發酵乳桿菌對滅菌豆漿中晚期糖化終末產物形成的影響

張霖，肖柯，王文悅，易弛，余帆，肖俊峰，樊鑫，朱曉青，李琴，周夢舟，穆楊

（湖北工業大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

隨著社會的進步，人們越來越關注飲食健康。晚期糖化終末產物（advanced giycation end products，AGEs）是一組在蛋白質、脂肪酸或核酸的氨基基團與還原糖的醛基之間發生非酶性糖基化反應（又稱美拉德反應）所形成的一系列具有高度活性終產物的總稱，其結構具有高度異質性[1]。然而，AGEs 容易積聚在機體的不同組織纖維、器官和循環系統中，對機體造成氧化損傷，進而引發糖尿病、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化等疾病。當在飲食中攝入過多的精細碳水或糖類物質后，體內會保持一個高糖的環境，進而在一系列復雜的酶代謝反應中形成內源性AGEs，其反應條件相對溫和且形成周期較長。已有研究表明，內源性AGEs 是一種強毒性分子，可加速細胞死亡，從而導致器官損傷[2]。外源性AGEs（dietary advanced glycation end products，dAGEs）是食物中的AGEs 通過胃腸道消化吸收進入人體，學術界普遍認為攝入dAGEs 會增加血液中AGEs 的含量[3]。

豆漿是大豆的水提取物，外觀與牛奶相似，豆漿含有優質蛋白質、必需脂肪酸和大量維生素，以蔗糖、毛蕊花糖等為代表的碳水化合物，不含膽固醇和乳糖。在食品加工過程中，豆漿蛋白可能發生降解、聚集和交聯等構象和結構的變化，影響蛋白的功能性[4]。豆漿作為發酵食品的良好底物，可以通過發酵提高豆漿的品質。近幾年，有不少研究發現經乳酸菌發酵后得到的化合物，在體外蛋白非酶糖化模型中具有較好的抗AGEs 能力。Zhou 等[5]發現發酵豆漿具有較好的延緩氧化、老化的作用，對D-半乳糖誘導衰老小鼠具有抗氧化作用，Peng 等[6]在研究中認為，混合菌發酵顯著改變了豆漿的黏性、彈性等流變特性，豐富了發酵豆漿的口感，顯著提高了發酵豆漿的營養特性和抗氧化能力?；诖?，本文利用發酵乳桿菌制備發酵豆漿，以豆漿和滅菌豆漿作為對照，進行抗AGEs 能力、抗氧化特性、感官品質及營養價值等質量標準和蛋白結構變化的研究，以期提高豆漿的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆（食品級）：市售；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-HCl）]、異黃酮、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（均為分析純）：中國醫藥集團有限公司；發酵乳桿菌（L.fermentum）：保藏于湖北工業大學湖北省食品發酵工程技術研究中心。

1.2 儀器與設備

L18-Y31 豆漿機：九陽股份有限公司；ZWYR-2102恒溫振蕩培養器：上海智城分析儀器制造有限公司；CT15RE 高速冷凍離心機：日本工機株式會社；DVB/CRA/PDMS 固相微萃取頭：美國Supelco 公司；1260 高效液相色譜、7890B-5977B 氣相色譜-質譜聯用儀：安捷倫科技有限公司；UV-1601 紫外可見分光光度計：北京瑞麗分析儀器有限公司；84-1A 磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；Nexus470 傅里葉變換紅外光譜儀：美國Nicolet 儀器；HH.W21-Cr600 電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵豆漿的制備

稱取一定量的黃豆，洗滌，按料液比1∶5（g/mL）用去離子水于4 ℃浸泡12 h。將黃豆撈出瀝干，水∶干豆=8∶1（質量比）用豆漿機榨汁并煮熟。煮熟的豆漿通過40 目篩過濾，分裝至已滅菌的容器中。豆漿：4 ℃冰箱保存；滅菌豆漿：高溫滅菌（121 ℃殺菌15 min）[7]；發酵豆漿：冷卻后，加入發酵乳桿菌（豆漿與乳酸菌的質量比為100∶1），置于37 ℃恒溫振蕩培養器中發酵24 h，4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 熒光AGEs 的測定

