木豆WD40基因家族鑒定及響應茉莉酸甲酯的表達分析

牛禹極 吳錦林 陳耀陽 林巖松 楊杰 付玉杰

摘要：WD40蛋白參與調控植物生長發育、次生代謝產物合成及脅迫應答等生物學過程。WD40主要作為MYB-bHLH-WD40（MBW）蛋白復合體成員之一，激活花青素合成下游基因轉錄進而促進花青素的積累。探究WD40基因家族的功能是解析黃酮類次生代謝產物代謝調控機制的關鍵環節。本研究基于木豆（Cajanus cajan）基因組鑒定了木豆CcWD40家族成員，并對CcWD40基因進行生物信息學分析以及對茉莉酸甲酯響應的實驗。利用生物信息學在木豆基因組中鑒定出116個CcWD40基因家族成員，系統全面地評價了候選基因的基因結構、染色體分布、啟動子順式作用元件及系統發育進化歷程等特征，并分析了其在茉莉酸甲酯處理下的表達模式。結果表明：WD40蛋白質包含的氨基酸殘基數目在296～1 709之間，等電點范圍為4.33～9.58；116個基因可進行定位的基因有68個，這68個CcWD40基因不均勻分布于11條染色體上，大多位于3號染色體；系統進化樹將木豆CcWD40家族成員分為18個亞家族，盡管其基因結構間內含子差異較大，但在進化樹同一分支中的較為相似；共線性分析顯示，在所選3種模式植物中，木豆與大豆親緣關系最近；木豆CcWD40基因具有多個響應元件，包括脅迫響應元件、發育響應元件和激素響應元件，如脫落酸響應元件（ABRE）、水楊酸響應元件（TCA-element）、赤霉素響應元件（GARE-Motif）等，可見它們的表達受到復雜的調控網絡的控制，可能在非生物脅迫中起到重要作用；基于RNA-seq數據分析木豆CcWD40家族基因應茉莉酸甲酯的表達特征，其中96個CcWD40基因的表達量會在MeJA處理后首先逐漸降低，只有20個CcWD40基因的表達量會首先呈現升高趨勢，并且同一進化分支的CcWD40基因相應趨勢大體相同。該研究將為進一步探索WD40基因在調控黃酮類化合物合成和響應非生物脅迫應答中的功能提供重要基因資源和理論基礎。

關鍵詞：木豆；CcWD40；全基因組鑒定；茉莉酸甲酯

中圖分類號：中圖分類號Q753文獻標志碼：A文獻標識碼

Identification of WD40 gene family in pigeon pea and their expression pattern

responded to Methyl Jasmonate

NIU? Yuji1，WU? Jinlin1，CHEN? Yaoyang1，LIN? Yansong1，YANG? Jie2，FU? Yujie3*

（1 Aulin College， Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040，China; 2 College of Chemistry，

Chemical Engineering and

Resource Utilization， Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040，China;

3 College of Forestry， Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Abstract： WD40 protein is mainly involved in the regulation of biological processes such as the growth and development of plant， synthesis of secondary metabolites and stress responses. WD40， as one of the MYB-bHLH-WD40 （MBW） protein complexes， activates the transcription of genes which are located downstream of synthesis to promote anthocyanin accumulation. Exploring the function of WD40 gene family is the key procedure to analyze the metabolic regulation mechanism of flavonoid secondary metabolites. In this study， based on the pigeon pea （Cajanus cajan） genome， the members of CcWD40 family genes were identified in pigeon pea， and the CcWD40 genes and its responses of Methyl Jasmonate were analyzed by bioinformatics and experiments respectively. With bioinformatics， 116 members of the CcWD40 gene family were identified in the genome of pigeon pea， and the characteristics of the gene structure， chromosome distribution， cis-acting elements of the promoters， and the evolutionary history of the candidate genes were systematically and comprehensively evaluated， and the expression pattern disposed by Methyl Jasmonate was analyzed. The results showed that the amino acid residues of WD40 proteins ranged from 296 to 1 709， and the isoelectric point range was from 4.33 to 9.58; 68 of the 116 genes could be mapped， and these 68 CcWD40 genes were unevenly distributed on 11 chromosomes， mostly located on chromosome 3; the phylogenetic tree divides the members of the pigeon pea CcWD40 family into 18 subfamilies. Although the introns of the CcWD40 gene structure differ greatly， they are relatively similar in the same branch of the evolutionary tree; collinearity analysis shows pigeon pea is the closest relative to soybean among these 3 model organisms; pigeon pea CcWD40 has multiple response elements， including stress response elements， developmental response elements and hormone response elements， such as abscisic acid response element （ABRE），salicylicacid response element （TCA-Element）， gibberellin response element （GARE-Motif）， etc. It can be seen that their expression is controlled by a complex regulatory network which may play an important role in abiotic stress; it is supposed that based on RNA-seq data analysis， the pigeon pea CcWD40 family genes significantly responded to the disposal of Methyl Jasmonate， in which 96 CcWD40 genes will express less while 20 ones express more and the CcWD40 genes located at the same branch of evolution share the similar responsive tendency. This study will provide important genetic resources and theoretical basis for further exploring the function of WD40 gene in regulating the synthesis of flavonoids and responding to abiotic stress.

