新疆地區230例苯丙氨酸羥化酶缺乏癥患兒基因突變分析*

劉昱彤,馮子奕,薛淑媛,3△

1.新疆醫科大學公共衛生學院,新疆烏魯木齊 830011;2.烏魯木齊市婦幼保健院產前診斷中心,新疆烏魯木齊 830000;3.西北大學生命科學學院,陜西西安 710069

高苯丙氨酸血癥(HPA)屬于新生兒出生缺陷的一種,其病因是編碼苯丙氨酸羥化酶(PAH)或其輔酶四氫生物蝶呤(BH4)缺陷,導致血苯丙氨酸(Phe)在患兒肝臟中無法正常代謝。血液中堆積過量的Phe和旁路代謝產物產生的神經毒性作用會導致患兒逐漸發生不可逆的發育遲緩、智力障礙、癲癇和異常行為[1]。根據血Phe水平,將PAH缺乏癥分為經典型苯丙酮尿癥(PKU)、輕度PKU及輕度HPA[2]。PAH缺乏癥目前已成為我國新生兒遺傳代謝病中患病率最高的疾病[3]。對于此類疾病,臨床上已可防可治可控,治療方案因表型的不同而有所不同,經典型PKU與輕度PKU患兒需要使用特殊食品進行治療,而輕度HPA只需定期隨訪監測血Phe水平[1],因此明確HPA的分類不僅對精準治療至關重要,而且可以預測出生后的飲食方案并緩解患兒家長的心理壓力。本研究通過分析新疆地區230例PAH缺乏癥患兒的PAH基因變異情況,構建新疆地區PAH基因變異譜。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2015年1月1日至2023年2月28日于新疆烏魯木齊市婦幼保健院確診的230例PAH缺乏癥患兒納入研究,患兒均為出生滿72 h的新生兒,男121例、女109例,排除BH4缺乏癥、早產患兒、靜脈輸入營養液所致的暫時性HPA及肝功能異常和其他遺傳代謝性疾病等導致的繼發性HPA?；純罕O護人對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經烏魯木齊市婦幼保健院醫學倫理委員會批準(XJFYLL2019035)。

1.2方法

1.2.1篩查方法 對出生滿72 h并充分哺乳6～8次的新生兒,用75%乙醇消毒后使用一次性采血針刺于足跟內或外側,深度<3 mm,棄去第1滴血,采集4個直徑>8 mm的血斑,自然晾干,置4～8 ℃保存。采用熒光法及串聯質譜法進行血Phe水平及Phe與酪氨酸(Tyr)比值(Phe/Tyr)測定,初篩及復查血Phe水平>120 μmol/L(2.0 mg/dL)為陽性。將篩查陽性者召回并采血,若血Phe水平仍>120 μmol/L則進行尿蝶呤譜分析以區分PAH缺乏癥和BH4缺乏癥。

1.2.2診斷標準 參考《高苯丙氨酸血癥的診治共識》[2],根據血Phe水平對BH4的治療反應分為BH4反應性和BH4無反應性PAH缺乏癥。經BH4負荷后,任意時間點血Phe水平較負荷前基礎值下降≥30%者為BH4反應性PAH缺乏癥,<30%者為BH4無反應性PAH缺乏癥。通常根據治療前的血Phe最高水平或攝入足夠天然蛋白質情況下的血Phe水平,將PAH缺乏癥分為經典型PKU:血Phe水平≥1 200 μmol/L;輕度PKU:血Phe水平為360～1 200 μmol/L;輕度HPA:血Phe水平為120～<360 μmol/L。

1.2.3PAH基因分析 用EDTA抗凝管抽取患兒及父母的外周靜脈血2～3 mL,磁珠法提取 DNA,提取物質控達標后,進行文庫構建,應用高通量測序技術對PAH的相關基因進行直接測序。在BIOPKU數據庫和HGMD數據庫將變異位點輸入進行查閱。檢測到的全部變異位點按照ACMG指南進行致病性分析。使用生物信息學軟件MutationTaster、SIFT、PolyPhen_2對變異基因蛋白功能的致病性進行預測。對發現的致病突變進行PCR擴增及Sanger測序,驗證高通量測序的結果,并對患兒父母采用Sanger法進行目標基因突變驗證。

1.3統計學處理 采用SPSS25.0統計軟件進行數據分析。計數資料以例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同表型PAH缺乏癥患兒的一般資料 納入研究的230例PAH缺乏癥患兒中,經典型PKU 42例(18.26%),其中男25例、女17例,治療前血Phe平均水平為2 048.19 μmol/L;輕度PKU 22例(9.65%),其中男15例、女7例,治療前血Phe平均水平為660.49 μmol/L;輕度HPA 166例(72.17%),其中男81例、女85例,治療前血Phe平均水平為180.12 μmol/L。見表1。

