PFOS 及其三種替代品對蚯蚓的毒性效應及比較

李登曇,盧成波,王曉樂,杜仲坤,李 冰,王金花,王 軍,張靜文,朱魯生(山東農業大學資源與環境學院,山東 泰安 271018)

作為全氟及多氟烷基化合物(PFAS)的典型代表,全氟辛烷磺酸(PFOS)因其具有良好的熱穩定性、耐高溫和耐化學腐蝕等獨特的物理化學性質,在工業領域和日常消費品中都得到了廣泛的應用[1].由于PFOS 的環境持久性、遠距離遷移性和生物蓄積性等特征,其生產或使用已在全球范圍內被禁止[2-4].因此,為了滿足工業應用的需求并考慮到降低對環境的負面影響,人們研發和生產了大量新型PFOS 替代品.其中主要包括將碳鏈中的部分C-F 鍵替代為C-H鍵的6:2氟調聚磺酸(6:2FTSA)以及降低碳鏈長度的全氟己烷磺酸(PFHxS)和全氟丁烷磺酸(PFBS)等.由于這些替代品的結構與PFOS 結構相似,而且目前已在水體、大氣、土壤和生物體等多種環境介質中廣泛檢測到它們的存在[5-7].因此,近年來這些替代品對環境帶來的負面影響備受關注.已有研究表明6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 對水蚤[8]、斑馬魚[9-10]和小鼠[11]等多種生物具有潛在的毒性效應,甚至在某些方面這些替代品對生物體表現出比PFOS 更高的毒性效應.然而6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 對土壤無脊椎動物,特別是對蚯蚓的毒性效應尚不清楚.此外,與PFOS 相比,它們對蚯蚓的綜合毒性是否降低也仍未知.

本文以赤子愛勝蚓(E. fetida)為受試生物,從氧化應激、生殖毒性和發育毒性3 個方面研究了PFOS及其3 種典型替代品6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 以相同濃度(0.2mg/kg)暴露28d(OECD)后對蚯蚓的毒性效應;并通過計算綜合生物標志物響應(IBR)指數綜合評估了PFOS 與其替代品的毒性大小和差異.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PFOS(CAS 號為2795-39-3,純度≥98%)購自上海安譜實驗科技股份有限公司;6:2FTSA(CAS 號為27619-97-2,純度≥98%)購自上海麥克林生化科技股份有限公司;PFHxS(CAS 號為3871-99-6,純度≥98%)和PFBS(CAS 號為29420-49-3,純度≥98%)購自北京百靈威科技有限公司.4 種PFAS 的結構式如圖1 所示.E. fetida(0.3～0.6g)購自河北省鑫伊達蚯蚓養殖場,在光照培養箱(光暗比為16h:8h,光照強度為650lx,濕度為80%,溫度為20°C)中預培養2 周以上.研究中所使用的其它化學品均為分析純.

圖1 PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 結構式Fig.1 The structural formulas of PFOS, 6:2FTSA, PFHxS,and PFBS

本研究采用經濟合作與發展組織(OECD)[12]規定的人工土壤(由石英砂、高嶺土和泥炭蘚組成,配比為7:2:1, pH 值為6.0 左右,含水率為35%).試驗開始前,將E. fetida 放于該土壤中繼續預培養24h.

1.2 暴露實驗

染毒濃度采用PFAS 的環境相關濃度(0.2mg/kg)[13-16].以水為溶劑制備PFAS 溶液(0.3mg/mL).每個暴露組(3個平行)共含1500g人工土.首先稱取50g人工土加入1mL 0.3mg/mL 的PFAS 溶液混合均勻,然后再加入1450g 人工土充分攪拌混勻,最后按照OECD 規定加入去離子水(525g)將土壤含水率調節至35%,分裝至3 個1L 燒杯中.對照土壤(CK)為只含35%去離子水的人工土壤.

按照OECD 的規定,每個燒杯放置10 條蚯蚓,并記錄燒杯總重量,在光照培養箱(與預培養條件相同)中培養28d.通過稱重監測土壤含水量的變化,每7d 補充一次水分.

1.3 指標測定

在暴露后的第28d,從每個處理組的3 個燒杯中各取3 條蚯蚓,即每個處理組共9 條.3 條用于測定活性氧(ROS)含量,3 條用于測定酶活性(超氧化物歧化酶,SOD;過氧化氫酶,CAT;谷胱甘肽硫轉移酶,GST)、丙二醛(MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量,3條用于測定基因相對表達水平.所有指標的測定均采用生物學平行.在測定之前,將蚯蚓從土壤中取出放在鋪有濾紙的培養皿上進行沖洗并過夜吐泥.

