阿奇霉素急性暴露對斑馬魚幼魚的毒性效應

蒲 倩,張尚祎,陳 晨,劉興成,王慧利,錢秋慧(蘇州科技大學環境科學與工程學院,江蘇 蘇州 215009)

阿奇霉素(AZM)屬于大環內酯類抗生素,由于AZM 的大規模生產和使用,導致其通過各種途徑排放到水環境中并持續積累.全球各國的市政污水、地表水以及地下水等介質中都檢測到了AZM的存在[1-3].

抗生素的過量使用和不適當的排放方式可能導致其在水環境中富集,并誘發生態健康風險[4].抗生素進入人體后也會對健康造成不良影響.流行病學研究表明,長期接觸抗生素與兒童患特應性皮炎、過敏、哮喘、幼年特發性關節炎和神經發育障礙的風險增加有關[5].一些研究已證實,抗生素對魚類產生的影響包括氧化應激、脂質和葡萄糖代謝紊亂、免疫抑制以及遺傳毒性[6-9].現有研究表明,在小鼠中,通過喂食AZM 能降低短鏈脂肪酸和膽汁酸的含量,最終導致脂肪合成增加[10];斑馬魚幼魚暴露于梯度濃度AZM 后,會出現肝損傷、肝臟區域大小改變、肝組織透明度下降和肝組織脂質堆積等病變[11],此外,AZM 的暴露還可以引起斑馬魚幼魚明顯的心臟毒性[12].關于AZM 毒理學效應的研究較少且不夠全面.因此,本文選用斑馬魚作為模式生物,旨在全面評估AZM 急性暴露對斑馬魚幼魚的潛在毒性影響.

1 材料與方法

1.1 動物實驗

野生型斑馬魚(AB 系)購自中國武漢斑馬魚研究中心,經3 周馴化后進行育種.將所有成年斑馬魚雌雄分開置于斑馬魚養殖系統中,飼養條件為:28°C,pH(7.2±0.2).光照周期為14h/10h(光/暗),每天喂食兩次豐年蝦.

1.2 實驗試劑及儀器

主要試劑:阿奇霉素二水合物(CAS:83905-01-5,99.9%)購于上海梯希愛化成工業發展有限公司;丙酮(CAS No.67-64-1,99.9%)和無水乙醇均購于上海聯試化工試劑有限公司;PBS 粉末和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性檢測試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司;BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術有限公司.

主要儀器:斑馬魚養殖系統(上海海圣生物實驗設備有限公司);斑馬魚行為分析儀器(Danion Vision,荷蘭 Noldus);立體熒光顯微鏡(Nikon, Tokyo,Japan);Thermo 全波長酶標儀(美國賽默飛公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚飼養及胚胎收集 斑馬魚的飼養操作,依照先前研究所述[13].斑馬魚生長3 個月齡即可性成熟,從養殖槽中選取成年斑馬魚4～6 對,提前一天晚上將雌雄斑馬魚按照1:1 的比例置于產卵器中,利用插板隔開放置一晚.第二天早上開燈將透明插板取下,刺激斑馬魚產卵.挑選優質胚胎,6h 后分別暴露于控制組、AZM 濃度梯度組(4mg/L、8mg/L 和16mg/L).每隔24h 更換1 次暴露藥液,以確保維持所需的暴露濃度,并持續暴露胚胎直至實驗結束.

1.3.2 阿奇霉素急性暴露下斑馬魚的表觀形態學改變觀察 在亞致死濃度0,4,8 和16mg/L 下對24,48,72,96hpf 的胚胎和幼魚分別進行觀察并拍照記錄,同時對第72hpf 斑馬魚脊索進行觀察并拍照.

1.3.3 轉基因斑馬魚的發育觀察 分別利用Tg(elavl3:EGFP)和Tg(kdrl:mCherry)轉基因品系評價AZM 對斑馬魚神經發育和血管發育的影響;利用Tg(rag2:DsRed)轉基因品系評價AZM 對胸腺T 細胞分化形成的影響,使用立體熒光顯微鏡(Nikon,Tokyo, Japan)對96hpf 幼魚腦部神經元、6dpf 幼魚血管和120hpf 幼魚胸腺進行成像.

