基于類器官模型探究乳腺癌突變位點ER、PR、HER2與藥物敏感性的相關性

吳松齡 劉佳慧 詹巧惠 黃佳雯

廈門醫學院附屬第二醫院乳腺外科 (福建 廈門 361021)

乳腺癌(breast cancer)是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，據統計，在2019年新增約26萬例乳腺癌患者，約占新發腫瘤發生病例的30%，同時因乳腺癌死亡病例約4.1萬，約占該年癌癥相關死亡約占15%[1]。雖然關于乳腺癌的診斷和治療已經取得了很大地進展，但是乳腺癌患者的5年生存率仍然很低[2]。有研究預計乳腺癌發病率和死亡率將持續的大幅上升[3]，因此急需改善乳腺癌的治療策略。在臨床上，化療已經成為大多數癌癥類型的金標準方法，包括乳腺癌。但是乳腺癌的亞型較為復雜，治療效果也大相徑庭。眾所周知，按免疫組織化學分類分為三種不同的亞型：雌激素/孕酮受體陽性(estrogen receptor+/progesterone receptor+ ER+/PR+)、人表皮生長因子受體2陽性(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)和三陰性乳腺癌(TNBC)[4]。大多的治療策略是根據乳腺癌的亞型，選擇靶向ER、PR或HER2的化療藥物，但是單獨使用靶向藥物治療極易誘導癌細胞產生耐藥性，例如，在治療早期，曲妥珠單抗治療HER2陽性的患者有著不錯的效果，而到晚期時，則會因為耐藥導致治療效果不理想[5]。因此，臨床上往往需要配合其他非ER、PR或HER2位點的靶向藥物進行協同治療[6]。然而，同一藥物對不同亞型的乳腺癌有著不同的效果。有報道顯示，相對于ER-或PR-的腫瘤，長春花堿對ER+或PR+腫瘤的抑制效果顯著降低[7]，而氟維司群對ER+或PR+的腫瘤抑制效果顯著優于陰性腫瘤[8]?？梢?，受體的表達水平可能與藥物的敏感性存在相關性。

另一方面，尋找合適的乳腺癌體外模型是藥敏相關研究的關鍵任務。乳腺癌具備高度的異質性，離體的腫瘤細胞和細胞系缺少腫瘤生長微環境，容易導致遺傳特異性的缺失，模擬效果有限，無法作為乳腺癌患者藥敏實驗的體外模型[9]。目前，類器官被認為是一種模擬患者腫瘤特征的體外模型，其可繼承原始腫瘤組織的基因組信息、轉錄組狀態和組織學特征，是新藥開放和藥敏特征良好的體外模型[10]，因此，本研究以培養臨床腫瘤組織類器官為研究對象。探索ER、PR或HER2表達水平的高低對常見的20中FDA藥物敏感性的影響，為臨床選擇治療藥物提供有效的數據。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本收集本研究的開展經過廈門醫學院附屬第二醫院倫理委員會的批準(NO.2020038)，在2020年08月至2021年08月期間收集了6份乳腺癌(BC)組織。本研究中所有患者都簽署了知情同意書，并且在收集患者之前沒有接受過放療或化療。

1.2 患者腫瘤源性類器官的培養將收集的腫瘤組織在無菌條件下切成1mm3的小塊，加入膠原酶A， 37℃震蕩孵育30分鐘，用移液槍溫和且反復吹打均勻，確保產生單細胞。隨后在4℃條件下，500 g離心10分鐘，用PBS洗滌2-3次后，將細胞沉淀重懸在含有2%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，并接種在含150 μL/cm2的Matrigel基質膠的24孔板中。將類器官置于37℃恒溫培養箱，待基質膠凝固后加入含有ROCK和糖原合酶激酶(GSK)抑制劑，以及100 U/mL青霉素/鏈霉素的乳腺類器官培養基(中科普瑞昇，PRS-BCM-3D)。置于37℃恒溫培養箱，每2天更換新鮮培養基，生長14天。

1.3 實時熒光定量(Real-timeQuantitative PCR，RTqPCR) 通過TRIzol試劑提取腫瘤組織的RNA，按照逆轉錄試劑盒(Accurate Biology，AG11706)將1 μg RNA轉錄為cDNA。按照SYBR GREEN試劑盒(QIAGEN，218076)的操作步驟建立反應體系，以GAPDH作為內參對照，實驗設置6個重復。使用LightCycler 480(羅氏)儀器檢測腫瘤組織和類器官中ER、PR和HER2的表達水平，反應條件：95℃，3 min；95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，40 s；38個循環；72℃，5 min。反應結束后收集數據，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。引物序列如表1。