表1 不同表型PAH缺乏癥患兒的一般資料

2.2PAH基因變異情況 230例PAH缺乏癥患兒的460個等位基因位點中,共檢出441個PAH基因變異位點,總檢出率為95.87%,其中,227例患兒檢測到2個變異位點,2例患兒僅檢測到1個變異位點,1例患兒檢測到3個變異位點;復合雜合變異217例,純合變異10例。涉及91種PAH基因變異,包含錯義突變[84.81%(374/441)]、無義突變[7.26%(32/441)]、剪接突變[4.99%(22/441)]和移碼突變[2.95%(13/441)]。變異位點分布在外顯子2至外顯子12,內含子2、內含子4、內含子7、內含子8,內含子10至內含子13;高頻分布在外顯子2[24.04%(106/441)]和外顯子7[23.13%(102/441)],高頻分布合計占比47.17%,見圖1。

PAH基因變異頻率由高到低依次為c.158G>A[23.39%(102/441)]、c.728G>A[11.70%(51/441)]、c.688G>A[5.05%(22/441)]、c.721C>T[3.90%(17/441)]、c.611A>G[3.67%(16/441)]、c.1238G>C[3.21%(14/441)],以上PAH變異總占比為50.92%。見表2。

表2 新疆地區PKU患者PAH基因變異情況

2.3三種不同表型患兒的PAH基因變異位點分析 PAH缺乏癥的基因型在人群中的分布有所不同,代謝表型也有很大差別。本研究將新疆地區PAH基因變異頻率較高的18種類型進行統計分析后得出,c.158G>A、c.728G>A、c.688G>A、c.721C>T、c.1068C>A、c.1301C>A、c.331C>T和c.782G>A共8種突變的頻率在PAH缺乏癥不同表型之間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。

經典型PKU患兒的主要變異位點為c.728G>A、c.331C>T和c.782G>A;輕度PKU患兒的主要變異位點為c.721C>T、c.1068C>A和c.1301C>A;輕度HPA患兒的主要變異位點為c.158G>A和c.688G>A。5種變異位點僅在輕度HPA中被檢出,分別為c.158G>A、c.688G>A、c.1174T>A、c.320A>G和c.1139C>T。見表3。

表3 新疆地區常見PAH基因變異位點在不同表型中的分布[n(%)]

2.4特殊案例分析 本研究中發現1例特殊案例,先證者為1名回族男性,出生體重3 310 g,初篩血Phe水平為559.2 μmol/L,復篩血Phe水平為1 858.0 μmol/L,臨床診斷為經典型PKU。檢出c.1222C>T和c.838G>A的雜合突變,Sanger家系驗證報告顯示,先證者c.1222C>T位點變異遺傳自母親,但先證者的父、母c.838G>A位點均為野生純合子,c.838G>A可能為先證者新發突變。見圖2～4。

圖2 患兒Sanger測序驗證圖譜

圖3 患兒父親Sanger測序驗證圖譜

圖4 患兒母親Sanger測序驗證圖譜

3 討 論

HPA是由于PAH或BH4缺乏所引起的單基因隱性遺傳病[4],目前已明確相關致病基因有6種,分別為PAH、GCH1、PTS、SPR、PCBD、QDPR和DNAJC12[5-6]。不同民族或地域間PAH基因高頻變異位點的差異性使PAH缺乏癥成為一種具有極強遺傳異質性的譜系疾病。本研究通過分析新疆地區PAH缺乏癥基因變異類型,初步評估基因型與表型的相關性,為表型預測提供一定依據,有助于新生兒HPA的管理及預后評估。

本研究回顧性分析了230例PAH缺乏癥PAH基因的變異類型,點突變以錯義突變(84.81%)為主,與既往研究基本一致[7],其次為無義突變(7.26%)、剪接突變(4.99%)和移碼突變(2.95%)。突變位點集中分布在外顯子2和外顯子7上,分別占24.04%和23.13%,歐洲PAH基因高頻變異區域集中在外顯子12和內含子11上,中國PAH基因高頻變異區域集中在外顯子3至外顯子7和外顯子10至外顯子12[7],說明PAH基因變異位點的分布既存在種族、地域的差異性又具有相似性。

