KDM4A通過下調BMP9促進乳腺癌細胞MDAMB-231的遷移和侵襲

陳遠香，余 濤，楊詩雨，曾 濤，魏 蘭，張 彥

重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016

乳腺癌是一種嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤，其發生、發展涉及遺傳背景、激素紊亂和環境影響等多種因素，發病原因復雜［1-3］。因此，尋找新的有效治療靶點對改善乳腺患者的生存至關重 要。

組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳修飾，不同組蛋白不同位點的甲基化修飾可導致其所在DNA區域的轉錄活性改變，從而激活或抑制其基因表達。賴氨酸特異性去甲基化酶4A（lysine specific demethylase 4A，KDM4A）在多種癌癥中呈高表達，其在人乳腺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，且癌變程度越深，其表達越高［4-5］，提示KDM4A可作為潛在的乳腺癌治療新靶標。有研究［6-7］顯示，KDM4A可特異性識別組蛋白H3賴氨酸4號位三甲基化（H3K4me3）或組蛋白H3賴氨酸36號位三甲基化/二甲基化（H3K36me3/2），去除甲基基團引起甲基化水平下降，從而導致基因轉錄受到抑制。

骨形態發生蛋白9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）是一種屬于骨形態發生蛋白家族的信號分子，參與調控血管生成［8］、骨骼發育［9］、肝臟功能［10］和腫瘤生長［11-12］等生物學過程。研究［11，13-17］發現，BMP9在乳腺癌中常呈低表達甚至表達缺失，而外源性BMP9能抑制人乳腺癌細胞在體外的惡性生物學行為，調節乳腺癌細胞代謝，抑制乳腺癌的骨轉移等。因此，本研究探索表觀遺傳修飾的組蛋白KDM4A在乳腺癌中的表達及作用，探究KDM4A與BMP9之間的關系及其可能的調節機制，并明確其對乳腺癌發生、發展的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞系及主要試劑

實驗所用乳腺癌細胞系由重慶醫科大學檢驗醫學院實驗室保存。DMEM高糖培養基購自重慶賽米克生物科技有限公司，胎牛血清購自美國CLARK Bioscience公司，KDM4A小干擾RNA及GP-transfect-Mate轉染試劑購自上海吉瑪制藥技術有限公司，RNA快速提取試劑盒購自上海奕杉生物科技有限公司，反轉錄試劑購自日本Takara公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，染色質免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）檢測試劑盒、蛋白質印跡法（Western blot）相關試劑購自上海碧云天生物技術股份有限公司，兔抗人E-cadherin、vimentin、KDM4A、H3K36me3、H3K4me3、H3K36me抗體和鼠抗人β-actin抗體購自美國Proteintech公司，兔抗人BMP9抗體購自英國Abcam公司，放線菌素D及放線菌酮購自美國Selleck公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

細胞用含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中靜置培養，待生長密度達90%時進行細胞傳代。

1.2.2 細胞轉染

細胞接種于培養皿，待生長密度達60%～80%時，依據GP-transfect-Mate轉染試劑使用說明書進行轉染，24 h后檢測mRNA的表達情況，48 h后檢測蛋白質表達情況。

1.2.3 RNA提取和RTFQ-PCR檢測

使用RNA快速提取試劑盒進行細胞總RNA提取，再使用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA用于RTFQ-PCR檢測，實驗所用引物序列見表1。

表1 siRNA及RTFQ-PCR引物序列Tab.1 Sequences of siRNA and RTFQ-PCR primer

1.2.4 Western blot

收集并裂解細胞獲取總蛋白并定量，以30 μg蛋白上樣量進行Western blot實驗。蛋白樣品在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中分離后轉印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h后加入相應一抗4 ℃靜置過夜，第2天以HRP標記的山羊抗兔/鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體37 ℃溫育1 h，洗膜后用顯影儀顯影。每組實驗重復3次。

1.2.5 Transwell實驗

細胞處理24 h后，消化細胞并計數，以雙無培養基制備細胞混懸液，對于transwell侵襲實驗，提前1 h在小室中加入35 μL基質膠稀釋液（基質膠∶雙無培養基=1∶9），transwell遷移實驗則不需要。隨后將細胞懸液加入小室上室，完全培養基加入小室下室，37 ℃溫育24 h后固定并用結晶紫染色，于倒置顯微鏡下拍照。每組實驗重復3次。

1.2.6 劃痕愈合實驗

細胞處理24 h后鋪于6孔板內，待細胞長滿，使用10 μL移液器吸嘴在6孔板中間劃線，采用磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）清洗去除漂浮的細胞后加入雙無培養基，此時于鏡下拍照計作0 h，待24、48 h時在相同位置各拍1次照。使用CorelDRAW軟件分析各個時間點劃痕寬度，計算平均劃痕愈合率，計算公式為：平均劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度/48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。每組實驗重復3次。