表1 定量引物

表2 乳腺癌類器官對治療藥物的敏感性評分

1.4 Westernblot 收集腫瘤類器官，加入RIPA裂解液中，在冰上充分裂解，4℃，12000 r/min的離心10分鐘，收集上清。用SDS上樣緩沖液對50 μg蛋白充分變性，通過12%的SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，在室溫下用含有5% 牛奶的TBST緩沖液中封閉1小時，在4°C條件下，用一抗，anti-ER(abcam, ab92516)、anti-PR(abcam, ab16661)、anti-HER2(abcam, ab134182)過夜孵育PVDF膜。用辣根過氧化物酶偶聯的二抗在 37°C 孵育 1 小時。用Image Lab software (Bio-Rad)顯影。使用 ImageJ 軟件對條帶強度進行光密度定量，以β-actin為內參標準化目的蛋白條帶強度。

1.5 類器官的藥敏測試將腫瘤類器官在體外培養4-5天后，選擇20種FDA批準的藥物，包括：順鉑、卡鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、長春瑞濱、艾日布林、拓撲替康、SN-38、依托泊苷、阿霉素、吉西他濱、它莫西芬、曲貝丁、奧拉帕尼、伏立諾他、貝利諾斯塔特、西地拉尼布、帕唑帕尼、舒尼替、依維莫司。將20種藥物配制成不同濃度，濃度范圍為10 μmol/L至128 mmol/L或100 μmol//L至1.28 mmol/L等。孵育6天后，使用CellTiter-Glo 3D(Promega，G9682)測定細胞活力，使用GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行分析，計算抑制率，抑制率(%)=(1-加藥孔吸光度/對照組吸光度)× 100%，并計算IC50。以各組類器官對藥物GR50所在濃度區間作為評分指標，GR50最低值為10%(即是濃度最小的兩個點及更低的濃度所在范圍)記為10分，其余的濃度范圍，分別記為相應的分數(如下圖所示)。

1.6 統計學方法所得實驗數據以平均數±標準差(±s)表示，使用SPSS 26.0對數據進行統計，采用非配對t檢驗進行差異性分析，以P＜0.05為是否具有統計學意義的判斷標準。

2 結 果

2.1 乳腺癌源性類器官的表征在顯微鏡下觀察到，第7天時，腫瘤細胞聚集形成的細胞團；在第14天時，由約200-400 μm的圓柱形或立方體的腫瘤細胞緊密凝聚構成的球形或卵形的細胞團(圖1-A)。同時，為了測試乳腺癌類器官與乳腺癌組織的相似性，通過RT-qPCR觀察ER、PR和HER2的表達情況。結果顯示，相對于癌旁組織(Con)，ER在1號，5號和6號患者中表達量顯著增加，而在2、3、4號患者中顯著降低；PR在1號、2號、5號和6號患者中表達量顯著增加，而在3、4號患者中顯著降低；HER在3號和4號患者顯著增加，而在1、2、5、6號患者中顯著降低。同時在乳腺癌類器官中，ER、PR和HER2的表達水平與來源的腫瘤組織無顯著差異(圖1B、圖1C)。

圖1 乳腺癌源性類器官的表征。注：圖1A：光學顯微鏡下觀察乳腺癌類器官的形態(標尺=200 μm)；圖1B～圖1C：RTqPCR觀察乳腺癌組織和乳腺癌類器官的組織學形態和ER和PR、HER2的表達水平。圖2 乳腺癌組織和類器官中ER、PR和HER2的表達水平。注：**P＜0.01。圖3 不同組別乳腺癌類器官在同濃度的20這種抗癌藥物中的細胞活力。