本研究的新疆地區230例PAH缺乏癥患兒中,最常見的PAH基因變異位點為c.158G>A(23.39%)、c.728G>A(11.70%)、c.688G>A(5.05%)、c.721C>T(3.90%)、c.611A>G(3.67%)、c.1238G>C(3.21%)。西北地區PAH基因變異高頻位點為c.728G>A(14.00%)、c.611A>G(5.58%)、c.1068C>A(4.95%)、c.1238G>C(4.74%)、c.442-1G>A(4.32%)、c.1197A>T(4.11%)和c.721C>T(4.11%)[8],與本研究常見變異位點相似,但排序不同,本研究PAH基因變異頻率最高的為c.158G>A(23.39%),與青島[9]和石家莊[10]的研究報道一致。新疆地區幅員遼闊、民族眾多,不同民族有其獨特的PAH基因變異譜,而且地區之間存在差異。SU等[11]的研究顯示,新疆南部地區少數民族患兒常見的PAH基因變異位點為c.311C>A(8.41%)和c.1238G>C(7.96%),但本研究中c.311C>A(0.46%)和c.1238G>C(3.21%)檢出率較低,可能與新疆南北部少數民族構成比不同有關。與何江等[12]的71例新疆地區PAH基因檢測結果比較后發現,c.728G>A、c.158G>A與c.611A>G是新疆地區普遍存在的PAH基因高頻變異位點,但本研究中c.688G>A與c.1174T>A檢出率較高,原因可能為本研究中包含民族較全面,樣本量較大。在既往新疆地區研究中c.688G>A作為PAH基因高頻位點未被報道過,有此變異位點者在本研究的少數民族患兒中占比較多,其中1例患兒父母為近親結婚。以上研究結果表明,新疆地區PAH基因變異譜存在地區分布和民族差異,提示c.688G>A和c.1174T>A可能是新疆地區特有變異位點。

研究顯示,全球表型分布情況為經典型PKU占62%,輕度PKU占22%,輕度HPA占16%;中國的分布情況為經典型PKU占62.1%,輕度PKU占27.6%,輕度HPA占10.3%[7]。我國各地PAH缺乏癥的表型分布不一,福建省經典型PKU占15.05%,輕度PKU占21.51%,輕度HPA占63.44%[13];浙江省經典型PKU占43.57%,輕度PKU占33.10%,輕度HPA占23.33%[14]。本研究結果中,新疆地區經典型PKU占18.26%,輕度PKU占9.65%,輕度HPA占72.17%,新疆地區輕度HPA占比明顯高于其他地區。

PAH缺乏癥的基因型與表型存在密切聯系,在世界各地的分布具有異質性[15-17]。不同表型PAH缺乏癥患兒的PAH基因變異的高頻位點不同,本研究首次分析了新疆地區基因型與表型的相關性,研究結果顯示,經典型PKU主要高頻變異為c.728G>A、c.331C>T和c.782G>A。c.158G>A、c.688G>A;輕度PKU高頻變異為c.721C>T、c.1068C>A和c.1301C>A;輕度HPA高頻變異為c.158G>A和c.688G>A;3種表型的高頻變異有明顯差異。此外,c.1174T>A、c.320A>G和c.1139C>T均只在輕度HPA患兒中檢出,證明以上變異與輕度HPA存在一定關聯。甘肅[18]和重慶部分地區[19]的研究均顯示c.728G>A與輕度PKU及經典型PKU相關,而本研究中c.728G>A在經典型PKU患兒中檢出頻率最高,在輕度PKU患兒中檢出c.728G>A的頻率低于輕度HPA患兒。

本研究中c.158G>A變異頻率為23.39%,是新疆地區最常見的變異位點,而且僅在輕度HPA患兒中被檢出,可作為新疆地區輕度HPA患兒的標志性變異位點。有研究表明,HPA的致病性與患兒體內酶活性高低有關[20],c.158G>A變異導致患兒體內酶活性降低,殘余酶活性降低為正常酶活性的79%,患兒仍有一定Phe代謝能力[21],因此臨床上癥狀較輕,多為輕度HPA,但當c.158G>A與不同PAH基因變異位點組合為復合雜合狀態時,可引起臨床表型發生改變。新疆地區的經典型PKU、輕度PKU及輕度HPA患兒具有獨特基因型,分析基因型與表型之間的關聯性,對不同的PAH基因變異對酶活性的影響進行更為深入的功能研究與隨訪,可以提供更全面的遺傳學信息。

綜上所述,本研究通過分析新疆地區230例PAH缺乏癥患兒的PAH基因,構建新疆地區的PAH基因變異譜發現新疆地區以輕度HPA患兒為主,多為復合雜合突變,高頻變異位點為c.158G>A、c.728G>A、c.688G>A、c.721C>T、c.611A>G和c.1238G>C。明確了3種不同表型的高頻變異位點,在經典型PKU、輕度PKU和輕度HPA患兒中均觀察到具有特異性的PAH基因型,基因型與表型數據的結合將有助于臨床醫生快速明確疾病類型,更好地改善患兒預后,為精準產前診斷提供理論依據。