益氣化瘀解毒方對急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺損傷及中性粒細胞粘附分子的作用研究

鄒喬 李雁 陳瑜 孔煜榮 陳一凡 劉通 曾燕鵬 沈冠彤

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由肺內/肺外原因沖擊所導致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭,臨床表現為頑固性低氧血癥和呼吸窘迫等,病死率超過40%[1]。臨床治療以肺保護通氣和保守液體管理為主,至今仍無特異性治療策略[2]。盡管其發病機制尚不明確,但大多數研究認為以中性粒細胞為主的促炎細胞大量活化,跨內皮遷移至肺間質、肺泡腔內,釋放過量炎性介質,介導肺泡—毛細血管通透性破壞,是ARDS的關鍵環節[3]。其中,中性粒細胞粘附是跨內皮遷移的必要條件,也是誘導ARDS炎癥早期反應的重要節點[4]。

Rap1b是小G蛋白Ras家族的重要成員,是調節中性粒細胞粘附的重要蛋白,主要通過激活整合素變構介導中性粒細胞粘附過程[5-6]。益氣化瘀解毒方是國家級名老中醫、首都國醫名師杜懷棠教授總結多年診療ARDS經驗所得的臨床效方。前期研究表明益氣化瘀解毒方可顯著改善脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的ARDS模型大鼠肺組織損傷,并調節炎癥通路蛋白及炎癥因子[7-9]。本研究擬觀察益氣化瘀解毒方對ARDS大鼠中性粒細胞粘附的影響,以期進一步探討益氣化瘀解毒方在ARDS肺損傷以及炎癥過程中的保護作用與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

36只健康SPF級雄性SD大鼠,6～7周齡,體質量(180±10)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(京)2019-0008。動物飼養于北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物中心屏障實驗室,每籠6只,普通飲食,溫度22～24℃,濕度50%～70%。動物適應性喂養7天后進行實驗。本次動物實驗經由北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物福利與倫理委員會審批通過(審批編號:19-54)。

1.2 藥物、試劑與儀器

益氣化瘀解毒方(黃芪30 g、三七10 g、赤芍15 g、炒枳實12 g、金銀花15 g、黃芩10 g、桑白皮15 g、葶藶子15 g)、益氣化瘀解毒方拆方“益氣清熱方”(黃芪30 g、黃芩10 g、金銀花15 g)、拆方“益氣化瘀方”(黃芪30 g、三七10 g、赤芍15 g)及拆方“益氣逐飲方”(黃芪30 g、葶藶子15 g、桑白皮15 g、炒枳實12 g),由中國中醫科學院藥物研究所提供并制成中藥浸膏,批號:20191030。

大腸桿菌脂多糖LPS(Sigma,L6511);Rap1b rabbit polyclonal antibody(Proteintech,10840-1-AP);大鼠Rap1b、淋巴細胞功能相關抗原1(leukocyte function-associated antigen-1,LFA-1)、巨噬細胞表面抗原-1(macrophage surface antigen-1,MAC-1) ELISA試劑盒(MB-7121A/ MB-7115A/ MB-7119A,江蘇酶標生物科技有限公司);BH2光學顯微鏡(OLYMPUS);高速離心機(Thermo); Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數儀(Thermo Scientific)。

1.3 動物分組及給藥

將大鼠隨機分為對照組、模型組、益氣清熱組、益氣化瘀組、益氣逐飲組、中藥全方組,每組6只。結合既往實驗研究確定的最佳給藥劑量,按12.2 g/(kg·d)(給藥劑量為生藥劑量)用蒸餾水將中藥浸膏配制為中藥溶液,益氣清熱組、益氣化瘀組、益氣逐飲組、中藥組給予對應中藥浸膏灌胃,連續灌胃7天;對照組及模型組給予等劑量蒸餾水灌胃,每日1次,連續灌胃7天。

1.4 ARDS大鼠模型制備

結合既往實驗研究確定的最佳造模時間及劑量,在第7天灌胃6小時后,模型組和各中藥給藥組給予尾靜脈注射LPS(2 mg/kg)制備ARDS模型,對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液進行尾靜脈注射。六組均于注射16小時后以3%戊巴比妥鈉(0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉,進行取材。

1.5 樣本取材

分別收集各組肺組織,步驟如下:大鼠開胸,生理鹽水灌注后取肺組織,右下肺用10%多聚甲醛溶液固定用于組織病理學檢測,右上肺置于無RNA酶EP管,凍于-80℃冰箱保存,左肺則用于收集肺泡灌洗液。分別收集各組肺泡灌洗液,步驟如下:開胸結扎右肺門后,用PBS反復清洗左肺3次,回收所有沖洗液,然后將沖洗液離心(4℃,3 000r/min)10分鐘,取上清液置于-80℃冰箱中保存。

1.6 組織病理學形態檢測

取保存于10%多聚甲醛溶液中的右下肺組織,脫水后進行石蠟包埋。采用蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察肺組織病理學形態變化。