1.3.4 阿奇霉素急性暴露下斑馬魚幼魚行為學分析 將暴露在AZM 梯度濃度下的斑馬魚胚胎從6hpf 培養至120hpf,轉移到96 孔板并放入Noldus行為分析儀中進行觀察分析,系統所有設置依照我們先前的研究所述[14],設置完成后即對斑馬魚的行為進行分析.

1.3.5 斑馬魚乙酰膽堿酯酶(AChE)的測定與分析從控制組和AZM 暴露組中分別取70 條幼魚(5dpf)于1.5mL 的EP 管內,使用去酶PBS 清洗2 次,吸凈溶液并放置電子天平秤量,根據重量(g):體積(mL)=1:9 的比例,再次加入去酶PBS 進行超聲勻漿,在2500r/min 下低溫離心10min.蛋白濃度和AChE 酶活性測定均根據試劑盒說明書操作進行.

1.3.6 阿奇霉素靶基因的預測及富集分析(1)使用Chemdraw20.0 軟件繪制AZM 的化學結構圖,轉成mol2 文件格式后輸入至PharmMapper 網站(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)進行分析預測,得到AZM 可能作用的靶基因.

(2)將從PharmMapper中獲得的284個蛋白輸入到String數據庫(https://cn.string-db.org)中,獲得對應斑馬魚目標基因.

(3)將篩選得到的目標基因導入微生信在線分析網(https://www.bioinformatics.com.cn),根據基因標識以分子生物學功能(MF)、生物學過程(BP)和細胞學組分(CC)進行 GO 功能分類和KEGG 富集分析.

1.3.7 斑馬魚巨噬細胞染色 將暴露完成后的斑馬魚幼魚(4dpf)以30 條/孔置于6 孔板內,加入循環水配制的中性紅工作液(2.5μg/mL),28℃避光孵育7h.棄去染液,使用PBS 清洗3 次,加入MS-222 麻醉后在體視顯微鏡下觀察.

1.3.8 統計分析 本文的實驗數據以平均數±標準差(SD;n=3)的形式表示,采用SPSS19.0 軟件(IBM,USA)進行單因素方差分析,并在顯著性水平P<0.05、P<0.01 或P<0.001 下進行了統計.

2 結果與分析

2.1 阿奇霉素急性暴露誘導斑馬魚表觀形態改變

從圖1 可以看出,高濃度(16mg/L)暴露組的斑馬魚在72h 出現了明顯的畸形.隨著暴露時間的增加,暴露于AZM 的斑馬魚出現了脊椎彎曲現象.與此同時,斑馬魚出現游囊閉合、卵黃囊腫現象.隨著暴露濃度的增加,上述現象越明顯.這表明,在該劑量下,AZM 的急性暴露以濃度依賴的方式對斑馬魚幼魚早期發育產生了影響.

2.2 阿奇霉素急性暴露導致斑馬魚脊索發育異常

脊索是脊椎動物的主要結構,斑馬魚的脊索在胚胎發育階段提供結構支撐,使得幼魚能夠進行自主運動[15].同時,還具有保護脊髓和主要血管的作用.通過顯微鏡觀察發現,與對照相比,經過AZM 暴露后的斑馬魚脊索出現了彎曲現象,尤其是在16mg/L 濃度組中,脊索的彎曲最為顯著,并且經過濃度梯度暴露的斑馬魚脊索液泡出現了紊亂和不規則的情況(圖2(a)).斑馬魚依靠脊索實現自由運動,而脊索的異常發育往往與神經密切相關,基于此展開以下研究.

圖2 阿奇霉素暴露導致斑馬魚幼魚脊索/神經元損傷Fig.2 Exposure to azithromycin leads to notochord/neuronal damage in zebrafish larvae

2.3 阿奇霉素急性暴露抑制斑馬魚神經元的發育

基于斑馬魚出現脊索彎曲的現象,為了進一步探究AZM 是否對斑馬魚的神經系統產生影響,采用轉基因斑馬魚Tg(elavl3:EGFP)品系觀察AZM暴露對神經元發育的潛在影響. Tg(elavl3:EGFP)是將發綠色熒光蛋白EGFP 被整合到elavl3 基因的啟動子序列中,elavl3 基因是一種神經元特異性RNA,在神經元發育中起重要的調節作用[15].在斑馬魚幼魚的神經元早期發育過程中,elavl3 基因發揮著重要作用.通過顯微鏡觀察,結果如圖2(b)、2(c)所示,AZM 暴露顯著降低了elavl3 的表達水平,腦部的神經元明顯減少.同時,觀察到高濃度組的熒光強度稍有減弱,神經元軸突變短.上述結果表明AZM 引起斑馬魚神經元發育異常,并可能影響斑馬魚對外界刺激的反應.

