花椒流膠病拮抗菌的分離鑒定及其生防機制

趙吉桃,何 靜,*,丁德東,李彥湘,候彩霞,趙 倩

(甘肅農業大學 a,林學院;b,甘肅省枸杞無害化栽培工程研究中心,甘肅 蘭州 730070)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)屬蕓香科花椒屬落葉小喬木,主要分布于中國甘肅、四川、浙江等地,是我國重要的經濟林樹種之一[1]?；ń凡粌H是重要的調味佐料,還是一種常用的中草藥[2],因其具有收益早、用途廣、價值高與適應性強等特點,常用作我國一些地區的主要經濟樹種、抗旱樹種與水土保持樹種[3]。目前,隨著農林業種植面積的不斷擴大,花椒病害的發生愈發嚴重,其中花椒流膠病是發病最為嚴重的病害,已成為傳播性廣的系統病害[4]。三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)是花椒流膠病的主要病原菌之一[5],由該病原菌引發的流膠病日趨嚴重,已成為制約花椒產業發展的關鍵因素。

目前,花椒流膠病的防治主要集中在農業防治和化學防治[6]。椒農常采用清理椒園、合理修剪等農業措施,以及使用多菌靈、啶氧菌酯等殺菌劑進行化學防治,但化學藥劑的大量使用會使植株產生一定的耐藥性并對椒樹周圍環境造成極大危害。因此,亟待開辟安全、環保的有效途徑用于花椒流膠病的防治。目前,生物防治是一種綠色新穎的防治方法,具有環保、危害性小等諸多優點[7-8],其中以內生真菌作為生防菌株防治植物病害的“以菌治菌”防治手段備受人們青睞。植物內生真菌通常存在于健康植株的各種組織和器官中,且不會引起植株的病害。內生真菌與植物通過“協同進化”作用[9-11],可產生與宿主植物相同或相似的次級代謝產物[12-14],這些物質具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等作用,且能促進植物的生長發育或增強植物抗病害能力[15-17]。如李磊等[18]研究發現,內生生防菌解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensHt-q6能夠有效控制番茄葉霉病和灰霉病的發生;韓忠明等[19]研究發現,拮抗菌株桃色頂孢霉AcremoniumpersicinumMR-47對防風根腐病病原菌木賊鐮刀菌Fusariumequiseti有良好的防治效果。目前,生防菌在花椒流膠病防治方面的相關研究與應用還鮮有報道。

本試驗以三線鐮刀菌為靶標菌,通過研究花椒內生真菌的抗真菌活性,篩選出具有較強拮抗效果的菌株,為花椒流膠病的生物防治提供一定的理論參考借鑒,該研究結果對補充或開發新型植物病害防治藥劑具有重要的科學意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植株

3年生大紅袍花椒植株,由甘肅農業大學林學院經濟林實驗地提供。

1.1.2 供試菌種

花椒流膠病病原真菌:三線鐮刀菌,用于拮抗真菌篩選。4種供試病原真菌:尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)、交鏈格孢菌(Alternariaalternata)、細極鏈格孢菌(Alternariatenuissima),用于拮抗真菌抑菌譜測定。以上真菌均保存于甘肅農業大學林學院森林保護實驗室,經活化后備用。

1.1.3 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基:200 g馬鈴薯,20 g瓊脂,20 g葡萄糖,1 000 mL蒸餾水;馬鈴薯葡萄糖液體(PDB)培養基:200 g馬鈴薯,20 g葡萄糖,1 000 mL蒸餾水。

1.1.4 主要試劑

22.5%啶氧菌酯懸浮劑(上?？频先A農業科技有限公司);DNA提取試劑盒Universal Genomic DNA Extraction Kit(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 內生真菌的分離純化