Key words： Cajanus cajan;CcWD40;genome-wide identification;Methyl Jasmonate

木豆（Cajanus cajan）種植于半干旱熱帶地區，因其具有重要的營養價值和藥用價值而被廣泛關注。其不同組織部位均被用于傳統醫學，抗氧化、抗糖尿病、抗菌、DNA損傷保護和黃嘌呤氧化酶抑制特性已被證實。木豆的多功能性歸因于其富含的多種黃酮成分。然而，目前對于木豆黃酮生物合成途徑及其代謝調控機制的研究較少。

黃酮在水果、蔬菜、堅果、種子和花卉中發揮多種生物功能，包括幫助細胞抵抗紫外線輻射及植物病原體侵襲，作為植物與微生物相互作用中的信號分子參與花粉的生長發育及根瘤器官形成的調控，吸引傳粉者與影響花朵著色等。據報道，黃酮與人體健康密切相關，具有顯著抗氧化、抗病毒和抗腫瘤的生物活性，對治療糖尿病、痢疾和肝炎有顯著療效，其也被用于預防動脈硬化、治療心血管疾病等。

據報道，黃酮的生物合成主要來自苯丙烷代謝途徑，該途徑已在多種模式植物中證實［1］。MBW三聯復合物是黃酮類化合物合成關鍵酶基因的直接調控核心［2］。在這個三元復合體中，WD40作為復合體成員之一對于黃酮類化合物生物合成是必不可少且不可替代［3-4］，能增強復合物的活性［5］。擬南芥TTG1蛋白歸屬于WD40蛋白家族成員，TTG1-TT2-TT8形成復合體激活BANYULS（BAN）基因的表達來調控擬南芥種皮中黃酮的生物合成。TTG1通常作為bHLH的協同轉錄因子發揮作用，擬南芥TTG1能夠結合bHLH轉錄因子（EGL3、GL3、TT8），和MYB轉錄因子（MYB113或MYB114、PAP1、PAP2）形成三聯復合體來影響植物特異性組織中黃酮類化合物的積累，與TT2/TT8結合共同激活BANYULS（BAN）的轉錄［5］。

WD40蛋白質組成了1個多樣化的蛋白質超家族。WD40結構域一般由多個WD40 repeat組成，常以β-螺旋槳的結構形式存在。WD40 repeat是44～60個氨基酸殘基組成的重復單元，N端有1個WD（Gly-His）二肽，C端有1個WD（Trp-Asp）二肽［6］。WD40 repeat由1個四鏈反向平行的β-折疊構成，并通過氨基酸殘基構成的氫鍵網絡維持折疊結構的穩定性。通常5～8個WD40 repeat形成1個β-螺旋槳折疊結構，其中7個WD40 repeat形成的β-螺旋槳最為常見，也是理論上最理想的構型［6］。WD40蛋白一般只包含1個β-螺旋槳結構，部分WD40蛋白包含多個［7］。β-螺旋槳結構的穩定性主要通過槳葉之間的疏水作用力維持，且絕大部分β-螺旋槳結構域中還包含1個“尼龍搭扣”開關，用于進一步保證折疊的穩定性［8-9］。自首個WD40蛋白結構被鑒定以來，數十個WD40蛋白結構隨后被鑒定［10-12］。1個完整的β-螺旋槳至少需含4個重復的WD40結構域。G蛋白的β亞基共含7個WD40結構域，其中第一個和最后一個參與形成相同的片段，這可能增強β-螺旋槳結構的穩定性。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate， MeJA）是1種重要的植物激素，可觸發植物抵御害蟲和病原體［13-14］，還影響許多植物發育過程，例如花青素的積累［15］。MeJA還是1種植物信號調節物質，可以激活植物體內CHS基因的表達［16］，進而促進黃酮類化合物的合成。另外，JAZ蛋白是黃酮類化合物生物合成的負調控因子。茉莉酸信號導致JAZ蛋白的降解，MYB-bHLH復合體的釋放，并促進黃酮類化合物的生物合成［17］。

