基于嚙齒類動物模型的推拿治療神經病理性疼痛機制研究進展

吳麗萍 唐宏亮 梁英業 王開龍 龐軍

神經病理性疼痛(neuropathic pain, NP)在人群中的患病率高達7%～10%,占慢性疼痛患者的20%～25%[1]。NP主要由神經壓迫、離子通道病、自身免疫性疾病和組織創傷等導致上行疼痛通路和下行抑制通路之間的失衡引起[2]。其包括外周神經系統中帶狀皰疹神經痛、三叉神經痛、疼痛性多發性神經病、多發性硬化癥的中樞性疼痛等[3]。盡管對NP的研究取得了進展,但對NP誘導和維持機制的不完全理解,NP發病率仍持續上升,目前也無確切有效的治療方法和藥物,嚴重影響患者的生活質量,甚至危及生命,給全球衛生和社會保障體系帶來了沉重的負擔,因此需要迫切尋求NP的安全可靠的治療方法。

1 NP嚙齒類動物模型的選擇和構建

在臨床研究前推拿對NP的機械性超敏反應、突觸可塑性改變、自主神經功能障礙的研究,大部分是用嚙齒類動物進行的。研究和治療NP的一個主要問題是其高度可變的病因,即從腦部病變到脊髓脫髓鞘疾病,以及糖尿病或抗癌化療引起的周圍神經病變。由于NP具有多種病因,不同的NP動物模型被創造出來。這些模型主要包括中樞神經系統疼痛模型、外周神經系統疼痛模型、藥物誘導的神經病變模型以及疾病誘導的神經病變模型[4]。

在推拿治療嚙齒類動物NP的研究中,所采用的模型主要以結扎介導的周圍神經損傷為主,即坐骨神經慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury, CCI)和脊神經結扎(spinal nerve ligation, SNL)模型。CCI模型用于自發性疼痛、異常感覺、卡壓性神經病變相關的感覺癥狀[5]。它在股骨中段以下通過3或4根鉻制腸線結扎單側坐骨神經,每根間距約0.5或1 mm,術后一周內即痛覺行為學改變,術后第二周內出現最大疼痛相關行為和姿勢不對稱疼痛體,體征持續時間超過2個月[6]。然而,當需要較大且穩定的疼痛行為幅度時,SNL模型成為首選模型。它通過結扎背根神經節遠端L5脊神經所構建。該模型機械性痛覺超敏、熱痛覺過敏和自發性疼痛等行為學改變在24～48小時內發生,并至少持續3～4個月[7]。

上述兩種模型都是由A纖維和C纖維的異位放電增加來啟動和維持疼痛。在推拿治療嚙齒類動物NP方面,對熱或機械刺激的行為反應通常被用作疼痛體驗的替代[8]。具體來說,熱或機械刺激引起的反射撤退閾值是作為鼠類疼痛閾值的一個指標。但由于鼠類的品系、縫合材料及縫合線結扎所產生的收縮緊密度的變化使這些結果存在一定的差異,因此臨床前模型中對NP的評估存在重大挑戰。近年,條件性位置偏愛、回避提供的內部獎賞及厭惡感知的外部測量被建議作為持續疼痛樣行為的指標[9]。這些指標是否能作為推拿治療NP的療效評估,尚需進一步研究。盡管如此,CCI和SNL作為有希望的模型,為NP機制研究提供了基礎,同時為推拿鎮痛機制的研究提供了巨大的潛力。

2 抑制星型膠質細胞和M1型小膠質細胞的活化

膠質細胞包括小膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、雪旺細胞的激活能夠誘導NP的中樞和外周敏化[10]。在脊髓,以小膠質細胞和星形膠質細胞為代表的神經膠質細胞與神經損傷誘發的疼痛關系密切。研究發現在SNL小鼠模型中miR-186-5p和趨化因子CXC配體13/CXC趨化因子受體5介導星形膠質細胞激活以促進NP發展[11]。脊髓小膠質細胞活化主要發生在炎癥或神經損傷的早期階段,在痛覺敏化的發生過程中發揮重要作用。而星形膠質細胞激活常發生在小膠質細胞激活之后,其表達水平與疼痛行為密切相關,主要參與慢性痛的維持[12]。