1.7 ELISA法檢測肺泡灌洗液和肺勻漿中Rap1b、LFA-1、MAC-1蛋白表達水平

采用ELISA法檢測肺泡灌洗液中Rap1b、LFA-1及MAC-1含量,嚴格按照ELISA試劑盒中說明書操作。將凍存的肺組織室溫解凍,加入冰鹽水進行漂洗后用濾紙吸干,稱重;按重量(g)∶體積(mL)為1∶9的比例加入勻漿介質,在冰浴條件下快速將肺組織塊剪碎,手動勻漿6～8次,制備10%的肺組織勻漿。然后將肺組織勻漿離心(4℃,2 500r/min)10分鐘,取上清液,嚴格按照ELISA試劑盒中說明書操作。

1.8 Western blotting法檢測肺勻漿中Rap1b表達水平

研磨剪碎的肺組織,4℃、10 000 r/min離心15分鐘,取上清液,BCA法檢測總蛋白濃度并配平,加入蛋白上樣緩沖液,100℃沸水浴5分鐘。制備分離膠和濃縮膠,進行蛋白上樣、電泳、轉模分離目標蛋白,5%的脫脂奶粉封閉搖床1小時。加入一抗稀釋液(1∶2 000),使其充分浸泡,4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10分鐘,加入相應稀釋二抗(1∶10 000),于24℃恒溫搖床孵育1小時,TBST洗膜3次,每次10分鐘,ECL法顯影成像并分析。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 肺組織病理學情況

HE染色顯示,對照組大鼠的肺組織病理可見肺泡結構清晰完整,肺泡腔及肺間質無充血水腫,未見炎性細胞浸潤;模型組大鼠肺泡及肺間質水腫明顯,肺泡壁增厚,部分肺泡塌陷,伴隨有大量炎性細胞浸潤;各拆方組較模型組肺組織損傷程度有所減輕,肺泡腔塌陷改善,出血、滲出減少;中藥全方組較模型組大鼠肺組織損傷程度明顯減輕,肺泡及肺間質水腫改善,肺泡結構較完整,塌陷較少,炎性細胞浸潤及出血點減少。見圖1。

注:A 對照組;B 模型組;C 益氣清熱組;D 益氣化瘀組;E 益氣逐飲組;F 中藥全方組。

2.2 肺泡灌洗液和肺勻漿中Rap1b、LFA-1、MAC-1蛋白表達水平

2.2.1 各組大鼠肺泡灌洗液中性粒細胞粘附調節蛋白Rap1b表達水平比較 與對照組相比,模型組大鼠的肺泡灌洗液中Rap1b表達水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,益氣清熱組、益氣化瘀組、益氣逐飲組和中藥全方組大鼠的肺泡灌洗液中Rap1b表達水平均顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中Rap1b表達水平比較

2.2.2 各組大鼠肺泡灌洗液中性粒細胞粘附分子LFA-1及MAC-1表達水平比較 與對照組相比,模型組大鼠的肺泡灌洗液中,LFA-1表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,各拆方組及中藥全方組大鼠的肺泡灌洗液中LFA-1表達水平有所降低,而中藥全方組降低最為明顯,但差異均無統計學差異(P>0.05)。與對照組相比,模型組大鼠的肺泡灌洗液中MAC-1表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,益氣清熱組和中藥全方組大鼠的肺泡灌洗液中MAC-1表達水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中LFA-1及MAC-1表達水平比較

2.2.3 各組大鼠肺勻漿中性粒細胞粘附調節蛋白Rap1b表達水平比較 與對照組相比,模型組大鼠的肺勻漿中Rap1b表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,各拆方組及中藥全方組Rap1b表達水平均有不同程度下降,但僅益氣逐飲組具差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肺勻漿中Rap1b表達水平比較

2.2.4 各組大鼠肺勻漿中性粒細胞粘附分子LFA-1及MAC-1表達水平比較 與對照組相比,模型組大鼠的肺勻漿中LFA-1表達水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,各拆方組及中藥全方組大鼠的肺勻漿中LFA-1表達水平均顯著降低(P<0.05)。與對照組相比,模型組大鼠的肺勻漿中MAC-1表達水平升高,但無統計學差異(P>0.05);與模型組相比,各拆方組及中藥全方組大鼠的肺勻漿中MAC-1表達水平均有所降低,但無統計學差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肺勻漿中LFA-1及MAC-1表達水平比較

2.3 WB法檢測肺勻漿中Rap1b表達水平

與對照組相比,模型組大鼠的肺勻漿中Rap1b表達水平有所升高,但無統計學差異(P>0.05);與模型組相比,益氣化瘀組大鼠的肺勻漿中Rap1b表達水平顯著降低(P<0.05),其他拆方組及中藥全方組Rap1b表達水平均有所降低,但無統計學差異(P>0.05)。見表5及圖2。

表5 各組大鼠肺勻漿中性粒細胞粘附調節蛋白Rap1b表達水平比較

注:A 對照組;B 模型組;C 益氣清熱組;D 益氣化瘀組;E 益氣逐飲組;D 中藥全方組。

3 討論

ARDS的核心病理機制是失控的炎癥級聯反應導致肺毛細血管內皮細胞、肺泡上皮細胞的屏障功能被破壞,其病情嚴重程度與中性粒細胞遷移到肺泡及肺毛細血管內的數量呈正相關[10]。中性粒細胞粘附是中性粒細胞跨內皮遷移至肺泡腔的始動環節,抑制該環節可有效截斷其后續的跨內皮遷移過程,進而延緩炎癥反應進展[11]。