近些年，WD40基因相繼在許多物種得到鑒定和研究，如紫蘇、番茄、蘋果、草葺、水稻等，這些物種中的WD40基因參與花青素的合成調控。但是尚無在木豆中對于WD40基因的研究。本研究利用全基因組分析篩選并鑒定木豆CcWD40基因家族成員，全面分析CcWD40蛋白的進化歷程、基因結構、啟動子作用元件等，研究CcWD40響應茉莉酸甲酯的表達模式。本研究為進一步驗證木豆CcWD40基因的生物學功能及解析木豆黃酮合成代謝調控機制提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

木豆幼苗培養于東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室溫室，溫度設置為25℃，光周期設置為16h光照和8h黑暗。

1.2 實驗方法

1.2.1 木豆CcWD40基因的鑒定及其生物信息學分析

從Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）下載WD40蛋白質的隱馬爾可夫模型（PF0040），利用PF0040作為種子文件搜索木豆基因組數據庫篩選獲得木豆CcWD40基因家族的全部成員。為了驗證所篩選基因的準確性，使用擬南芥WD40蛋白質進行序列比對，選擇E-value值小于1×10-5的序列作為候選基因。根據基因在染色體上的分布將鑒定到的116個CcWD40蛋白命名為CcWD40-1至CcWD40-116。同時，通過ExPASy （https：//web.expasy.org/protparam/）分析CcWD40蛋白的理化性質，主要包括氨基酸數目、蛋白質分子量及等電點等。根據CcWD40基因的登錄號在NCBI數據庫中獲知其染色體位置信息，利用TBtools生物軟件繪制CcWD40基因家族在染色體上的分布。

1.2.2 木豆CcWD40基因的基因結構及啟動子功能元件預測

CcWD40基因外顯子和內含子相關基因結構信息通過基因組注釋信息獲得，為直觀展現CcWD40基因家族的基因結構特征，利用TBTools軟件進行可視化。木豆基因組數據庫檢索候選基因起始密碼子上游的2 kb基因組DNA序列，并利用Plantcare網站預測CcWD40基因啟動子順式作用元件和功能位點以探究木豆CcWD40基因家族的轉錄調控機制。

1.2.3 木豆CcWD40蛋白發育進化及共線性分析

為明確CcWD40蛋白發育進化及分類，從NCBI數據庫下載擬南芥AtWD40基因家族的全部成員，利用MEGA 5.1的NJ（Neighbor-joining）算法構建木豆和擬南芥WD40蛋白質系統發育樹，檢驗次數為1 000，獲得的進化樹利用iTOL（https：//itol.embl.de/）進行修飾美化。使用TBtools軟件中的MCscanX插件分析木豆、擬南芥、大豆和水稻基因組間的共線性關系，WD40家族基因突出顯示，并繪制基因組間的共線性圖譜。

1.2.4 木豆CcWD40基因在茉莉酸甲酯處理下表達模式分析

基于前期工作中茉莉酸甲酯處理木豆的轉錄組數據，分析116個CcWD40候選基因對茉莉酸甲酯的響應模式，通過FPKM（fragments per kilobase million）值以10為底的對數進行轉化，歸一化處理后繪制聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 木豆CcWD40基因家族鑒定及理化性質分析

通過全基因組篩選和生物信息學分析獲得116個CcWD40家族成員，根據基因在染色體上的分布依次命名為CcWD40-1～CcWD40-116。為了鑒定CcWD40家族成員的基本特征，對CcWD40蛋白的理化性質進行分析。結果為CcWD40家族成員的氨基酸數目在296～1 709之間，相對分子質量在7211.9～191948.85之間，等電點范圍為4.33～9.58（表1）。