1.2.7 ChIP

依據ChIP試劑盒進行實驗。使用1%甲醛溶液室溫固定對數生長期的細胞（約1×106個）10 min，使DNA和蛋白質交聯，然后進行超聲處理將DNA裂解，4 ℃溫育過夜進行免疫沉淀。后續獲得沉淀的染色質DNA后通過ChIP-PCR瓊脂糖凝膠電泳進行分析。用于ChIP-PCR的正向引物序列為5’-AGTCAGGTCCATAGTCCTTCAT-3’，反向引物序列為5’-TGGATTGTCCTCCACTTGTGC-3’。每組實驗重復3次。

1.2.8 RNA穩定性實驗

細胞接種于培養皿中，以siKDM4A小干擾RNA轉染細胞，并設置對照組。24 h后換液并加入放線菌素D，使終濃度為5 μg/mL，分別處理細胞0、30、60、90和120 min后，提取各時間點的RNA并進行定量檢測。每組實驗重復3次。

1.2.9 CHX蛋白穩定性實驗

細胞接種于培養皿中，以siKDM4A小干擾RNA轉染細胞，并設置對照組。48 h后換液并加入放線菌酮，使終濃度為100 μg/mL，分別處理細胞0、30、60、90和120 min后，提取各時間點的蛋白質并對蛋白水平進行檢測。每組實驗重復3次。

1.3 統計學處理

使用GraphPad Prism8.0軟件對數據進行統計學分析。對實驗數據進行正態性檢驗，符合正態分布的數據以±s表示，各組內兩兩比較采用Studentt檢驗，兩組及兩組以上組間數據比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 KDM4A在乳腺癌中異常高表達

通過檢索GEPIA數據庫（http://gepia.cancerpku.cn/）分析KDM4A在乳腺癌中的表達。結果顯示，KDM4A在乳腺癌組織中的表達高于正常組織（圖1A～1B），但KDM4A在乳腺癌各期表達差異無統計學意義（圖1C），提示KDM4A參與了乳腺癌整個發生、發展過程。RTFQ-PCR及Western blot結果均顯示，KDM4A在不同乳腺癌細胞系中的表達均顯著高于乳腺正常永生化上皮細胞MCF-10A（圖1D～1E）。

圖1 KDM4A在乳腺癌中呈高表達Fig.1 KDM4A highly expressed in breast cancer

2.2 KDM4A與BMP9表達存在相關性

檢索GEPIA數據庫分析發現，KDM4A與BMP9在不同癌癥中呈負相關關系，其在乳腺癌中也呈負相關關系（圖2A～2C）。RTFQ-PCR及Western blot結果顯示，在MDA-MB-231細胞中敲低KDM4A后，BMP9的mRNA表達及蛋白質水平均顯著上調（圖2D～2E）。以上結果提示KDM4A與BMP9呈負相關關系。

圖2 KDM4A與BMP9表達呈負相關Fig.2 The expression of KDM4A is negatively correlated with BMP9

2.3 KDM4A可發揮去甲基化作用沉默BMP9表達

Western blot檢測MDA-MB-231細胞中組蛋白甲基化水平，發現敲低KDM4A后，H3K36me3、H3K4me3水平均升高，H3K36me水平降低（圖3A），說明KDM4A可以發揮去甲基化酶作用，降低組蛋白基因甲基化水平。以IgG抗體沉淀為陰性對照、Input為陽性對照，H3K36me3、H3K4me3抗體沉淀為實驗組進行ChIP實驗，結果顯示，在乳腺癌細胞MDA-MB-231中敲低KDM4A后，H3K36me3在BMP9基因啟動子區域顯著富集，而H3K4me3則沒有顯著變化（圖3B）。這說明KDM4A可以通過發揮其去甲基化作用下調BMP9基因啟動子區的H3K36me3而不是H3K4me3組蛋白甲基化水平，從而沉默BMP9表達。

圖3 KDM4A下調組蛋白甲基化水平Fig.3 KDM4A downregulatd histone methylation status

2.4 KDM4A可抑制BMP9基因的轉錄但不影響其mRNA的穩定性

鑒于敲低KDM4A可以上調BMP9的mRNA水平，本研究擬進一步探究KDM4A是否能發揮去甲基化酶以外的作用影響BMP9的表達。首先對KDM4A是否影響BMP9的mRNA穩定性進行探究，在分別使用放線菌素D處理MDA-MB-231細胞后檢測BMP9的mRNA表達水平，結果顯示，敲低KDM4A與否對BMP9的mRNA穩定性無明顯影響（圖4A）。

2.5 敲低KDM4A可增加BMP9蛋白的穩定性

前期發現敲低KDM4A可上調BMP9的蛋白表達水平，其可能對BMP9表達水平的調控存在一定的翻譯后修飾作用。本研究又對KDM4A是否影響BMP9的蛋白穩定性進行探究。結果顯示，在用蛋白合成酶抑制劑CHX處理MDA-MB-231細胞后，發現敲低KDM4A能明顯延長BMP9蛋白的半衰期（圖4B）。上述結果提示，KDM4A能夠降低BMP9蛋白的穩定性，而敲低KDM4A可使BMP9蛋白的穩定性顯著提高。