1.3.1 ROS 含量測定 使用手持高速勻漿機對蚯蚓(已提前加入7mL 預冷的ROS 磷酸鹽緩沖液)冰浴均質化后離心20min(3000g,4°C),隨后取上清液繼續離心20min(20000g,4°C),棄去上清后用ROS 磷酸鹽緩沖液對沉淀進行重懸浮,即得到ROS 待測液.采用DCFH-DA 法測定ROS 含量[17].

1.3.2 酶活性、MDA 和8-OHdG 含量測定 使用手持高速勻漿機對整條蚯蚓(已提前加入蚯蚓體重10 倍的SOD 磷酸鹽緩沖液)冰浴均質化后離心10min(10000r/min,4°C),所得上清液即為待測液.分別采用氮藍四唑法[18]、紫外吸收法[19]、1-氯-2,4-二硝基苯比色法[20]和硫代巴比妥酸比色法[21]測定SOD、CAT、GST 活性以及MDA 含量. 8-OHdG 含量根據酶聯免疫分析試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)說明書進行測定.

1.3.3 基因相對表達水平測定 采用Trizol 法提取整條蚯蚓的總RNA.經純化處理后,檢測RNA 純度和完整度.使用反轉錄試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)將合格的RNA 反轉錄合成cDNA(反轉錄反應體系如表1 所示).最后以β-actin 為內參基因,通過實時定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)技術對鈣網蛋白(CRT)基因、熱休克蛋白(HSP70)基因、產卵激素(ANN)基因和腫瘤轉錄控制蛋白(TCTP)基因進行相對定量檢測.基因引物信息和Real-time PCR反應條件分別如表2 和表3 所示.

表1 反轉錄反應體系Table 1 Reaction system of reverse transcription

表2 基因引物信息Table 2 Gene primer information

表3 Real-time PCR 反應條件Table 3 Reaction conditions of Real-time PCR

1.3.4 綜合毒性評估 IBR 指數整合了所有不同生物標志物的結果以了解污染物對生物體的綜合影響[22].在本研究中,參照Sanchez 等[23]的方法,計算測量的所有生物標志物的偏差系數和IBR值以評價各生物標志物對PFAS 暴露后的敏感程度以及PFAS 對蚯蚓的綜合毒性大小和差異.

1.4 數據處理與分析

試驗結果采用 Microsoft Excel 2019 和OriginPro 2022b 進行分析處理和制圖.采用SPSS 22.0 對數據進行單因素方差分析和最小顯著性差異檢驗(P<0.05).

2 結果與分析

在整個暴露期間(28d),未觀察到蚯蚓死亡或體重下降.

2.1 PFAS 對蚯蚓的氧化應激效應

2.1.1 ROS 含量變化 與CK 相比,PFOS、PFHxS和PFBS 處理均誘導蚯蚓產生過量的ROS(圖2(a)).其中,PFOS 處理組中的ROS 含量顯著高于PFBS,但與PFHxS 之間無顯著性差異.PFHxS 處理組ROS含量略高于PFBS,但兩組之間也無顯著性差異.6:2FTSA 處理后也誘導ROS 含量上升,但與CK 相比并沒有顯著性差異.

圖2 PFAS 暴露后蚯蚓體內ROS 含量和抗氧化酶活性的變化Fig.2 Changes in ROS content and antioxidant enzymes activities in earthworms after exposure to PFAS

2.1.2 抗氧化酶活性變化 與CK 相比,所有PFAS處理組均顯著促進SOD 活性(圖2(b)).其中PFHxS處理組與PFOS 之間無顯著性差異,但顯著高于6:2FTSA 和PFBS 處理組;PFOS 處理組與6:2FTSA之間沒有顯著性差異,但顯著高于PFBS 處理組;6:2FTSA 對SOD 活性的促進作用略高于PFBS 處理組,但兩者之間不具有顯著性差異.

與CK 相比,PFOS 和6:2FTSA 處理組均顯著抑制CAT 活性,兩者之間無顯著性差異;PFHxS 和PFBS處理組均顯著促進CAT活性,PFHxS處理組的促進作用略高于PFBS,但兩者之間無顯著性差異(圖2(c)).

PFOS 和PFHxS 處理組GST 活性顯著高于CK組以及6:2FTSA 和PFBS 處理組,但兩組之間不存在顯著性差異;6:2FTSA 和PFBS 處理組對GST 活性沒有顯著性影響(圖2(d)).