將豆漿組、滅菌豆漿組和發酵豆漿組分別取一部分進行離心（8 000 r/min，30 min），以除掉大分子蛋白，取上述上清液200μL 加入到黑色96 塑料微孔板，每組保持3 個平行，使用紫外可見分光光度計，在激發/發射波長分別為370 nm/440 nm 和335 nm/385 nm，激發和發射帶寬均為5 nm 的條件下，測量每組反應溶液中熒光AGEs 和戊糖素的形成含量[8]。AGEs 或戊糖素形成的抑制率（R，%）的計算公式如下。

R=[1-（F試驗組-F試驗空白組）/（F對照組-F對照空白組）]×100

式中：F試驗組為陽性對照[氨基胍（amino guanidine，AG）+牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）+葡萄糖（glucose，Glu）]或試驗組[乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）+BSA+Glu]的熒光值；F試驗空白組為陽性對照[AG+BSA+磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered salin，PBS）]或試驗組（LAB+BSA+PBS）的熒光值；F對照組為BSA+Glu的熒光值；F對照空白組為BSA+PBS 的熒光值。

1.3.3 抗氧化活性和總酚含量的測定

參考Li 等[9]的方法，用無水乙醇配制0.2 mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶液，樣品溶液與DPPH 溶液等體積渦旋混合，在室溫下避光反應30 min，在517 nm 波長下測量吸光度A1。將等量的樣品溶液與無水乙醇混合，在517 nm 波長下測量吸光度A2。將相同體積的DPPH 溶液與純水混合，在517 nm 波長下測量吸光度A3。DPPH 自由基清除率（Q，%）的計算公式如下。

Q=[1-（A1-A2）/A3]× 100

用福林酚法測定總酚含量[10]，取1 mL 樣品溶液與0.5 mL 福林酚試劑混合均勻，反應5 min 后加入1.5 mL 7.5% Na2CO3溶液，用超純水定容至6 mL，搖勻，室溫下避光反應30 min，在760 nm 處測量吸光度。按上述方法分別取2、4、6、8、10μg/mL 沒食子酸標準溶液測量吸光度，繪制沒食子酸標準曲線（0～10μg/mL）。

1.3.4 發酵豆漿蛋白的提取

參照夏佳恒[11]的方法并稍作修改。將豆漿pH 值調至8.0，與Tris-HCl 溶液以料液比1∶1（g/mL）混合，再加入等體積的正己烷溶液，置于磁力攪拌器上4 ℃充分混勻4 h，再經過8 000 r/min 離心30 min，取中間澄清溶液，記為豆漿蛋白溶液，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，收集的溶液在-20 ℃保存，備用。

1.3.5 發酵豆漿蛋白結構表征

將孵育后的樣品上清溶液放入8 000 Da 透析袋，在PBS 溶液中充分透析24 h 以去除游離葡萄糖。透析完成后，將樣品冷凍干燥成厚度均勻的干片，用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）儀測量，并將干片放在FTIR 附件上掃描。采用OMNIC 軟件記錄紅外光譜：測量范圍為4 000～400 cm-1，波長精度為0.01 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32，環境溫度為25 ℃。利用傅里葉反褶積、二階導數求導和高斯曲線對1 700～1 600 cm-1的峰進行擬合，根據擬合結果，利用峰面積計算蛋白質各二級結構的相對含量[12]。

1.3.6 表面疏水性的測定

采用8-苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法監測豆漿發酵前后對表面疏水性的影響。稱取適量ANS，完全溶解于二甲基甲酰胺溶液中，制得濃度為30μmol/mL 的ANS 溶液。樣品與ANS 溶液等體積混合，在25 ℃避光條件中反應30 min。掃描記錄熒光激發波長為380 nm，發射波長為390～650 nm，激發和發射狹縫寬度為5 nm。所得的測量光譜被調整為空白值。