Rap1屬于小鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(小G蛋白)Ras超家族成員之一,具有調節細胞極性、粘附運動等生物學功能[12]。Rap1b是中性粒細胞Rap1的主要亞型,可調節細胞粘附的動態變化[13],是抑制炎性刺激下中性粒細胞肺內募集活化、跨內皮遷移的關鍵蛋白[14]。整合素是一類細胞粘附分子,介導細胞和細胞之間及細胞和細胞外基質之間的相互識別和粘附[15],是重要的細胞“黏合劑”。而中性粒細胞主要表達LFA-1和MAC-1兩種整合素[16],均可與內膜上的細胞間粘附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)結合,介導中性粒細胞與內皮粘附[17]。本實驗發現模型組大鼠肺泡灌洗液、肺勻漿中Rap1b、LFA-1及MAC-1蛋白表達水平較對照組均有明顯上調,提示ARDS發病與中性粒細胞粘附活動增強關系密切。

杜懷棠教授認為ARDS的關鍵病機在于肺氣虛衰、毒瘀互阻、肺氣壅閉而致衰敗,針對病機予以“益氣扶正,解毒化瘀,滌痰逐飲”治法[18]。益氣化瘀解毒方遵其要義,扶正祛邪,標本兼顧:君用黃芪補益正氣,御邪防變;臣用金銀花、黃芩清熱解毒,祛邪外出;再用桑白皮、葶藶子、枳實瀉肺滌痰,逐飲降氣;佐用三七、赤芍活血化瘀,通利血脈。全方祛邪而不傷正,用藥精妙,功專力宏,盡顯杜懷棠教授持中守正之組方特點。本實驗以“益氣”之法為基礎,與“清熱”“化瘀”“逐飲”三者進行不同組合,將益氣化瘀解毒湯拆分為益氣清熱方、益氣化瘀方、益氣逐飲方,探究中藥全方及各拆方對ARDS模型大鼠的影響。

本實驗發現,經益氣化瘀解毒方及拆方干預后,大鼠病理觀察顯示肺組織炎癥、充血水腫等肺損傷表現較模型組均有不同程度減輕,而中藥全方組改善最為明顯,提示益氣化瘀解毒方可有效改善ARDS的肺損傷,抑制肺部炎癥。研究結果表明,中藥全方組及各拆方組肺泡灌洗液中Rap1b蛋白表達水平、益氣逐飲組肺勻漿中Rap1b表達水平較模型組顯著降低;同時,中藥全方組及拆方組肺勻漿中的LFA-1均明顯下調,益氣清熱組和中藥全方組肺泡灌洗液中的MAC-1下調較其他拆方組更為顯著。上述實驗結果提示益氣化瘀解毒方及拆方對粘附調節蛋白Rap1b及粘附因子LFA-1和MAC-1表達水平有下調作用,且益氣化瘀解毒方及拆方可能通過下調粘附調節蛋白Rap1b及粘附因子LFA-1和MAC-1表達水平,降低肺內中性粒細胞粘附活性,阻斷其跨內皮遷移,從而抑制ARDS的炎癥級聯反應。而且,中性粒細胞跨內皮遷移與血栓形成和水腫液滲出關系密切,LFA-1和MAC-1均可通過配/受體直接結合的方式促進中性粒細胞與血小板的相互作用,導致血栓形成[19];而減少肺毛細血管內皮上的整合素釋放,可以降低肺血管通透性,抑制水腫液滲出,減輕LPS引起的肺損傷[20]?？傃灾?本實驗中藥各方改善LPS引起的肺損傷的作用體現在可抑制中性粒細胞粘附、減少肺泡腔內的炎性滲出及炎性細胞因子聚集,即解毒清熱[21];抑制肺微血管滲出、水腫及微血栓形成[22],即逐飲化瘀,均直接作用于肺損傷的關鍵環節,與“清熱”“化瘀”“逐飲”之法相契合。

但在本實驗中發現,中藥全方組及拆方組肺勻漿中的MAC-1蛋白和肺泡灌洗液中的LFA-1蛋白較模型組未見顯著下調,與肺泡灌洗液有較大區別,這可能與LFA-1、MAC-1存在部分功能差異有關[23]。部分研究認為LFA-1主要作用于粘附過程,而MAC-1作用于后續的遷移過程[24],故而蛋白活性有所差異,可能導致LFA-1在毛細血管內皮上活性較高,MAC-1在肺泡腔內活性較高。

綜上,益氣化瘀解毒方及拆方對ARDS具有較好的治療作用,可能是通過抑制Rap1b、LFA-1和MAC-1蛋白表達,降低中性粒細胞粘附活性,截斷中性粒細胞跨內皮遷移過程,進而抑制ARDS失控的炎癥級聯反應,這也體現了“治病必求于本”的中醫學理念。