2.1.3 MDA含量變化 所有PFAS處理組的蚯蚓體內MDA 含量均顯著高于CK 組(圖3(a)).其中PFHxS處理組與PFOS 之間無顯著性差異,但顯著高于6:2FTSA 和PFBS 處理組;PFOS 處理組與6:2FTSA之間沒有顯著性差異,但顯著高于PFBS 處理組;6:2FTSA 和PFBS 處理組之間沒有顯著性差異.

圖3 PFAS 暴露后蚯蚓體內MDA 和8-OHdG 含量的變化Fig.3 Changes in MDA and 8-OHdG content in earthworms after exposure to PFAS

2.1.4 8-OHdG 含量變化 相比于CK 組,PFOS、6:2FTSA 和PFHxS 處理組均顯著誘導8-OHdG 含量上升,但3 個處理組之間沒有顯著性差異;PFBS 處理組對8-OHdG 含量沒有顯著性影響(圖3(b)).

2.1.5 HSP70 和CRT 基因表達變化 相比于CK組,PFOS、PFHxS 和PFBS 處理組中HSP70 基因相對表達水平均顯著上調,但3 個處理組之間沒有顯著性差異;6:2FTSA 對HSP70 基因表達也具有一定的促進作用,但與CK 相比沒有顯著性差異(圖4(a)).

圖4 PFAS 暴露后蚯蚓體內HSP70 和CRT 基因表達的變化Fig.4 Changes in expression of HSP 70 and CRT genes in earthworms after exposure to PFAS

所有PFAS 處理組的蚯蚓體內CRT 基因相對表達水平均顯著高于對照水平(圖4(b)).其中,PFOS、6:2FTSA 和PFHxS 處理組之間沒有顯著性差異,但均顯著高于PFBS 處理組.

2.2 PFAS 對蚯蚓ANN 基因表達的影響

與CK 組相比,所有PFAS 處理組均顯著抑制蚯蚓體內ANN 基因相對表達水平(圖5(a)).其中,PFOS、PFHxS 和PFBS 處理組的抑制作用強于6:2FTSA,但3 個處理組之間沒有顯著性差異.

圖5 PFAS 暴露后蚯蚓體內ANN 和TCTP 基因表達的變化Fig.5 Changes in expression of ANN and TCTP genes in earthworms after exposure to PFAS

2.3 PFAS 對蚯蚓TCTP 基因表達的影響

相比于CK 組,所有PFAS 處理組均顯著促進蚯蚓體內TCTP 基因相對表達水平(圖5(b)).其中,PFOS和PFHxS處理組的促進作用最強,但兩組之間不存在顯著性差異;PFBS 處理組TCTP 基因相對表達水平顯著高于6:2FTSA.

2.4 綜合毒性評估

計算各指標的偏差系數圖6,在雷達圖中,多邊形與每條軸線的交點表示各生物標志物的偏差系數.偏差系數大于零代表促進效應,小于零則代表抑制效應.從各指標對PFAS響應的偏差系數來看,CRT基因是對PFOS 和6:2FTSA 暴露響應程度最大的指標,而對PFHxS 和PFBS 暴露響應程度最大的指標是MDA 和HSP70 基因.

圖6 PFAS 暴露后對各指標的偏差系數(雷達圖)Fig.6 Deviation coefficient(radar plot) and for each indicator after exposure to PFAS

通過計算個處理組的IBR 指數可知,PFOS 處理組的 IBR 值(36.4)最大,略高于 PFHxS 處理組(34.1);PFBS處理組IBR值(24.3)低于PFHxS處理組,但要高于6:2FTSA 處理組(22.2).

3 討論

3.1 PFAS 誘導蚯蚓氧化應激效應

ROS 是指一系列含氧化學反應物質,主要包括機體正常代謝產生的自由基活性氧(如和OH)和非自由基活性氧(如H2O2)[24].它們的產生和消除一般在生物體內各種抗氧化酶的作用下處于較為穩定的動態平衡狀態.正常情況下ROS 不會對細胞造成負面影響.但當生物體暴露于污染物時,這些物質往往會參與多種氧化反應,此時,ROS 產生和消除的穩態被打破,出現ROS 的產生增加或ROS 自清潔能力下降等現象,從而造成ROS過度積累,最終導致氧化應激或細胞死亡[25].ROS 含量升高通常表明機體內氧化應激水平增加[26].在本研究中,0.2mg/kg PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露28d 后,E.fetida 體內ROS 含量明顯增加.同樣地,在Chen 等[27]的研究中,PFOS 和PFBS 暴露可顯著誘導秀麗隱桿線蟲體內ROS 含量升高.Feng 等[28]的研究也表明,PFOS 和PHFxS 可誘導小鼠卵母細胞內積累過量的ROS.這意味著PFAS 脅迫能夠破壞生物體內細胞氧化還原狀態的平衡,ROS 過度積累,從而引發氧化應激的增加與抗氧化防御機制的下降,并造成后續的氧化損傷,這可能是PFAS 毒性的主要機制之一.此外,研究發現,與3 種替代品相比,PFOS 處理后可誘導E. fetida 產生更多的ROS,這表明PFOS可能通過促進氧化應激的增加而加重對蚯蚓的毒性,從而表現出比6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 更高的毒性效應.