2.6 敲低KDM4A抑制乳腺癌細胞遷移及侵襲能力

劃痕愈合及transwell實驗結果顯示，敲低KDM4A相較于對照組可以顯著降低MDAMB-231細胞的劃痕愈合率、減少穿膜細胞數，且這種作用可被敲低BMP9部分逆轉（圖5A～5B）。上述結果提示，KDM4A可以促進乳腺癌細胞遷移及侵襲，且這種作用可因BMP9的敲低而被部分逆轉，說明KDM4A可通過下調BMP9促進乳腺癌的進展。

3 討 論

在乳腺癌中，多種基因的表達與功能異?？纱龠M乳腺癌的惡性生物學行為，而分子生物學技術的進步使得有助于識別乳腺癌診斷和治療的更具體的生物標志物成為可能，從而改善個體化治療［18］。因此，尋找高特異性的生物標志物幫助醫師診斷及制訂治療計劃對提高治療成功率至關重要。

染色質的三維結構由核小體定位、組蛋白組成和組蛋白修飾等過程調節［19］，帶正電荷的組蛋白修飾直接影響復制、基因轉錄和DNA損傷修復等過程。KDM4A是一種組蛋白去甲基化酶，在多種癌癥中呈高表達。有研究［20-21］顯示，KDM4A可以去除甲基化組蛋白H3上激活轉錄的H3K4/36me3標記，直接引起癌癥相關基因轉錄沉默或激活。例如，斑蝥素通過KDM4A依賴性組蛋白H3K36的去甲基化誘導DNA損傷，增強肝癌化療敏感性［20］；在非小細胞肺癌中KDM4A促進DLX5啟動子H3K4me3的去甲基化引起DLX5轉錄激活，導致癌基因Myc的表達，從而促進癌癥的發生、轉移和生長等［21］。此外，KDM4A還能作用于轉錄抑制性標記H3K9me3，在骨肉瘤中通過控制SLC7A11啟動子區域的H3K9me3去甲基化，調控SLC7A11的轉錄和癌細胞鐵死亡［22］；在宮頸癌中，KDM4A通過H3K9me3激活轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor protein 1，TFR1）和二價金屬轉運蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）啟動子中的HRE序列，從而誘導宮頸癌細胞鐵死亡［23］。除了以去甲基化組蛋白為底物，KDM4A還能以非組蛋白為底物，通過直接下調腫瘤抑制因子miR-491-5p促進宮頸癌細胞生長并抑制細胞凋亡［24］。KDM4A與腫瘤的發生、發展密切相關，而其在乳腺癌中的作用尚不明確。本研究首先發現了KDM4A與BMP9之間呈負相關關系，并明確了KDM4A在乳腺癌中對BMP9進行轉錄調節的作用，并且這種作用既可以依賴也可以獨立于其酶活性，但其影響BMP9蛋白穩定性的具體機制還需進一步探索。

BMP9是骨形態發生蛋白家族的一員，在胚胎發育、組織再生和成年生理學過程中發揮重要作用。BMP9在乳腺癌中發揮著至關重要的作用，BMP9可通過cMyc/SNHG3/mTOR信號軸促進乳腺癌細胞自噬，抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲［12］；通過激活BMP/Smad信號轉導通路，BMP9可以下調結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）抑制乳腺癌細胞骨轉移［15］；PI3K/AKT、ERK1/2、ALK1等信號轉導通路也是BMP9靶向抑制乳腺癌的重要途徑［16，25-26］。BMP9能夠通過協調癌細胞與周圍微環境之間的通訊來促進疾病的進展和轉移。通過降低脂肪前細胞/脂肪細胞中瘦素的表達，下調磷酸化STAT3、ERK1/2和AKT，抑制瘦素信號轉導通路來降低乳腺癌在脂肪微環境中的增殖和遷移［14］；BMP9通過RANK/RANKL和SDF-1（CXCL12）/CXCR4-PI3K信號軸調節骨髓間充質干細胞與乳腺癌細胞之間的串擾，促進骨髓間充質干細胞的成骨分化和增殖［13］。外源性BMP9能顯著抑制乳腺癌的發生、發展，但其在乳腺癌中的表達卻極低甚至缺失，作為一種多功能的細胞因子，BMP9具有潛在的治療應用前景，靶向BMP9在乳腺癌的診斷和治療中可能是一個重要手段。

本研究結果表明，KDM4A可以通過去除BMP9基因啟動子區域組蛋白H3上的甲基基團、降低BMP9蛋白的穩定性來下調BMP9的表達，促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

陳遠香：設計及操作全部實驗，撰寫文章。

余 濤：生物信息學分析。

楊詩雨：數據分析。

曾 濤：數據分析。

魏 蘭：設計實驗。

張 彥：設計實驗，修改文章。