1.3.7 大豆異黃酮成分分離和含量測定

豆漿中大豆異黃酮的分離和定量采用高效液相色譜檢測法[13]。采集的豆漿樣品凍干至粉末狀，精確稱量0.1 g 粉末，溶于6 mL 80%甲醇溶液，超聲提取異黃酮2 h，然后13 000 r/min 離心5 min，上清液用0.22μm微孔濾膜過濾。采用梯度洗脫的方式對異黃酮進行定量檢測。檢測條件：進樣量20μL；流速1 mL/min；選用YMC-PackODS-AMC18（250 mm×4.6 mm×5μm，12 nm）色譜柱；柱溫25 ℃；二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）檢測波長254 nm；流動相0.1%乙酸和0.1%乙酸乙腈。按照GB/T 26626—2011《動植物油脂水分含量測定卡爾費休法（無吡啶）》設置梯度洗脫條件。

標準曲線的建立：準確稱取大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、大豆苷元、染料木素、黃豆黃素標準品各1 mg，分別溶于甲醇溶液，定容至10 mL，即為標準液，儲存在4 ℃備用。取適量的大豆異黃酮標準液，用甲醇按梯度稀釋，制作不同濃度的標準工作液，上機進行檢測分析。用每種標準品的質量濃度（x）和峰面積（y）繪制線性方程，并進行回歸分析。

1.3.8 揮發性風味成分的測定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（head sead solid phase microextractions-gas chromatography-mass spectormetry，HS-SPME-GC-MS）測定揮發物。準確稱取豆漿20 mL、5 g 氯化鈉置于40 mL 頂空進樣瓶，加入一顆攪拌子，用帶有橡膠隔墊的瓶蓋密封。將其放在45 ℃的電熱恒溫水浴鍋中，預熱10 min，平衡20 min，用50/30μm DVB/CAR/PDMS 纖維針插入頂空瓶中，距離液面1 cm，萃取風味化合物30 min。隨后，將針頭緩慢插入注射口，250 ℃下解吸5 min。

參考馮笑笑[14]的方法設置GC-MS 分析條件：色譜柱HP-5MS（30 m×250μm×0.25μm）。升溫程序：起始溫度40 ℃保持3 min，以6 ℃/min 升溫至100 ℃，再以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持7 min。載氣：氦氣，流速1.3 mL/min；不分流。MS 條件：電子電離（electron impact，EI）；離子源溫度230 ℃；電子轟擊能量70 eV；離子掃描范圍m/z 33～500；全掃描模式。

揮發性風味物質定性定量分析：經美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）11 標準質譜庫進行檢索、定性定量，采用峰面積進行相對定量。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3 次，結果以平均值±標準差表示，數據采用SPSSv21.0 分析，在P＜0.05 時認為差異有統計學意義。利用OrigionPro 8.0 繪圖。

2 結果與分析

2.1 豆漿中AGEs 含量變化

熱加工是豆漿生產過程中必不可少的環節，商業豆漿在生豆漿包裝前或包裝后還需經過巴氏殺菌或超高溫處理。高溫處理用于殺死病原體和變性抗營養因子，如胰蛋白酶抑制劑和脂氧合酶，可以確保微生物安全、提高消化率并延長產品的保質期[15]。熱處理會促進還原糖與蛋白質之間的糖基化反應，產生糖基化產物和AGEs。AGEs 可通過阻斷賴氨酸殘基、改變消化率、掩蓋或產生過敏原而降低蛋白質的營養價值[16]。豆漿中AGEs 含量如圖1 所示。

圖1 豆漿中AGEs 含量Fig.1 AGE content in soybean milk

由圖1 可知，與豆漿相比，滅菌豆漿的AGEs 熒光強度均升高，戊糖素與總AGEs 均增長了25%。再經發酵乳桿菌發酵后，發酵豆漿AGEs 的熒光強度較滅菌豆漿降低了12%～17%，相較于豆漿增長了5%～9%。

2.2 發酵對豆漿蛋白結構的影響

2.2.1 二級結構

豆漿蛋白的二級結構對其物理化學性質和功能具有重要影響。α-螺旋結構是豆漿蛋白主要的二級結構之一，其穩定性和可消化性高。β-折疊具有良好的乳化、發泡和凝膠性質，豆漿蛋白的二級結構與酸堿度、溫度、蛋白濃度等因素有關[17]。豆漿經滅菌、發酵后的蛋白二級結構如圖2、表1 所示。