在周圍神經損傷后,小膠質細胞會降解脊髓背角I層中的細胞外基質結構,即神經元周圍網,薄板I PNN選擇性地包裹棘臂旁投射神經元,這些神經元整合脊髓中的傷害性信息并將其傳遞到脊髓上腦區域并誘發疼痛感[13]。因此,小膠質細胞和星型膠質細胞的激活與NP感覺神經元的刺激激活有關。

吳志偉等[14]發現在大鼠CCI后脊髓背角中星形膠質細胞和M1型小膠質細胞被活化,膜蛋白CD68做為小膠質細胞標志物,其含量在CCI術后高于同時期的空白組及假手術組,經推拿按揉法干預后,CD68含量降低,并伴隨長C纖維誘發的場電位下調和脊髓背角時程增強抑制,減弱突觸強化引起的中樞敏化,調節NP的發生發展。這些結果表明推拿能夠通過小膠質細胞改變突觸重塑、連接和網絡功能。但推拿不能逆轉CCI后造成的M1型小膠質細胞活化,這可能與推拿作為一種柔和舒適、具有壓力、溫度等復合特性的刺激方法通過相應感受器傳遞并調整機體免疫系統有關。

上述結果表明,星型膠質細胞和M1型小膠質細胞的活化可能對神經突觸恢復有影響,推拿可能是影響NP后突觸重塑的潛在策略。然而相關研究較少,推拿與NP后星形膠質和小膠質細胞的關系仍需進一步探討。

3 抑制p38絲裂原活化蛋白激酶和細胞外信號調節激酶激活

p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK)和細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的激活參與NP[15]。其中p38 MAPK是炎癥過程中表征最好的激酶之一,由4個亞基:p38α,p38β,p38γ和p38δ組成。它們在調節哺乳動物細胞的細胞內信號轉導方面起著積極的作用[16]。p38 MAPK誘導NP和其他慢性疼痛相關的各種細胞內反應。因此,特異性靶向p38 MAPK分子及其信號通路代表了疼痛管理的潛在治療策略[17]。

ERK 1/2是絲裂原活化蛋白激酶超家族的成員,通過外周組織暴露于有害刺激而在神經元中激活的分子。周圍神經損傷在不同的時間點誘導神經膠質細胞、感覺神經元和二階神經元中的ERK激活[18]。紅核白介素(interleakin,IL)-33通過激活ERK、p38 MAPK和JAK2/STAT3,在保留性神經損傷(spared nerve injury,SNI)模型誘導的單神經病性疼痛的早期發展中產生痛覺作用,相應的抑制劑顯著減輕SNI誘導的單神經病理性疼痛或IL-33誘發的機械超敏反應[19]。

韋斌麗[20]在NP-CCI大鼠模型脊髓背角中發現CCI組大鼠的ERK、p38 MAPK蛋白表達均高于正常組和假手術組, 絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)低于正常組和假手術組,而經“環跳”“風市”及“陽陵泉”穴推拿干預后,大鼠熱痛閾值及機械縮足反射閾值升高,推拿組的ERK、p38 MAPK蛋白表達均低于CCI組和假推拿組,MKP-1高于CCI組和假推拿組。他們還發現推拿鎮痛的機制可能介導ERK、p38 MAPK激活MAPK信號通路中ERK基因和蛋白的表達,抑制下游炎性因子IL-1β的表達有關。以上研究表明ERK信號通路參與了NP過程,推拿能夠抑制蛋白激酶ERK及p38 MAPK激活依賴的神經炎癥,這可能為NP控制提供一種新的治療策略。

4 調控脊髓背角Ca2 +離子通道

傳入感覺神經元中疼痛刺激的檢測和處理嚴重依賴于各種不同類型的電壓和配體門控離子通道,包括鈉、鈣和TRP通道等,這些通道的功能包括檢測機械和化學損傷、產生動作電位和調節神經元放電模式、啟動背角突觸處的神經遞質釋放、以及激活投射到大腦疼痛中心的脊髓神經元[21-22]。離子通道表達和功能的持續變化會導致慢性疼痛狀態。

盡管多巖石地帶的地形崎嶇陡峭，空氣寒冷、干燥，但仍有很多哺乳動物在此安家。為了生存，它們必須適應環境。有些動物長著厚厚的皮毛以保暖過冬，有些動物則上上下下地來回遷移，以躲避糟糕的天氣。