為應對ROS 誘導的這種損傷效應,E. fetida 體內包括SOD、CAT 和GST 在內的抗氧化酶能夠在機體遭受外界脅迫時迅速發揮作用以清除多余的ROS 并盡可能地維持ROS 正常水平[29].其中,SOD是最先對氧化應激做出反應的酶之一,能夠先催化分解為H2O2和O2,以保護細胞免受自由基的傷害.但H2O2也是一種高活性的ROS,具有造成大量細胞損傷的能力[24].此時,同樣為抗氧化酶的CAT 能夠通過不同的方式將H2O2和其他自由基進一步轉化為無害的H2O 和O2.此外,作為谷胱甘肽(GSH)依賴性酶,GST 通過以GSH 為共軛物清除多余的ROS 或其他自由基,在抗氧化反應中發揮重要作用[30].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露后均增強了E. fetida 體內的SOD 活性.Xu 等[31]在研究PFOS 對E. fetida 的毒性效應時發現,當PFOS 的暴露濃度低于40mg/kg 時,E. fetida 體內SOD 均被激活,與本研究結果類似.這表明PFAS 刺激機體產生了過量的ROS(),因此SOD 被激活以清除多余的,從而防止或減輕PFAS對E. fetida 造成的氧化損傷.PFHxS 和PFBS 暴露后還增強了CAT 活性,這可能是因為PFHxS 和PFBS 刺激機體產生了H2O2,亦或是在抗氧化的第一階段,SOD 清除時導致了H2O2的積累,從而進一步激活CAT 以繼續將H2O2轉化為無害的H2O 和O2.然而PFOS 和6:2FTSA 處理后抑制了CAT 活性,這一結果與Wang 等[32]發現一致,在他們的研究中,5mg/L PFOS 暴露后可顯著抑制渦蟲CAT 活性.同樣地,Liang 等[33]發現1 和2mg/L PFOS 暴露21d 后對大型蚤體內的CAT 活性也具有顯著的抑制作用.這可能是因為機體受到脅迫后產生的ROS 或其他自由基超出了CAT 的清除能力,從而導致酶活性下降,抗氧化系統受損.此外,PFOS和PFHxS 暴露后誘導GST 活性上升,Wang 等[32]也發現PFOS 暴露7 和10d 以后,渦蟲體內GST 活性顯著上升.這表明GST 與SOD 和CAT 共同發揮作用,通過促進GSH 與污染物結合的方式來清除ROS,達到解毒的目的.

雖然生物體內存在的調控機制(例如抗氧化防御機制)能夠應對外界環境脅迫所帶來的不利影響,但隨著越來越多的ROS 或其他自由基的積累,很可能會超出抗氧化系統的承受限度,從而對蛋白質、脂質和DNA 等大分子造成負面影響[30,34],最終導致脂質過氧化和DNA 損傷等現象.其中,MDA 是脂質過氧化的主要產物之一,被認為是氧化脅迫下細胞損傷的主要生物標志物[35];8-OHdG 與ROS 密切相關,能夠敏感地反映DNA 氧化損傷的程度[36].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 處理后E. fetida體內MDA 含量均有所升高.在Bi 等人[37]的研究中發現,PFOS 暴露后,河蜆鰓和內臟中ROS 含量顯著上升,盡管SOD 和CAT 活性上升以清除多余的ROS,但仍發現MDA 含量顯著升高.這意味著生物體接觸PFAS之后,體內的抗氧化系統無法抵御ROS介導的氧化應激,從而誘發機體脂質過氧化損傷.Chen 等[38]的研究也表明,PFOS 和PFBS 暴露后,雖然小鼠腸道中CAT 酶被激活以調控ROS 水平,但仍誘導了MDA 含量升高,并導致腸道氧化損傷.此外,PFAS 暴露后還誘導8-OHdG 含量顯著上升,表明E. fetida 體內出現了DNA 損傷.Wielsoe 等[39]也發現,PFOS 和PFHxS 暴露會增加人體肝細胞中的ROS 水平,并導致DNA 損傷,與本文研究結果一致.