表1 豆漿蛋白二級結構含量Table 1 Secondary structure content of soybean milk protein%

圖2 豆漿蛋白的紅外光譜Fig.2 Infrared spectrometry of soybean milk protein

由圖2、表1 可知，與豆漿蛋白相比，經滅菌處理后的豆漿蛋白二級結構均發生顯著變化，其中α-螺旋和β-折疊主要被破壞。β-轉角呈現細微上升的趨勢，無規卷曲呈現細微下降的趨勢。發酵豆漿蛋白中的β-轉角呈現細微下降的趨勢，無規卷曲呈現細微上升的趨勢。結果表明，滅菌豆漿經發酵后，減少了對蛋白二級結構的破壞，增長的α-螺旋轉變成β-折疊和無規卷曲，使蛋白結構發生改變，變得更加靈活和松散。

2.2.2 表面疏水性

ANS 是一種用于蛋白質研究的熒光染料，已廣泛用于監測暴露的蛋白質疏水斑塊及其折疊中間體、蛋白質錯誤折疊和表面疏水基團的存在[18]。ANS 結合到蛋白質表面或膜的非極性區域時，流動性受到限制，導致熒光發射最大值的藍移和熒光強度的增加。豆漿蛋白的表面疏水性主要取決于蛋白質表面的氨基酸殘基的組成和分布。具體而言，富含疏水性氨基酸殘基（如烷基、苯環等）的蛋白表面通常具有較高的疏水性。相反，富含親水性氨基酸殘基（如羥基、羧基等）的蛋白表面通常具有較高的親水性。豆漿蛋白表面的疏水性對其在食品加工中的乳化、穩定、發泡等性質有著重要的影響。除了影響豆漿蛋白的物理化學性質外，豆漿蛋白表面疏水性還對其生物活性和免疫學特性產生影響。近年來的研究表明，豆漿蛋白表面的疏水性能夠影響豆漿蛋白與消化酶的相互作用，從而影響豆漿蛋白的消化和生物利用率[19]。豆漿經滅菌、發酵后的表面疏水性如圖3 所示。

圖3 豆漿蛋白的表面疏水性測定Fig.3 Determination of surface hydrophobicity of soybean milk protein

由圖3 可知，豆漿經滅菌后的表面疏水性明顯升高，這可能是因為豆漿蛋白受熱后發生聚集，結構展開，內部的疏水性基團被暴露，與ANS 結合的程度升高，使得熒光強度升高。經發酵后，熒光強度明顯降低，聚集的蛋白被酶水解、疏水基團被保護或隱藏。但是，發酵豆漿蛋白的表面疏水性比豆漿蛋白的表面疏水性高，可能是因為發酵形成新的疏水肽，這與Rui等[20]的研究結果一致。

2.3 發酵對豆漿功能性質的影響

2.3.1 抗氧化特性

各樣品組的DPPH 自由基清除能力和總酚的含量如圖4 所示。

圖4 豆漿的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of soybean milk

由圖4 可知，滅菌豆漿的抗氧化性最好，清除DPPH 自由基的能力達到66.86%，比發酵豆漿高8.75%，比豆漿高11.22%。滅菌豆漿的總酚含量較高，這可能與豆漿高溫滅菌中因發生美拉德反應而產生的棕色類黑素有關，而美拉德反應是抗氧化性增強的原因。發酵乳桿菌發酵豆漿后降低了滅菌豆漿中的抗氧化活性，另外Mirlohi 等[21]證明豆漿發酵過程中生育酚的破壞是發酵后大豆產品抗氧化能力降低的主要原因。

2.3.2 異黃酮的生物轉化

在大豆的不同生物活性成分中，異黃酮是重要成分之一。研究已驗證它們具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病和植物雌激素的特性。異黃酮的種類很多，其中結合型的糖苷包括黃豆苷、染料木苷和大豆苷，游離型的苷元為豆黃素、染料木素和大豆素。據報道，糖苷和苷元都具有重要的生理活性，但苷元由于分子量較低，疏水性較高，容易在小腸中被吸收，在醫學研究中的治療效果最好[22]。豆漿異黃酮含量見圖5。