采用組織分離法[20],取新鮮健康的花椒植株的根、莖、葉和刺,用流水沖洗干凈,自然晾干。在無菌環境中,將根、莖、葉和刺分別切成約0.5 cm×0.5 cm的小塊,置于質量濃度0.1%的HgCl2溶液中浸泡1 min,用無菌水漂洗3～5次,再用體積分數75%的乙醇溶液浸泡1 min,然后用無菌水漂洗3～5次;在無菌環境中,將消毒后的材料放于無菌濾紙上晾干;然后將植物材料的組織切口處放置于含有0.1%鏈霉素的PDA平板中培養,每個培養皿放置4塊植物組織,設置6個重復。將植物組織消毒后最后一遍沖洗的無菌水洗滌液涂在PDA培養基上作為對照,25 ℃培養2 d后無菌落長出,表明消毒徹底。將樣品25 ℃培養至出現菌落,從菌落邊緣挑取菌絲分別接種于PDA平板,經反復純化得到單一菌株,4 ℃保存。

1.3 拮抗菌株的篩選

在PDA平板兩側分別接入供試病原菌菌餅(直徑6 mm)和花椒內生真菌菌餅(直徑6 mm)作平板對峙試驗,兩菌餅相距5 cm,以不接內生真菌作空白對照。每試驗3次重復,置25 ℃恒溫培養箱中培養7 d后,測量并記錄病原真菌菌落的徑向生長直徑,計算抑制率[21]。

r=(dCK-dt)/(dCK-d)。

(1)

式(1)中:r表示抑制率;dCK表示對照菌落直徑;dt表示處理菌落直徑;d表示菌餅直徑。

1.4 花椒內生真菌的鑒定

將分離得到的菌種接種至PDA固體培養基上培養,25 ℃培養5～7 d。培養期間,記錄菌落的生長周期、顏色與菌落形態等特征,并對菌絲、孢子和產孢結構等進行顯微觀察。根據形態觀察結果,查閱《真菌鑒定手冊》[22]與相關文獻進行初步鑒定。

將長滿培養皿的菌落用蒸餾水沖洗,移至研缽充分研磨,采用DNA提取試劑盒提取DNA,用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[23]進行PCR擴增。反應體系:5×FastPfu Buffer 10 μL,2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL,上下游引物(5 μmol·L-1)各1 μL,FastPfu Polymerase 0.5 μL,DNA模板10 ng,超純水補充至50 μL。擴增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35循環;72 ℃ 10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并委托阿趣生物公司進行基因測序,測序結果用BLAST進行同源性比對,通過MEGA 7.0軟件中的NJ法構建系統發育樹。

1.5 抑菌譜的測定

將4種供試病原菌與內生真菌HJ-18分別做平板對峙試驗,兩菌餅相距5 cm,以不接內生真菌作空白對照,3次重復,置25 ℃恒溫培養箱中培養7 d后,測量并記錄病原真菌菌落的徑向生長直徑,計算抑制率。計算公式同式(1)。

1.6 菌株培養濾液的制備

將PDB培養基分別裝于150 mL錐形瓶(每瓶75 mL)中高溫滅菌30 min。待冷卻后,向每個錐形瓶中分別加入1 mL菌株HJ-18孢子懸浮液(1×106CFU·mL-1),置于25 ℃、轉速為160 r·min-1的恒溫搖床中培養7 d,將培養液于4 ℃、5 595×g條件下離心10 min,取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾3次,得到培養濾液。

1.7 培養濾液穩定性測定

1.7.1 自然光穩定性

將菌株HJ-18培養濾液置于4 000 lx的培養箱中,濾液距光源20 cm,分別照射2、4、6、8、10、12 h,以未經照射的培養濾液為對照,以未經處理的等量無菌水為空白對照,置于25 ℃恒溫培養7 d。每組3次重復。相對抑制率計算方法如下:

rR=(dCK-dt)/(dCK-dn)。

(2)

式(2)中:rR表示相對抑制率;dCK表示空白對照菌落直徑;dt表示處理菌落直徑;dn表示未處理菌落直徑。

1.7.2 紫外光穩定性

將菌株HJ-18培養濾液置于距30 W紫外燈20 cm處,分別照射30、60、90、120、150 min,測定培養濾液的相對抑制率,方法同1.7.1節。

1.7.3 熱穩定性

將菌株HJ-18培養濾液分別置于20、40、60、80、100 ℃水浴30 min后恢復室溫,測定培養濾液的相對抑制率,方法同1.7.1節。

1.7.4 酸堿穩定性

用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH溶液分別將菌株HJ-18培養濾液pH值調至2、4、6、8、10、12,靜置后調至自然pH值(6.5),測定培養濾液的相對抑制率,方法同1.7.1節。