2.2 木豆CcWD40基因家族的染色體定位

根據基因組注釋信息獲得CcWD40家族成員的染色體分布信息，從圖1中可以看出，68個CcWD40基因家族成員不均勻的分布在木豆的11個染色體上。

其中分布于第三號染色體上CcWD40家族成員數目最多，共包括19個成員；第十一號和第二號染色體上分布的成員相對較多，分別檢索到10個和9個成員；第五、六、八、九、十號染色體上分別檢索到3、5、6、7和4個成員；第一號和第四號染色體上均包含2個成員，僅有1個CcWD40家族成員（CcWD40-41）分布到第七號染色體上。

2.3 木豆CcWD40基因家族的基因結構

分析69個CcWD40基因的結構組成（內含子和外顯子的數量和分布），了解CcWD40蛋白的進化印記?；蚪Y構分析表明（圖2），CcWD40基因家族各成員之間的內含子數量及長度差異較大，在系統發育進化樹中位于同一分支的各成員之間的基因結構相似性較高。例如，CcWD40-52、CcWD40-53和CcWD40-54在進化樹中位于同一分支，均具有17個外顯子和18個內含子；CcWD40-12和CcWD40-13具有20個外顯子，在進化樹中位于同一分支。這些結果說明，在物種進化過程中地位相近的基因具有相似的基因結構。

2.4 木豆CcWD40基因家族的進化及分類

為了研究CcWD40蛋白的進化關系，構建了擬南芥AtWD40蛋白和木豆CcWD40蛋白的系統發育樹（圖3）。木豆CcWD40蛋白被分成18個分支（Group 1～Group 18），每一個分支的蛋白質數量都有顯著差異，其中Group 18家族成員最多。Group1、Group2、Group3、Group4、Group5、Group6、Group7、Group8、Group11、Group12、Group13、Group14、Group16、Group18分別包含5、4、2、2、3、2、3、2、2、4、9、3、7、17個成員；Group 9、10、15、17家族成員最少，僅包含1個成員。在每個Group中，木豆和擬南芥的WD40家族成員均有分布，這說明相較于擬南芥而言，木豆的WD40基因在進化過程中較為保守。

2.5 木豆CcWD40基因家族的共線性分析

為了探究CcWD40基因家族的進化機制，構建木豆與其他3種植物全基因組的共線性分析，包括2個雙子葉植物（擬南芥和大豆）和1個單子葉植物（水稻）。結果如圖4所示，木豆和水稻之間僅有2個共線性基因，木豆和擬南芥之間有23個共線性基因，木豆-大豆之間的共線性事件遠大于木豆-擬南芥和木豆-水稻，證實了木豆與大豆的進化距離較近。

2.6 木豆CcWD40基因家族的啟動子作用元件分析

為了探究CcWD40基因的調控機制，利用PlantCare數據庫在線分析了CcWD40基因轉錄起始點上游2 kb序列，以確定潛在的順式作用元件和功能位點。結果如圖5所示，在CcWD40基因的啟動子區域檢測到多種順式作用元件，包括脅迫響應元件、發育響應元件和激素響應元件（圖5a）。這些結果表明，它們的表達受到復雜的調控網絡控制。

對于脅迫相關順式作用元件，在52個CcWD40基因的啟動子中檢測到防御和脅迫響應元件（TC-rich repeats），在44個CcWD40基因的啟動子中檢測到低溫響應元件（LTR），在95個CcWD40基因的啟動子中檢測到缺氧誘導（ARE），在53個CcWD40基因的啟動子中檢測到干旱誘導相關的MYB結合位點（MBS），在1個CcWD40基因的啟動子中檢測到傷害響應元件（WUN Motif）。在這些與脅迫相關的順式作用元件中，MBS響應元件的頻率最高（在116個CcWD40啟動子中共檢測到53個MBS響應元件），其次是MYB、TC-rich repeats、LTR和WUN Motif。在CcWD40啟動子中發現了與激素相關的各種順式元件。脫落酸響應元件（ABRE）被發現存在于80個CcWD40啟動子上。74個CcWD40啟動子含有與MeJA相關的響應元件（CGTCA Motif和TGACG Motif），在116個CcWD40啟動子中共有74個MeJA響應元件。此外，在60個CcWD40啟動子中發現了生長素響應元件（AuxRE、AuxRR-core、TGA-box和TGA-element），在45個CcWD40啟動子中發現了水楊酸反應元件（TCA-element），在20個CcWD40啟動子中發現了赤霉素響應元件（GARE Motif）。

