下降[29]。

葉綠素熒光誘導動力曲線包括PSⅡ性能指數、比活性、PSⅡ供體側和受體側狀態等多項參數,可作為檢測植株受脅迫程度的指標[33]。OJIP曲線可反映PSⅡ光合電子傳遞過程[34]。Vj升高,表明QA向QB的電子傳遞受阻[35]。φEo可反映植株葉片將所捕獲的激發能轉化為電子并繼續傳遞的效率高低[36]。本研究結果表明,與CK相比,鎂缺乏和鎂過量脅迫均導致芹菜葉片OJIP曲線發生明顯變形,Vj顯著升高,表明鎂脅迫明顯阻礙了芹菜葉片QA向QB的電子傳遞效率,降低了能量傳遞效率。本研究進一步比較了鎂脅迫下芹菜葉片PSⅡ單個反應活性中心能量分配和單位截面積能量分配變化,結果顯示,鎂缺乏和鎂過量脅迫時ABS/RC、ABS/CSm均顯著下降,DIo/RC、DIo/CSm均顯著升高,表明鎂脅迫增加了芹菜葉片活性中心對光能的耗散,抑制了芹菜單位截面PSⅡ反應中心的活性,減少其捕獲吸收與電子傳遞的能量,增加了能量耗散,葉片發生了光抑制,導致其葉片光能利用率降低。這與尤垂淮等[6]的研究結果相同。

3.2 鎂脅迫對芹菜酚類物質和代謝關鍵酶活性的影響

芹菜含有大量的酚類物質,在抗氧化、降血壓、抗心血管疾病等方面具有重要的作用[1-2]。本研究結果表明,與CK相比,鎂缺乏脅迫時芹菜葉柄總酚含量、葉片和葉柄類黃酮含量均顯著降低,鎂過量脅迫時芹菜葉片類黃酮含量顯著升高。芹菜葉片中的總酚和類黃酮含量整體高于葉柄。PAL是酚類物質合成的關鍵酶[37],PPO是酚酸類物質氧化的關鍵酶[38]。鎂過量處理時芹菜葉片PAL活性提高,有利于合成酚類物質[39];鎂缺乏和鎂過量脅迫的PPO活性均顯著下降,說明芹菜酚酸類物質的合成減少。C4H是植物組織中具有較高活性的酶,是黃酮類物質合成的關鍵酶[39]。4CL可作為類黃酮代謝的前體物質參與其中,也可參與苯丙烷類代謝生成酚酸類物質[40]。本研究結果表明,鎂過量脅迫時芹菜葉片的C4H和4CL活性均顯著升高,有利于芹菜葉片多酚類物質合成,驗證了鎂過量處理時芹菜葉片類黃酮含量高的結果,說明鎂過量可明顯增加芹菜葉片中的類黃酮含量。

3.3 鎂脅迫對芹菜抗氧化系統的影響

Pro是植物抵御逆境脅迫的重要指標,對提高植物抗性具有重要意義[41]。MDA是植物膜脂過氧化的最終產物,反映了生物膜受傷害的程度[42]。已有研究表明,鎂缺乏和鎂過量均會導致西瓜葉片Pro和MDA含量明顯增加[6]。本研究結果表明,鎂缺乏和鎂過量脅迫均會導致芹菜葉片、葉柄的MDA和Pro含量顯著增加,說明鎂脅迫增強了芹菜細胞膜質過氧化程度和耐受性。李延等[43]通過研究缺鎂脅迫對龍眼葉片衰老的影響發現,在鎂缺乏脅迫下,龍眼葉片O2·-的凈產生速率提高,H2O2含量增加。謝小玉等[44]的研究表明,在鎂脅迫下黃瓜幼苗葉片的MDA、H2O2含量和O2·-產生速率升高,鎂缺乏脅迫的升幅大于鎂過量脅迫。本研究結果表明,與CK相比,鎂缺乏(0 mmol·L-1)脅迫時芹菜葉片的超氧陰離子含量顯著降低,鎂過量脅迫時芹菜葉片、葉柄的超氧陰離子和H2O2含量均顯著增加。SOD、POD、CAT和APX等是植物體內重要的抗氧化酶和細胞保護酶系統[45],在植物體內活性氧清除系統中起關鍵作用[46]。本研究結果表明,鎂缺乏(0、0.5 mmol·L-1)脅迫時芹菜葉片的POD活性顯著高于CK,可能是因為芹菜葉片細胞內的超氧陰離子較少,增強了POD的歧化能力[42],驗證了鎂缺乏脅迫下芹菜葉片超氧陰離子含量低的結果。已有研究表明,鎂脅迫導致植物葉片抗氧化酶活性顯著降低[6,44,47]。本研究結果與前人研究相似,鎂缺乏和鎂過量脅迫時芹菜葉片和葉柄的SOD、CAT和APX活性顯著降低。說明鎂缺乏和鎂過量脅迫導致抗氧化酶活性降低,清除活性氧的能力降低,從而導致芹菜MDA、Pro和H2O2含量增加,影響芹菜的正常生長。

4 結論

在鎂缺乏和鎂過量條件下,芹菜葉片葉綠素含量均降低,光抑制程度增加,PSⅡ的光合電子傳遞受阻,抑制了PSⅡ的活性;鎂缺乏導致芹菜葉片POD活性提高,超氧陰離子含量降低;鎂過量導致芹菜葉片的PAL、C4H、4CL活性提高,類黃酮含量增加;鎂缺乏和鎂過量脅迫均導致芹菜葉片和葉柄SOD、CAT、APX活性降低,MDA、Pro和H2O2含量增加。鎂過量脅迫對芹菜葉片葉綠素熒光、酚類物質含量、代謝關鍵酶活性和抗氧化能力的不利影響顯著大于鎂缺乏脅迫。生產中應避免因補施鎂肥造成的鎂過量脅迫。