高壓激活Ca2+通道在神經系統中廣泛表達,它們通過參與突觸傳遞、突觸可塑性的變化和神經元興奮性在疼痛傳導中發揮重要作用?，F有證據表明,高壓激活Ca2+通道是疼痛管理的重要治療靶點[23]。此外,研究發現編碼鈉鈣交換劑3型在小鼠背角神經元中表達,缺乏該基因的小鼠背角神經元在重復刺激后,顯示細胞內鈣增加、鈣清除減慢和發束增加,小鼠出現急性疼痛行為[24]。傳入疼痛通路中涉及的許多通道對鈣離子具有滲透性,這表明鈣離子在細胞信號傳導中的作用超出了單純的電活動的產生[25]。

Wang等[26]在CCI模型大鼠的背根神經節中檢測到65個受推拿調節的差異表達基因,他們用KEGG分析了推拿的潛在即時鎮痛機制最終發現推拿的即時鎮痛機制與鈣信號通路有關。1次推拿給予機體的機械刺激可啟動CCI大鼠脊髓背角中鈣號通路,通過Ca2 +的攝取和釋放來調節細胞內Ca2 +濃度,降低損傷敏感神經元的超興奮性,從而修復損傷的神經元細胞,減輕局部炎性微環境誘導的傷害性超敏反應;同時推拿通過細胞中產熱或調節脂解的表達和蛋白-1的解偶聯介導含能化學物質的耗散,調控棕色脂肪組織誘導適應性產熱,進而與β腎上腺素能受體結合,增加脂肪分解,在基因水平調節神經損傷局部能量代謝從而減輕痛覺過敏,抑制CCI誘導NP的發生發展[26]。

總之,以上研究表明在CCI誘導Ca2 +轉運和損傷敏感神經元的超興奮性存在緊密的相互作用,推拿能夠調節鈣信號通路抑制疼痛的形成和維持。當然,研究背根神經節創傷如何調節鈣信號通路的激活從而介導NP的發生將是非常有意義的。

5 減少促炎因子及炎癥介質分泌

肥大細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞等多種免疫細胞在外周和中樞致敏中發揮重要作用,包括突出的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、IL-1β、IL-18、IL-6以及γ干擾素[27]。此外還有炎癥介質前列腺素E2、囊泡谷氨酸轉運蛋白、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體 、Toll樣受體4與NP進展密切相關[28-29]。前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)促進原代感覺神經元中疼痛介質的合成[30],而運用調和沖任推拿能抑制患者血清PGE2因子的表達[31]。除此,本文將重點介紹推拿治療嚙齒類神經病理性疼痛高度相關的一些最新發現。

5.1 降低脊髓背角囊泡谷氨酸轉運蛋白2表達

囊泡谷氨酸轉運蛋白2(vesicular glutamate transporters2,VGLUT2)控制谷氨酸的儲存和釋放,谷氨酸在中樞疼痛處理中起著關鍵作用。在SNI誘導脊髓損傷中VGLUT2表達的上調,并且在手術前后鞘內給予針對VGLUT2的shRNA減輕了機械異常性疼痛和病理性增強的谷氨酸釋放[32]。

王雄將在SNL模型中發現與空白組比較,假手術對照組大鼠的VGLUT2表達水平在造模后出現一過性的增高,神經病理性行為增加,而IL-6、TNF-α水平顯著升高,而推拿組大鼠經過干預后,脊髓背角的VGLUT2和血清中的 IL-6、TNF-α水平均顯著下降[33]。這進一步說明VGLUT2與脊髓損傷和中樞敏感的痛覺信號傳遞之間存在著強烈的關聯性。

5.2 抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體活化

NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎癥小體是先天免疫系統的關鍵組成部分,其在慢性疼痛條件下失調,并有助于慢性疼痛的發病機制[34],有研究發現miR-23a直接靶向趨化因子受體4,通過硫氧還蛋白相互作用蛋白/NLRP3炎癥小體軸調節脊髓神經膠質細胞NP[35]。NLRP3介導半胱天冬蛋白酶-1活化和促炎細胞因子IL-1β或IL-18 的分泌在神經痛信號轉導過程中表現出明顯優勢[36]。