2.4 阿奇霉素急性暴露引發斑馬魚行為學改變

斑馬魚的早期神經中樞系統容易受到環境干擾的影響,在明暗交替環境中,幼魚表現出特定的運動模式,運動行為的變化通?？梢宰鳛樯窠浂拘缘慕K點指標[16].與對照相比,AZM 暴露組(8,16mg/L)都表現出移動距離變短(圖3(d))、移動速度變慢(圖3(e))、光暗節律失衡(圖3(a)).軌跡圖和熱圖的分析結果也進一步證明了這一點(圖3(c)),處理組的軌跡雜亂且數量較少,熱圖顯示斑馬魚在某一區域的停留時間更長,尤其是在高濃度組(16mg/L)中.此外,在轉角實驗中觀察到,8mg/L 和16mg/L 濃度組的斑馬魚轉角增大(圖3(b)),表明幼魚可能出現了焦慮、恐懼和不安的情緒.這些觀察結果表明,AZM 的急性暴露降低了斑馬魚的運動活力和反應敏感性,引發了斑馬魚的行為異常.

圖3 阿奇霉素暴露導致斑馬魚幼魚行為異常Fig.3 Exposure to azithromycin causes abnormal behaviors in larvae

2.5 阿奇霉素急性暴露導致斑馬魚AChE 活性降低

AChE 是膽堿能突觸中乙酰膽堿水解的關鍵酶,參與細胞發育和成熟,能促進神經元的發育和再生,并被認為是發育神經毒性的生物標志物[17-18].AChE 已被證明參與許多生物體的運動行為[19],當AChE 活性受到抑制時,乙酰膽堿會積累,最終導致生物體的運動行為異常.在本研究中,當斑馬魚急性暴露于不同濃度的AZM 后,AChE 活性普遍呈現下降趨勢(圖4).在4mg/L 濃度組中,AChE 雖有下降趨勢,但其在統計學上并未達到顯著水平,在16mg/L濃度組中,對AChE活性的抑制作用更為顯著,結果顯示,AZM 對AChE 的抑制作用呈現出明顯的濃度依賴性特征.這些結果表明,AZM 的暴露對斑馬魚幼魚產生了明顯的神經毒性效應,具體表現為影響其脊柱和神經元的正常發育,改變其運動行為,以及對AChE 活性產生抑制作用.

圖4 阿奇霉素暴露導致AChE 活性變化Fig.4 Exposure to azithromycin leads to changes in AChE activity

2.6 AZM 暴露作用靶基因預測及功能富集分析

由圖5 可知,靶基因富集在多個通路上,包括一個葉酸碳庫、果糖和甘露糖代謝、核苷酸代謝、丙酮酸代謝、嘧啶代謝PPAR 信號通路、C 型凝集素信號通路、Fox O 信號通路、VEGF signaling pathway、碳代謝等代謝通路(圖5(a)).GO 富集分析包含生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)3 個部分,結果顯示靶基因涉及凝血、先天免疫反應和含嘌呤化合物代謝過程等生物過程;與質膜的外在成分、質膜細胞質側的外在成分、細胞外空間、蛋白質酪氨酸激酶活性、質膜的細胞質側和膜的外在成分細胞組分有關;在分子功能方面,主要涉及到核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、蛋白酪氨酸激酶活性等方面(圖5(b)).根據上述富集分析結果,發現AZM 可能通過調控VEGF 信號通路和凝血生物過程對斑馬魚血管產生影響.同時,AZM 還通過C 型凝集素信號通路和先天免疫反應生物過程對斑馬魚的免疫系統產生作用.