通過上述結果推測，CcWD40在參與眾多生理反應，并在非生物脅迫反應中起著重要作用。

2.7 CcWD40家族基因響應MeJA的表達分析

MeJA是植物次生代謝產物生物合成中重要信號誘導因子。為了探究可能調控木豆黃酮類物質的潛在CcWD40基因家族成員，通過RNA-seq數據分析CcWD40基因家族116個成員對MeJA的響應模式。結果顯示（圖6），CcWD40-14、CcWD40-15、CcWD40-16、CcWD40-17之間或CcWD40-18、CcWD40-19、CcWD40-20、CcWD40-21、CcWD40-22、CcWD40-23之間對MeJA激素處理的響應趨勢較為相似，而每一組基因在進化樹上的分類較為接近。由此可見對于進化關系相近的基因，對MeJA的響應趨勢也較為相近。

從整體看，對MeJA響應趨勢大體分為兩類，其中有96個CcWD40基因在前3個小時對MeJA的響應效果逐漸下降，其余20個會逐漸升高。在前一類CcWD40基因中，有16個基因呈現一直下降的趨勢，如CcWD40-52～CcWD40-55等；有47個CcWD40基因在之后的幾小時里轉變為了上升趨勢，如CcWD40-26～CcWD40-30等；有33個CcWD40基因在之后幾個小時里轉為為上升趨勢后，又再次下降，如CcWD40-104～CcWD40-106等。在前3個小時里會逐漸升高的20個CcWD40基因中，有5個基因會在之后一直保持上升趨勢，如CcWD40-103等；有14個CcWD40基因會在之后的幾個小時里轉變為下降趨勢，如CcWD40-107等；有1個CcWD40基因在之后轉變為下降趨勢后重新升高，如CcWD40-11。

3 討論與結論

3.1 討論

本研究共鑒定木豆116個WD40基因，與紅花（Flos carthami）（40個）、黑果枸杞（Lycium ruthenicum）（38個）、蓖麻（Ricinus communis）（182個）、桃（Prunus persica）（219個）等物種中鑒定的WD40基因數差異較大，這可能是由于木豆屬于豆科植物，而紅花、黑果枸杞、蓖麻、桃分別屬于菊科、茄科、大戟科和薔薇科，與上述植物親緣關系上距離較遠，特定的生長環境、次生代謝物和不同的形態特征都顯示木豆和這些植物在進化上發生了較大差異，而這些蛋白隨著植物的長期進化也發生了不同程度的改變，暗示木豆和大豆兩種植物具有類似的次生代謝物，而這些相關性以及這些植物是否還存在其他相近的功能還需要進一步的實驗探索。

本文分析結果發現木豆CcWD40蛋白的氨基酸數量、等電點等特性均存在差異，這與在許多植物中鑒定到的WD40蛋白一樣，例如黃堇（Corydalis pallida）、紅花（Flos carthami）等的WD40蛋白特性也存在差異。由于WD40蛋白的功能涉及生長發育、次生代謝物積累和環境適應等多種生物學過程，且參與不同生物學過程可能相互作用的蛋白也不盡相同，因此，木豆不同WD40蛋白可能是為執行不同的生物學功能進化形成的。

染色體定位揭示了CcWD40基因在木豆各染色體上的位置及數量分布?；蚪Y構分析表明CcWD40基因家族中各基因的差異顯著，但是根據進化樹分成的每個亞組中的基因相似度卻很大。啟動子響應元件分析可以初步了解特定基因對許多因素的響應，是研究植物基因功能的主要手段之一。木豆CcWD40基因的啟動子順式作用元件分析表明，木豆CcWD40基因家族響應多種激素信號，推測其會參與多種生理反應和非生物脅迫反應。

據相關類似報道，存在于細胞核和細胞質中的丹參WD40蛋白會對MeJA響應元件產生反應［18］。因此推測木豆CcWD40基因的表達也會對茉莉酸甲酯處理有所響應。根據其對MeJA的表達模式分析，木豆CcWD40基因具有響應MeJA處理的表達模式，這些結果清晰地顯示CcWD40基因顯著響應MeJA，推測可能與CcWD40啟動子順式作用元件中具有多個MeJA響應元件密不可分。而這些基因的功能驗證還需要通過實驗進一步研究。

3.2 結論

本研究系統鑒定和全面分析了CcWD40基因家族特征，多數CcWD40基因具有MeJA響應元件，基因表達顯著受到MeJA的調控。本研究為深入探討MeJA介導WD40參與黃酮的生物合成提供基礎數據，為未來的研究，如功能研究，調控機制研究等提供理論基礎。

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