5.3 介導長鏈非編碼RNA BANCR激活提高神經元自噬水平

自噬對神經元發育至關重要,其失調會導致神經退行性疾病。BANCR位于9q21.11-q21.12的基因沙漠區域,是一種長度為693 bp的長鏈非編碼RNA,通過影響細胞增殖、遷移、侵襲、細胞凋亡和上皮到間充質的轉變來確定其在疾病發生中的重要性。研究發現減弱BANCR表達能激活神經元中微管相關蛋白輕鏈(microtubule-associated protein 1light chain 3II,LC3II)自噬體水平,降低選擇性自噬接頭蛋白(sequestosome 1,SQSTM1/p62)積累和神經毒性[38-39]。龍炳材等人發現推拿能通過抑制長鏈非編碼RNA BANCR的表達,上升LC3II及降低p62蛋白表達,提高自噬水平,清除促炎因子IL-1β累積,減輕大鼠的痛覺過敏行為[40]。以上結果為進一步理解推拿調控NP中的細胞自噬提供了新的視角,并可能為NP的治療提供有力的理論依據和治療靶點。

5.4 調節Toll樣受體4表達

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是一類跨膜信號轉導受體,介導固有免疫,識別病原相關模式分子。多項研究證實TLR4在NP中發揮重要作用。Wang等人發現SNL模型建立后第14天,TLR4、TNF-α和IL-6的表達水平顯著升高;這表明在NP中TLR4信號通路被激活,進一步誘導炎癥反應的發生,導致疼痛的感知,而推拿干預14天后,TLR4、TNF-α、IL-6表達顯著下降,提示推拿通過抑制受體TLR4的表達,減少促炎因子TNF-α、IL-6表達,從而抑制炎癥反應[41]。但推拿如何調控TLR4尚不清楚,需要更多的研究來了解這些變化對疼痛的特異性以及在疼痛病理生理學中可能的因果作用。

6 減少傷害感受器表達

傷害感受器是檢測破壞性或潛在破壞性刺激的特殊感覺神經元,存在于背根神經節和三叉神經節中。許多類型的受體在疼痛感中被激活,其信號通路各不相同。這些信號通路可以看作是通過靶向疼痛轉導分子產生鎮痛來調節疼痛的部位。在其解剖學位置的基礎上,瞬時受體電位離子通道、壓電型機械敏感離子通道組件、酸感應離子通道、嘌呤能、緩激肽等在疼痛致敏期間被激活[42]。這些神經元對于最終產生疼痛感知的神經元信號至關重要,而推拿作用于以下傷害感受器神經元治療急性和慢性疼痛。

6.1 降低三磷酸腺苷受體P2X3表達

含有P2X3的受體做為三磷酸腺苷依賴性離子通道,是調節傷害性信號的關鍵靶標。背根神經節中P2X3的敲低逆轉了慢性縮窄損傷誘導的集落刺激因子1上調、脊髓小膠質細胞激活和神經性疼痛樣行為[43]。CCI大鼠脊髓背角中P2X3受體表達增加導致大鼠機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏,而奈鐵堿顯著降低上調的P2X3受體和IL-1β,抑制CCI大鼠脊髓背角中ERK1/2的磷酸化和活化,緩解神經性疼痛[44]。秦麗發現推拿通過CCI大鼠脊髓背角中蛋白激酶C-P2X3通路緩解外周NP,其機制可能與推拿通過降低脊髓背角中的蛋白激酶C、P2X3的蛋白表達水平,抑制疼痛信號進一步向上傳遞有關[45]。檢測失調P2X3的水平可能為未來NP的診斷、治療和評估提供一種有前景的方法。