圖5 阿奇霉素作用靶基因的KEGG 富集分析和GO 功能分類Fig.5 KEGG enrichment analysis and GO functional classification of target genes affected by azithromycin

2.7 阿奇霉素急性暴露導致斑馬魚血管發育畸形

基于生物信息學結果, AZM 可能具有影響斑馬魚血管發育的潛在作用.使用Tg(kdrl:mCherry)品系斑馬魚進一步實驗,Tg(kdrl:mCherry)中的kdrl 基因在血管形成初期表達活躍,對維持正常血管功能和修復受損血管起重要作用.如圖6 所示.AZM 暴露組出現血管分支異常、血管排列分布雜亂并且熒光強度隨暴露濃度增加而減弱.這些結果表明,AZM 的急性暴露以濃度依賴的方式加劇了斑馬魚早期血管發育的畸形,與生物信息學分析預測的結果相一致.

圖6 阿奇霉素急性暴露導致斑馬魚血管發育畸形Fig.6 Acute exposure to azithromycin causes vascular developmental malformations in zebrafish

2.8 阿奇霉素急性暴露導致斑馬魚免疫系統紊亂

為驗證AZM 急性暴露對免疫系統產生影響,從先天免疫系統和適應性免疫系統兩方面進行驗證.巨噬細胞屬于先天性免疫系統,是斑馬魚幼魚發育時期的第一個免疫細胞,最早在受精后22h 發育,而適應性免疫(T 細胞)主要在幼魚后期發育過程建立.通過對4dpf 斑馬魚幼魚進行中性紅染色,使用顯微鏡觀察并拍攝頭部的巨噬細胞(圖7(a)).

圖7 阿奇霉素暴露誘導斑馬魚免疫系統紊亂Fig.7 Exposure to azithromycin induces immune system disorder in zebrafish

分析結果顯示,AZM 暴露組的斑馬魚頭部的巨噬細胞數量顯著多于對照組.進一步定量分析顯示,4,8mg/L 暴露組的斑馬魚頭部巨噬細胞的數量分別為37 和45 個(圖7(c)),與對照組相比具有統計學差異(P<0.05,P<0.001).而在高濃度(16mg/L)下,AZM暴露表現出促進斑馬魚巨噬細胞形成的趨勢.與此同時,使用轉基因Tg(rag2:DsRed)斑馬魚追蹤胸腺T細胞的發育情況,發現AZM 暴露下斑馬魚胸腺面積減少(圖7(b)、7(d)).隨著AZM 濃度的增加,幼魚胸腺發育的抑制效果越明顯,這也暗示AZM 可能對斑馬魚的適應性免疫有抑制作用.綜上,在上述濃度暴露下,AZM 會激活斑馬魚幼魚的先天免疫反應,抑制其適應性免疫,從而導致免疫系統發生紊亂.

3 討論

通過對斑馬魚進行AZM 的亞致死劑量急性暴露實驗,發現AZM 暴露會導致斑馬魚生長畸形、游囊發育不完整和脊椎畸形,且這種異?，F象隨著暴露濃度的增加而加劇.游囊是斑馬魚發育過程中的重要器官,通過充氣或放氣的方式維持斑馬魚在水中的平衡,其發育不全有可能對斑馬魚的攝食和運動行為造成不良影響[20].因此,推測AZM 可能具有神經毒性效應. Coffin 等[21]研究發現AZM 暴露會誘導斑馬魚側線毛細胞發育異常,同時在Mendon?a-Gomes 等[22]的研究中也觀察到AZM 暴露能夠改變AChE 的含量.

在脊椎動物中作為生物體軸線的關鍵組成部分,具有支撐脊柱形成的作用.特別是在斑馬魚這一模式生物中,脊索細胞不僅為周圍組織提供關鍵的發育信號,還引導著包括血管、神經管在內的多種組織的分化和發育[15].本研究發現,在AZM急性暴露下,斑馬魚幼魚出現了一系列脊索相關的異常表現,包括脊索彎曲,脊索液泡紊亂以及形態不規則等現象.這些異常狀況可能會對斑馬魚的神經系統和行為產生深遠影響.為了探究這一假設,進一步研究了AZM 暴露下elavl3 基因的表達情況,該基因在神經元分化和維持中起到重要作用[23].通過使用轉基因斑馬魚模型Tg(elavl3:EGFP),發現AZM 暴露確實導致了斑馬魚神經元數量的顯著減少.在斑馬魚的生長和發育過程中,其行為模式逐漸受到中樞神經系統的調控,成為中樞神經系統發育成熟的關鍵指標[24].值得注意的是,斑馬魚在明暗交替的環境中會展示特定的運動模式,這一觀察進一步強調了其運動行為在神經系統發育中的重要性[25].自主運動及光暗節律實驗結果顯示,在AZM 暴露下,斑馬魚幼魚的移動距離和運動速度顯著降低,同時還出現了光暗節律的失衡.這些異常行為表明斑馬魚在AZM 暴露后出現了類似于焦慮和抑郁的心理狀態. AChE 是評估神經毒性的一個重要生物標志物,主要通過降解乙酰膽堿(ACh)來調節神經傳導[26].在本研究中,暴露于AZM 的斑馬魚幼魚表現出AChE 活性明顯降低的現象.綜上所述,AZM急性暴露不僅導致斑馬魚出現脊索損傷,還影響其神經元的發育和AChE 的活性,從而對斑馬魚的行為表現產生了不良影響.