1.8 菌株HJ-18培養濾液對三線鐮刀菌菌絲生長的影響

菌株HJ-18培養濾液對三線鐮刀菌菌絲生長的抑制率。將1.6節制得的培養濾液按照10%、20%、30%、40%、50%的體積分數加入25 mL PDA培養基中,制成含藥平板,以等量PDA培養基為對照,每組3次重復。將三線鐮刀菌菌餅接入平板中央,7 d后觀察并記錄菌落生長直徑,并計算抑制率。

菌株HJ-18培養濾液對三線鐮刀菌菌絲生長影響的顯微結構觀察。參考許樂等[24]的方法,略作修改,進行樣品的處理,挑取菌株HJ-18培養濾液處理的三線鐮刀菌菌絲體,經過戊二醛固定12 h,然后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS,pH值7.4)處理,再用OSO4固定5 h;依次經45%(體積分數,下同)、55%乙醇溶液梯度脫水處理1 h,用70%乙醇處理過夜;再依次用85%、95%、100%乙醇分別處理30 min;用醋酸異戊酯處理1 h,在CO2臨界點干燥、鍍金,于掃描電子顯微鏡下觀察菌絲形態變化。以未經培養濾液處理的菌絲為對照。

1.9 盆栽試驗

選用生長狀況大致相同的1年生健康花椒幼苗,每盆1株。采用接種針和注射器,每枝注射10 mL三線鐮刀菌孢子懸浮液(1.0×106CFU·mL-1),發病后將培養7 d的培養液噴施在枝干表面,第0、30天各處理1次,每盆每次噴施200 mL,以等量無菌水為對照,以22.5%啶氧菌酯處理為陽性對照。試驗共設5個處理,每個處理10盆,重復3次,分別為:(1)只接種病原菌;(2)病原菌接種后噴施培養液;(3)病原菌接種后噴施無菌水;(4)病原菌接種后噴施22.5%啶氧菌酯100倍液50 mL;(5)培養液處理后再接種病原菌。試驗期間進行正常水肥管理,于處理后每隔15 d調查發病情況,第60 d統計發病率,用病情指數計算相對防效。分級標準[25]:0級,全株正常,無流膠點,無病斑;1級,有散生流膠點,只滲出琥珀色膠體;2級,有流膠點,病斑部位變黑,直徑≤2 mm;3級,有散生流膠點,病斑部位變黑,直徑<5 mm;4級,有散生流膠點,病斑部位變黑,直徑≥5 mm。病情指數和相對防效計算方法如下:

I=[∑(n×i)/(N×imax)]×100;

(3)

E=(ICK-It)/ICK。

(4)

式(3)、(4)中:I表示病情指數;n表示各級病株數;i表示該病級值;N表示調查總株數;imax表示最高級值;E表示相對防效;ICK表示空白對照組病情指數;It表示處理組病情指數。

1.10 數據統計與分析

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析,采用Origin 2021軟件繪圖,用新復極差法進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 花椒內生真菌的分離和純化

采用組織分離法從花椒根、莖、葉和刺中共分離得到108株內生真菌菌株,篩選出對F.tricinctum具拮抗作用的菌株24株。其中,拮抗效果最強的菌株為HJ-18,培養7 d后,其對F.tricinctum的抑制率達58.85%(圖1)。

A,對照(正面);B,對照(反面);C,對峙效果(正面);D,對峙效果(反面)。培養時間為7 d。A, Control (front); B, Control (reverse); C, Confrontation effect (front); D, Confrontation effect (reverse). Culture time was 7 days.