6.2 下調壓電型機械敏感離子通道組件2表達

機械性疼痛反應發生與壓電型機械敏感離子通道組件1/2(piezoelectric mechanical sensitive ion channel assembly 1/2,Piezo1/2)在感覺神經元中表達水平有關[46]。Piezo2是一種快速適應、機械激活的離子通道,低閾值機械感受器的機械敏感性強烈依賴于Piezo2,在體外顯示快速適應,機械激活電流的單個離子通道負責參與無害觸覺的大多數低閾值機械感受器亞型的機械敏感性[47],缺乏Piezo2的小鼠對機械刺激的傷害性反應受損并響應機械刺激的Aδ傷害感受器和C纖維放電減少。Piezo2介導炎癥和神經損傷誘導的致敏性機械疼痛[48],并表明靶向Piezo2可能是治療機械性異常性疼痛的有效策略。宋鵬飛[49]通過“L”類鋼筋單側脊髓背角壓縮建立的CCD大鼠疼痛模型中,通過推拿干預進行痛覺超敏的行為監測,采用免疫組織化學和免疫跡法分析Piezo1和Piezo2在有髓神經纖維中的表達,發現空白組和CCD組的Piezo2表達較高,Piezo1表達較低。推拿干預后神經病理性疼痛行為減輕,Piezo2的表達被下調,Piezo1增加。以上研究表明推拿能通過脊髓背角軸突內的壓電機械敏感通道發揮抗炎鎮痛的作用,有助于進一步研究推拿通過傷害感受器影響NP的詳細機制,改變了對推拿作用認識傳統的研究思路。

7 調節中樞去抑制

在中樞神經系統中,下行系統的存在是為了內源性地調節對疼痛的感知, 中腦導水管周圍灰質(periaqueductal gray,PAG)和口腹內側髓質(rostral ventromedial medulla,RVM)投射的下行途徑,以抑制脊髓背角的上行傷害性傳遞。有學者提出阿片類藥物和大麻素通過γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)去抑制的間接過程激活下行鎮痛-抑制抑制性GABA能輸入到構成下行鎮痛途徑的輸出神經元,GABA能抑制張力的功能減退是突觸傳遞增強的重要因素,突觸異常傳遞通常導致脊髓損傷后背角神經元的神經元過度興奮[50]。而同時GABA能神經元活性的慢性增加抑制了中腦腹側被蓋區中的多巴胺能神經元活動,并負責負面情緒和脊髓損傷誘導的NP的發生[51]。

張磊[52]運用“以痛為腧”環跳穴推拿按壓法對坐骨神經結扎處進行推拿,4周干預治療后發現NP-CCI大鼠推拿組PAG、RVM核群內GABA 和 GABAAR的平均光密度值明顯高于模型組。這提示推拿降低大鼠痛覺超敏,緩解NP的機制可能與PAG、RVM核群內 GABA 及 GABAAR含量增加有關。這為揭示推拿治療神經病理性的中樞致敏分子方面取得了重大進展,這一突破有望極大地促進對此類病癥的全面了解和治療。

8 小結與展望

《黃帝內經》云:“經絡不通;病生于不仁,治之以按摩”,《醫宗金鑒·外治法》也云:“按其經絡,以通郁閉之氣,摩其壅聚,以散瘀結之腫,其患可愈”?？梢娡颇米鳛橐环N有效的鎮痛治療方式,具有運行氣血、調和榮衛、疏經止痛的功效。綜合上述的研究可知,中醫推拿能夠通過調節膠質細胞、離子通道、傷害感受器表達等方式調控嚙齒類動物外周神經損傷介導的NP,進一步說明了在疼痛中推拿的鎮痛效果。但對中醫推拿的鎮痛機制研究尚處于初級階段。推拿對NP的鎮痛機制研究是本團隊在對推拿調治軀體疼痛性亞健康、偏頭痛、腰痛病的臨床研究基礎上提煉出來的科學問題。

NP的發展與神經炎癥、神經凋亡和突觸可塑性有關,并受興奮—抑制平衡、下行通路的影響、分子中介體與可塑性、離子通道的改變、代謝物、缺氧、線粒體因素及膠質細胞衍生的介質等調控。而推拿治療NP多從膠質細胞激活、離子通道和興奮—抑制不平衡的抑制性受體導致的神經炎癥為主,特別是推拿對外周和脊髓通路的神經炎癥反應,當前取得了重大進展,對細胞自噬層面也有一定的研究。但涉及大腦中的可塑性機制卻知之甚少,對NP中的神經節細胞、軸突和髓鞘損傷、脊髓背角萎縮方面尚未有觸及。除此,在最新研究中發現RNA的m6A甲基化、內質網應激以及細胞鐵死亡參與了NP的發生發展,能否從這些方面更深層的挖掘推拿的鎮痛機制還需進一步研究。