圖5 豆漿異黃酮含量Fig.5 Isoflavone content of soybean milk

由圖5 可知，豆漿中異黃酮含量為262.38μg/mL，其中糖苷總含量為202.81 μg/mL（染料木苷含量為113.60 μg/mL），苷元總含量為59.57 μg/mL（大豆苷元含量為15.78 μg/mL，染料木素含量為23.05 μg/mL）。滅菌后，豆漿中異黃酮含量發生了細微的變化，含量為274.43 μg/mL，其中糖苷總含量為188.15 μg/mL（染料木苷含量為102.48 μg/mL），較豆漿中含量顯著降低（P＜0.05），苷元總含量為86.28 μg/mL（大豆苷元含量為24.41 μg/mL，染料木素含量為40.91 μg/mL），較豆漿中含量顯著升高（P＜0.05）。發酵后異黃酮含量明顯升高，總含量為351.83 μg/mL，苷元總含量顯著增加，為241.80 μg/mL（P＜0.05），糖苷和苷元分別占異黃酮含量的31.27% 和68.73%，苷元型異黃酮比例增大。結果表明，加熱引起的糖基化反應導致了異黃酮類型向苷元型轉化，發酵對豆漿的異黃酮生物轉化、抗氧化活性有明顯的提升作用。

2.4 發酵對豆漿揮發性風味物質的影響

豆漿含有70 種以上揮發性風味成分，不同的風味成分具有不同的風味特征[23]。影響豆漿接受度的主要屬性之一是其獨特的風味，主要表現為青草味、油脂味、果味、黃瓜味等。為了探究發酵對豆漿中豆類揮發性風味物質含量的影響，通過HS-SPME-GC-MS 從豆漿中定性定量鑒定出15 種典型的風味化合物，具體如表2 所示。

表2 典型風味化合物含量Table 2 Content of typical flavor compound

由表2 可知，1-辛烯-3-醇、正己醛、辛醛、苯甲醛等揮發性化合物，在豆漿、滅菌豆漿和發酵豆漿中的風味含量中存在明顯差異。

實際制作出來的豆漿風味清淡，還有一些黃豆的香氣，再結合上述15 種化合物的氣味含量和氣味特征，分別繪制了3 種豆漿中氣味活性成分的分布雷達圖，如圖6 所示。

圖6 豆漿風味特征Fig.6 Flavor features of soybean milk

由圖6 可知，青草味在3 種豆漿中所占比例均最高。其中，豆漿中青草味風味特征最明顯，壬醇所呈現的果味微乎其微，其他風味占比較均勻；滅菌豆漿中青草味的強度明顯弱于豆漿，美拉德反應促使豆漿的焦糖味和油脂味明顯增加，還出現微量香甜的果味；發酵豆漿會產生有機酸，從而導致其青草味也明顯減弱[25]。

3 結論

以豆漿為基質，將乳酸菌摻入豆漿后，低聚糖發酵產生的大量短鏈脂肪酸不僅可以作為乳酸菌的能量來源，還可以提高產品營養價值。結果表明，發酵乳桿菌對滅菌豆漿進行發酵后，顯著減少了由加熱造成的美拉德反應（或蛋白非酶糖化反應）生成的AGEs 含量，最高可降低17% 的AGEs；高溫滅菌造成豆漿蛋白質的結構展開，蛋白質二級結構中的無規卷曲和β-折疊向α-螺旋和β-轉角轉變，蛋白質三級結構中的疏水基團被暴露。然而，經發酵后的豆漿蛋白質結構變得更加舒展，α-螺旋向無規卷曲和β-折疊轉變，疏水性降低37%；發酵的豆漿表現出較好的DPPH 自由基清除能力和較高的總酚含量，這是由于發酵豆漿中異黃酮含量增加和異黃酮類型向苷元型轉化，其中，異黃酮含量較發酵豆漿增加了77.40μg/mL，苷元型異黃酮比例從22.70%增加到68.73%。本研究結果可為乳酸菌在豆漿中的應用提供參考。