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 形態學鑒定結果

拮抗菌株HJ-18形態如圖2所示,培養7 d之內,菌落呈現乳白色,菌絲蓬松稀疏,呈雪白色絨毛狀;培養10 d,菌落呈現淡黃色,中間區域長出傘狀物,有特殊性氣味產生(圖2-A、2-B)。菌絲有隔(圖2-C),可產生孢子,呈球形或橢圓形(圖2-D)。

A,菌落形態(正面);B,菌落形態(反面),C,菌絲;D,孢子。A, Colony morphology (front); B, Colony morphology (reverse); C, Mycelium; D, Spore.

2.2.2 分子生物學鑒定結果

系統發育樹結果(圖3)表明,菌株HJ-18與裂褶菌(Schizophyllumcommune)(登錄號MN218205.1)具有高度相似性,同源性達100%,初步鑒定其為裂褶菌,GenBank登錄號為OP502072。

圖3 菌株HJ-18基于ITS序列的系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain HJ-18 based on ITS sequence

2.3 抑菌譜

抑菌譜結果(圖4)表明,菌株HJ-18對4種病原菌都有一定的抑制作用,其中對尖孢鐮孢菌抑制效果最好,抑制率達45.80%,對細極鏈格孢菌抑制效果最差,抑制率為30.58%。

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。The bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.

2.4 培養濾液穩定性

2.4.1 自然光穩定性

如圖5-A所示,強光處理2 h后,菌株HJ-18培養濾液對F.tricinctum的相對抑制率為93.82%,而強光處理4、6、8、10、12 h后,其抑制率逐漸降低,但仍在80%以上,差異不顯著,表明菌株HJ-18的抑菌活性物質對自然光不敏感。

圖5 不同條件下菌株HJ-18培養濾液的穩定性Fig.5 Stability of the culture filtrate of strain HJ-18 under different conditions

2.4.2 紫外光穩定性

由圖5-B可知,菌株HJ-18培養濾液經紫外燈照射不同時間后,相對抑制率顯著(P<0.05)下降。照射30 min后,其對F.tricinctum的相對抑制率為99.86%,而在照射150 min后,相對抑制率僅為50.57%,表明該活性物質不耐紫外光照射。

2.4.3 熱穩定性

由圖5-C可知,不同溫度處理后,菌株HJ-18培養濾液對F.tricinctum的相對抑制率存在顯著差異(P<0.05)。20 ℃處理下,其相對抑制率為96.35%,120 ℃處理下的相對抑制率為65.65%,但仍保持較高的抑制效果,說明菌株HJ-18培養濾液的活性物質對溫度具有較強的耐受性。

2.4.4 酸堿穩定性

如圖5-D所示,不同pH下,菌株HJ-18培養濾液對F.tricinctum的相對抑制率差異顯著(P<0.05)。當pH值為7.0時,其相對抑制率達82.59%;在酸性環境(pH值3.0)和堿性環境(pH值11.0)下,菌株HJ-18培養濾液的相對抑制率均顯著下降,但仍保持較高的抑制效果,相對抑制率分別為55.78%和49.43%,說明菌株HJ-18培養濾液的抑菌活性物質對酸堿具有一定的耐受性。

2.5 菌株HJ-18培養濾液對三線鐮刀菌菌絲生長的影響

由圖6可知,不同體積分數的菌株HJ-18培養濾液對三線鐮刀菌菌絲生長的抑制率有顯著差異(P<0.05),且隨著菌株HJ-18培養濾液體積分數的增大,抑制率逐漸升高。當HJ-18培養濾液體積分數為50%時,其抑制率達到66.40%。

A,菌落直徑;B,抑制率。A, Colony diameter; B, Inhibition ratio.

由圖7可知:對照組的菌絲生長狀態良好,菌絲均勻,光滑,形狀完整,呈現正常的管狀結構(圖7-A、7-B);處理組菌絲粗細不一,出現彎曲,褶皺現象,且表面有碎屑產生(圖7-C、7-D)。說明菌株HJ-18培養濾液對三線鐮刀菌菌絲產生了嚴重的影響,導致菌絲彎曲、褶皺。

A,對照(×1 000);B,對照(×4 000);C,HJ-18培養濾液處理(×1 000);D,HJ-18培養濾液處理(×4 000)。A, Control (×1 000); B, Control (×4 000); C, Treated by HJ-18 culture filtrate (×1 000); D, Treated by HJ-18 culture filtrate (×4 000).