為了探究AZM 潛在的神經毒性機制,采用生物信息學手段預測了AZM 作用的目標基因,并對這些基因進行了通路富集分析.然而,結果并未顯示與神經系統密切相關的通路,而是更多地富集在血管形成和免疫系統相關通路上.研究表明,血管和神經系統在功能和解剖學上存在著密切的聯系,例如軸突引導信號與血管模式的相互調節[27].進一步研究還發現AZM 有可能通過調控VEGF/Notch 信號通路來誘導斑馬魚的神經毒性[28].此外,在中樞神經系統中,神經元、神經膠質細胞和免疫細胞形成一個協調的網絡來維持體內平衡和限制神經炎癥.因此,免疫系統在保持正常腦功能方面也起著不可忽視的作用[29].基于此,推測AZM 可能通過調控血管生成和影響免疫系統從而誘發神經毒性.

為了驗證這一假設,進行了實驗驗證.通過觀察Tg(kdrl:mCherry)血管轉基因斑馬魚,發現AZM 急性暴露組斑馬魚尾部血管分支異常且排布雜亂.這一現象與上述AZM 暴露下斑馬魚幼魚行為學異常、神經元減少及AChE 活性降低的結果一致,進一步說明AZM 急性暴露導致斑馬魚幼魚出現血管和神經毒性.

免疫系統在細胞層面主要由先天免疫(如巨噬細胞和中性粒細胞)和適應性免疫(如T 細胞和B 細胞)組成.在斑馬魚幼魚的發育過程中,巨噬細胞是首個出現的免疫細胞類型,主要負責損傷修復和炎癥反應的調控[30].在適應性免疫中,T 細胞負責識別特異性抗原,激活和調節其他免疫細胞,在維持免疫平衡和抵抗病原體方面起著關鍵作用[31].隨著急性暴露AZM 濃度增加至8mg/L 時,我們觀察到斑馬魚幼魚先天免疫細胞(即巨噬細胞)數量明顯增加,而適應性免疫細胞(即T 細胞)數量則出現下降,相應的胸腺面積也顯著減少.表明AZM 暴露會造成斑馬魚先天免疫和適應性免疫的損傷.這一系列觀察結果進一步印證了AZM 急性暴露不僅會對斑馬魚的血管系統和免疫系統產生毒性效應,而且還可能通過血管與神經系統,以及神經與免疫系統之間的相互作用和串擾,進一步誘發神經毒性.當然,這些推斷還需要進一步的實驗驗證以強化其科學性和準確性.

4 結論

4.1 AZM 急性暴露造成斑馬魚幼魚脊柱彎曲、卵黃囊水腫和游囊發育異常,并且異常程度隨濃度梯度增加而增加.

4.2 AZM 急性暴露導致斑馬魚脊索損傷、腦部神經元減少、AChE 活性下降、自主運動活力減少和光暗節律失衡,上述指標均反映了AZM 對斑馬魚神經系統的毒性效應.

4.3 利用生物信息學預測出AZM 對斑馬魚作用靶基因的功能與血管和免疫相關.進一步的實驗觀察顯示,在AZM 暴露下,斑馬魚幼魚出現血管分支異常、巨噬細胞數量增加和胸腺T 細胞發育被抑制的現象,從而確證了AZM 具有誘導斑馬魚血管和免疫毒性的潛力.