2.2 乳腺癌組織和類器官中ER、PR和HER2的表達水平隨后，為了觀察ER、PR和HER2的表達水平對化療藥物抗性的影響，通過western blot觀察各組類器官中ER和PR、HER2的表達水平。結果顯示，在ER的表達水平中，相對于2號，3號和4號患者，1號5號和6號患者的ER表達水平顯著增加；在PR的表達水平中，相對于3號和4號，其余患者的PR表達水平顯著增加(P＜0.05)；在HER的表達水平中，相對于2號和3號，其余患者的HER表達水平顯著降低(圖2，P＜0.05)。因此我們將1號5號和6號患者列為ER高表達患者(ER-H，4例)，而2號，3號和4號患者被列為低表達(ER-L，2例)。另外，1號2號，5號和6號患者被列為PR高表達患者(PR-H，4例)，3和4號患者被列為低表達患者組；同時，1號2號，5號和6號被列為HER2高表達患者(HER-H，4例)，低表達組則是3號和4號(HER-L)。

2.3 ER、PR和HER2的表達水平對乳腺癌類器官藥敏的影響進一步，觀察乳腺癌類器官的不同ER、PR和HER2的表達量對這些藥物的敏感性。結果顯示：相對于ER低表達組，在ER高表達的乳腺癌類器官對順鉑、卡鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、長春瑞濱、艾日布林、拓撲替康、SN-38和伏立諾他和帕唑帕尼呈現IC50顯著增加，評分降低；而對依托泊苷、阿霉素、吉西他濱、它莫西芬、曲貝丁、奧拉帕尼、貝利諾斯塔特、舒尼替和依維莫司呈現IC50顯著降低，評分增加；而乳腺癌類器官對西地拉尼布的IC50和評分與ER的表達量無關。相對于PR低表達組，在PR高表達的乳腺癌類器官對順鉑、卡鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、長春瑞濱、艾日布林、拓撲替康、SN-38和伏立諾他呈現IC50顯著增加，評分降低；而對依托泊苷、阿霉素、吉西他濱、它莫西芬、曲貝丁、奧拉帕尼、貝利諾斯塔特、帕唑帕尼、舒尼替和依維莫司呈現IC50顯著降低，評分增加；而乳腺癌類器官對西地拉尼布的敏感性對PR的表達量無關。相對于HER低表達組，在HER高表達的乳腺癌類器官對順鉑、卡鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、長春瑞濱、拓撲替康、SN-38、曲貝丁、帕唑帕尼、奧拉帕尼和舒尼替呈現IC50顯著降低，評分增加；而對依托泊苷、吉西他濱、它莫西芬和依維莫司呈現IC50顯著增加，評分降低；而乳腺癌類器官對伏立諾他、貝利諾斯塔特、艾日布林和西地拉尼布的敏感性對HER的表達量無關?？梢?，乳腺癌類器官ER、PR和HER2的表達水平不同，會導致細胞對藥物的敏感性不同。

3 討 論

乳腺癌是女性發病率最高的癌癥，并且發病率和死亡率依然不斷上升，嚴重危害女性的身心健康[11]。在治療過程中，有許多因素決定乳腺癌患者的治療結局，其中化療藥物合理選擇顯得格外重要[12]。乳腺癌的化療方案取決于ER、PR和HER受體表達的情況。然而，臨床的數據表明，對于乳腺癌的化療效果參差不齊，主要由于不適合的治療以及多重耐藥性的產生[13]。因此，需要進一步細化ER、PR和HER表達情況，制定治療方案。本研究在體外利用人來源乳腺癌類器官進行藥敏實驗，分析ER、PR和HER表達水平與藥物敏感性的相關性。

目前，類器官被用于腫瘤體外模型，因其保留了腫瘤組織完整的信息。本研究構建了乳腺癌患者來源的類器官，發現乳腺癌類器官的具備患者的腫瘤完整信息，具有大細胞核，高核質比的腫瘤細胞特征，并且保持相同的ER、PR和HER的表達情況?？梢?，我們構建的乳腺癌類器官在表征組織形態、細胞組成、標志物表達與腫瘤組織相一致，可以進行后續實驗。