2.6 菌株HJ-18培養液對花椒流膠病的防治效果

不同處理均對花椒流膠病有一定的防治效果,先接種病原菌后用菌株HJ-18培養液處理的相對防效達到52.65%,略高于22.5%啶氧菌酯處理的相對防效(48.48%),顯著高于無菌水處理(18.56%);先用菌株HJ-18培養液預處理,再接種病原菌的植株,僅出現小面積膠狀物,大部分正常生長,其相對防效達到56.82%(圖8、表1)。綜上,裂褶菌HJ-18對花椒流膠病有較好的防治效果。

表1 菌株HJ-18對花椒流膠病的生防效果

A,接種三線鐮刀菌;B,三線鐮刀菌+菌株HJ-18處理;C,22.5%啶氧菌酯100倍液處理;D,無菌水處理;E,先接種菌株HJ-18再接種三線鐮刀菌。A, Inoculation with Fusarium tricinctum; B, Fusarium tricinctum+HJ-18 treatment; C, 100-fold dilution of 22.5% picoxystrobin treatment; D, Sterile water treatment; E, Inoculation with strain HJ-18 before the Fusarium tricinctum.

3 結論與討論

植物內生真菌資源豐富,在促進植物生長、抗逆、抗病等方面發揮著重要的作用[26-28]?，F已發現的植物內生真菌中,約有三分之一對病原真菌具有一定的拮抗作用[29],其拮抗機制主要有競爭、重寄生、抗生作用等[30-31]。

近年來,裂褶菌逐漸作為生防菌株應用于植物病害的防治。張富美等[32]篩選出的裂褶菌G18可抑制尖鐮孢菌的生長;宋曉宇[33]從楊樹中篩選出的裂褶菌ROHY8225b2,其揮發性有機化合物對炭疽菌等幾種植物病原菌有一定的抑制作用。本研究從花椒植株中分離的裂褶菌HJ-18對三線鐮刀菌的抑制率為58.85%,且對其他4種供試植物病原真菌均具有一定的抑制效果,表明其具有生防菌株的潛力。掃描電鏡結果顯示,經過培養濾液處理的菌絲粗細不一,表面出現碎屑等現象,推測菌株HJ-18可能產生某種活性物質[34],其破壞病原菌菌絲體結構,導致細胞內物質發生泄露,從而起到抑制效果。

菌株在培養過程中會產生一些活性物質,如多糖、蘋果酸、β-蒎烯等,這些活性物質受外界影響較大[35-37]。王恒煦等[38]研究發現,芽孢桿菌WD培養濾液經過不同溫度處理后,抑制率基本保持不變,表明該培養液對溫度有一定的耐受力,本研究結果與此一致。芽孢桿菌WD培養液經不同時間紫外燈處理后,活性基本保持不變;本研究中裂褶菌培養濾液經紫外燈照射之后,抑菌物質的活性下降,但抑制率仍達50%以上,這可能是因為不同菌株培養濾液對于外界環境具有不同的耐受力。裂褶菌培養濾液對酸堿有一定抗性,說明該培養濾液穩定性較好,具備一定的生產潛力,可作為一種良好的生物資源應用于生產實踐。盆栽試驗結果表明,菌株HJ-18對花椒流膠病的防治效果為52.65%,與22.5%啶氧菌酯100倍液的48.48%相比無顯著差異,說明其有一定的應用前景。本研究還發現,先接種菌株HJ-18再接種三線鐮刀菌處理組花椒的病情指數較小,相對防效略高于先接種三線鐮刀菌再接種菌株HJ-18處理組,表明菌株HJ-18對花椒流膠病的預防作用優于治療作用。陳思杰等[39]也發現,深色有隔內生真菌預處理對枸杞根腐病害的防治效果優于同時接菌。綜上表明,裂褶菌HJ-18對三線鐮刀菌引起的花椒流膠病具有良好的生物防治效果,可作為生防菌劑進一步開發與利用。