為進一步探究PFAS 誘導的氧化應激效應,本研究還評估了相關功能基因的mRNA 表達水平.當蚯蚓暴露于污染物時,HSP70 和CRT 基因都具有保護機體細胞免受氧化損傷的功能[26].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露后,E. fetida體內HSP70 和CRT 基因的mRNA 表達水平均被不同程度地誘導,特別是PFOS 處理組.San-Segundo等[40]研究了不同濃度(24,48 和96mg/L)的PFOS 對非洲爪蟾胚胎發育過程中基因表達水平的影響,結果表明PFOS 能夠顯著誘導HSP70 基因的相對表達,這與本文的結果相似.這可能是由于PFAS 誘導機體產生了氧化應激,因此HSP70 和CRT 基因顯著上調表達以緩解PFAS 對機體造成的氧化脅迫.

3.2 PFAS 抑制蚯蚓生殖行為

以往研究表明,ANN 是一種與蚯蚓繁殖行為密切相關的蛋白質,能夠調節蚯蚓的產卵行為,被認為是評價蚯蚓繁殖能力的新型生物標志物[26,41].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露28d 后,E. fetida 體內ANN 基因表達的mRNA水平顯著被抑制.這表明PFAS 可以導致E. fetida產卵相關基因的mRNA 表達異常,從而抑制蚯蚓的產卵繁殖行為.本研究結果與Chen 等[27]的發現一致,PFOS 和PFBS 均可對秀麗隱桿線蟲造成一定的生殖毒性,并且作者認為這種生殖毒性可能是由ROS 所誘導的.

3.3 PFAS 誘導蚯蚓細胞凋亡并影響生長發育過程

TCTP 是一種在真核生物中大量表達的多功能蛋白質,調節細胞生長、增殖和分化,參與調節無脊椎動物的生長發育過程[42].在本研究中,PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露后,E. fetida 體內TCTP 基因表達被明顯激活.這表明PFAS 暴露會顯著干擾E. fetida 細胞的生長、分化和增殖等過程,導致細胞凋亡,最終抑制蚯蚓生長并誘導發育毒性.

3.4 PFAS 對蚯蚓毒性的綜合評估

在所有生物標志物中,CRT 基因是對PFOS 和6:2FTSA 毒性貢獻最大的生物標志物,MDA 含量和HSP70 基因分別是對PFHxS 和PFBS 毒性貢獻最大的生物標志物.這表明氧化應激是PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 誘發蚯蚓毒性的最敏感指標.這些生物標志物的結果更具有代表性,能夠更好地用于評估PFAS 對環境的潛在健康風險.

此外,根據IBR值可知,0.2mg/kg PFAS對蚯蚓的綜合毒性為PFOS>PFHxS>PFBS>6:2FTSA.先前研究表明,PFAS 對生物體的毒性往往隨碳鏈的縮短而降低[43].同樣地,本研究結果表明,碳鏈更短的PFBS對蚯蚓的綜合毒性明顯小于較長碳鏈的PFOS 和PFHxS.Qiao 等[44]研究發現,PFOS 和PFHxS 對土壤細菌群落結構和功能的影響大于PFBS.在Liu 等[45]的研究中,PFHxS 處理后使得人間質干細胞活力下降,而PFBS 卻未對細胞產生任何毒性.Xue 等[1]通過評估PFOS 和PFBS 對斜生柵藻生長、葉綠素熒光、抗氧化系統和轉錄組的影響發現,PFOS 可對斜生柵藻產生比PFBS 更高的毒性.此外,具有更小毒性的6:2FTSA 分子含有8 個碳,其較低的毒性可能與其官能團附近的碳原子以C-H 鍵的形式存在有關.相對于其他3 種PFAS,6:2FTSA 分子的能量更低,這導致了其在生物或非生物途徑中更易于被降解,從而在環境介質中表現出較低的毒性效應[46].

4 結論

4.1 PFOS 與3 種替代品6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 暴露28d 后均誘導E. fetida 產生氧化應激效應,并導致脂質過氧化和DNA 損傷.

4.2 與氧化應激相關基因上調表達進一步加劇了PFAS 誘導的氧化應激和毒性.PFOS、6:2FTSA、PFHxS和PFBS 還會引發蚯蚓生殖毒性,誘導發育毒性.

4.3 PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 的IBR 數值分別為36.4, 22.2, 34.1, 24.3. 4 種物質對蚯蚓的綜合毒性大小依次為:PFOS> PFHxS>PFBS>6:2FTSA.氧化應激是PFOS、6:2FTSA、PFHxS 和PFBS 誘發蚯蚓毒性的最敏感指標.