進一步，我們細化了患者腫瘤組織和衍生的類器官中ER、PR和HER的表達水平，根據表達水平的高低，分為ER或PR或HER的高或低表達組，并進行藥敏實驗。根據藥敏測試結果可知，高ER表達和高PR表達的類器官有著相近的藥敏結果。這可能由于在乳腺癌中，ER和PR的表達水平往往是一致的[14]。此外，不同受體表達量的乳腺癌類器官對藥物的敏感性呈現不同的敏感性。其中，在高表達ER/PR的類器官中，對順鉑顯示出耐藥，并且ER/PR的表達水平與乳腺癌類器官對順鉑的敏感性成負相關。有研究指出，順鉑可以劑量依賴的方式增加ER-α36的水平上調，而ER-α36可通過EGFR/ERK信號通路介導順鉑耐藥性的產生[15]。此外，高表達HER的類器官對順鉑也具有耐藥性，HER的表達水平與乳腺癌類器官對順鉑的敏感性成負相關。這可能由于HER可直接激活ERK通路產生耐藥。同時，研究發現高表達水平的HER乳腺癌患者對蒽環類藥物、紫杉烷類的敏感性低于表達水平低的患者，而加入曲妥珠單抗(一種抗HER的單克隆抗體)可以顯著恢復癌細胞對蒽環類藥物、紫杉烷類的敏感性[16]，相似的，本研究發現高表達水平的HER類器官對阿霉素、紫杉醇和多烯紫杉醇的敏感性顯著降低。同時，ER/PR高表達的類器官對紫杉烷類的敏感性也低于低表達的類器官。在Ying[17]等的報告中顯示ER陽性的乳腺癌細胞(MCF-7)對紫杉醇的IC50為1183.06 nM，而ER陰性的乳腺癌細胞(MDA-MB-231)對紫杉醇的IC50為136 nM。此外，有研究顯示異巴查爾酮(Isobavachalcone)通過ER-α降低CD44的表達恢復ER+乳腺癌細胞對紫杉醇的敏感性[18]?？梢?，順鉑和紫杉醇不適合被選為治療ER、PR或HER表達水平較高的乳腺癌患者，可能在三陰性乳腺癌患者的治療中會有比較好的效果。

ER、PR或HER高表達的乳腺癌類器官對奧拉帕尼和舒尼替、曲貝丁均較敏感。其中，HER表達量與舒尼替的敏感性成正相關，而ER/PR的表達量卻與舒尼替的敏感性無相關性。研究表明，HER是癌細胞的驅動信號，可啟動癌細胞的轉移擴散，而舒尼替是一種小分子的吲哚酮化合物[19]，可抑制多種酪氨酸受體激酶，不包括阻斷表皮生長因子受體和HER的酪氨酸激酶結構域，從而抑制信號的傳遞，抑制癌細胞的活性[20]。Kim[21]等研究發現舒尼替能降低ER+乳腺癌組織中血小板衍生生長因子(PDGF)和金屬蛋白酶-1的表達，從而抑制癌細胞發育，其中PDGF和金屬蛋白酶-1均是與癌細胞生長轉移密切相關的基因。相似的，本研究發現舒尼替對于ER-乳腺癌類器官的抑制效果也十分顯著。另一方面，奧拉帕尼是一種聚-ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的類似物，通過與NAD+競爭性結合PARP的催化域活性位點，抑制PARP酶活性，從而阻礙癌細胞DNA單鏈斷裂時的堿基修復，導致細胞凋亡[22]。在所有乳腺癌亞型中，均存在抑癌基因BRCA1/2的突變情況，而發生BRCA1/2突變將會增加罹患乳腺癌的風險，而在臨床上奧拉帕尼已經顯示出對激素受體陽性或陰性患者治療的有效性[22]。本研究也發現不同表達水平的ER、PR或HER類器官均對奧拉帕尼顯著敏感。此外，所有類器官對曲貝丁的IC50均比較低，這可能由于曲貝丁是一種天然分離的烷化劑，相對于其它抗腫瘤藥物有著獨特的作用機理，其可通過結合 DNA 來阻止細胞分裂[23]。因此，我們認為奧拉帕尼和舒尼替、曲貝丁具有作為化療的主要藥物或輔助內分泌治療有候選藥物的潛力。同時，本研究對其它幾種常見的治療乳腺癌的藥物也進行了檢測，結果顯示受體的表達量會影響類器官對大多數藥物的敏感性，包括吉西他濱、它莫西芬?？梢奅R、PR和HER的表達量可為藥物的選擇提供依據。

4 結 論

綜上所述，ER、PR或HER的表達量與乳腺癌對大多數藥物敏感性有顯著的影響，包括順鉑、紫杉醇等。因此，在制定治療方案是需要考慮這些受體的表達量。不過，本研究的樣本量較少，需要的擴大樣本數進一步論證。