富氫液通過增加自噬治療大鼠神經病理性疼痛

何穎 張廣華 田立東 于泳浩

摘要：目的 評價自噬在富氫液治療神經病理性疼痛中的作用。方法 將鞘內置管成功的40只成年雄性SD大鼠隨機分為5組：假手術組（S組）、神經病理性疼痛組（C組）、富氫液組（H組）、自噬抑制劑組（M組）和富氫液+自噬抑制劑組（HM組），各8只。采用坐骨神經慢性壓迫法（CCI）制備大鼠神經病理性疼痛模型。M組和HM組于術后鞘內注射自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）30 μg/kg，H組和HM組于術后腹腔注射富氫液（0.6 mmol/L）10 mL/kg，其他組鞘內/腹腔給予等量生理鹽水，2次/d，連續7 d。于造模前1 d和造模后1、3、5、7和14 d（T0—T5）測定大鼠機械刺激縮足閾值（MWT）和熱刺激縮足潛伏期（TWL）。取脊髓L4—L6節段，采用Western blot法檢測自噬相關蛋白微管相關蛋白輕鏈3（LC3）Ⅱ、Beclin-1和p62蛋白的表達；并測定脊髓組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。結果 與S組比較，C組T2—T5時MWT和TWL均降低，T5時脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1和p62蛋白表達水平升高，SOD活性降低，MDA含量增加（P＜0.05）。與C組比較，H組T2—T5時MWT和TWL均升高，T5時脊髓LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平減少，SOD活性增強，MDA含量減少（P＜0.05）；M組T2—T5時MWT和TWL均降低，T5時脊髓LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平減少，p62蛋白表達水平升高，SOD活性降低，MDA含量增加（P＜0.05）。與M組比較，HM組T2—T5時MWT和TWL均升高，T5時脊髓LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平減少，SOD活性增高，MDA含量減少（P＜0.05）。結論 富氫液可減輕大鼠神經病理性痛，抑制脊髓氧化應激，其機制可能與增加自噬有關。

關鍵詞：氫；神經痛；自噬；脊髓；氧化性應激

中圖分類號：R614文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230698

Hydrogen-rich saline treated neuropathic pain in rats by increasing autophagy

HE Ying1， ZHANG Guanghua1， TIAN Lidong1， YU Yonghao2△

1 National Health Commission Key Laboratory of Hormones and Development， Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases， Department of Anesthesiology， Chu Hsien-I Memorial Hospital & Tianjin Institute of Endocrinology， Tianjin Medical University， Tianjin 300134， China; 2 Department of Anesthesiology， Tianjin Medical University General Hospital

△Corresponding Author E-mail： yyu@tmu.edu.cn

Abstract： Objective To evaluate the role of autophagy in the treatment of neuropathic pain （NP） with hydrogen-rich saline. Methods Forty adult male Sprague-Dawley rats with successful intubation were randomly divided into 5 groups （n=8） using a random number table： the sham operation group （group S）， the neuropathic pain group （group C）， the hydrogen-rich saline group （group H）， the autophagy inhibitor group （group M） and the hydrogen-rich saline + autophagy inhibitor group （group HM）. There were 8 rats in each group. The NP model was established by chronic constriction of the sciatic nerve （CCI） in rats. The autophagy inhibitor 3-methyladenine （3-MA） was intraperitoneally injected with 30μg/kg in the group M and the group HM. The hydrogen-rich saline （0.6 mmol/L） was intraperitoneally injected with 10 mL/kg in the group H and the group HM. The other groups were intraperitoneally injected with the same amount of normal saline twice a day for 7 consecutive days. Paw withdrawal threshold to mechanical stimulation （MWT） and paw withdrawal latency to thermal stimulation （TWL） were measured at 1 day before and 1， 3， 5， 7 and 14 days after modeling （T0-T5）. After the last measurement of pain threshold， the L4-L6 segment of spinal cord was removed for determination of the expression of autophagy-related proteins microtubule-associated protein light chain 3 （LC3） Ⅱ， Beclin-1 and p62 proteins by Western blot assay. The expression levels of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in spinal cord tissue were detected. Results Compared with the group S， MWT and TWL were decreased in the group C at T2-5， the expression levels of LC3 Ⅱ， Beclin-1 and p62 were increased， SOD activity was decreased， and MDA content was increased at T5 （P＜0.05）. Compared with the group C， MWT and TWL were increased in the group H at T2-5， LC3 Ⅱ and Beclin-1 protein expression levels were increased， p62 protein expression levels were decreased， SOD activity was increased， and MDA content was decreased at T5 （P＜0.05）. MWT and TWL were decreased in the group M at T2-5， LC3 Ⅱ and Beclin-1 protein expression levels were decreased， p62 protein expression levels were increased， SOD activity was decreased， and MDA content was increased at T5 （P＜0.05）. Compared with the group M， MWT and TWL were increased in the group HM at T2-5， LC3 Ⅱ and Beclin-1 protein expression levels were increased， p62 protein expression levels were decreased， SOD activity was increased， and MDA content was decreased at T5 （P＜0.05）. Conclusion Hydrogen-rich saline can alleviate neuropathic pain and inhibit oxidative stress in spinal cord in rats， and the mechanism may be related to the increase of autophagy.

Key words： hydrogen; neuralgia; autophagy; spinal cord; oxidative stress

神經病理性疼痛是一種由感覺神經損傷或疾病直接引起的疼痛，嚴重影響患者的生活質量，是一種難以治愈的慢性疼痛，在普通人群中的發病率約為7%［1］，因此探究神經病理性疼痛的機制和治療方法具有重要臨床意義。有研究表明，富氫液因其抗氧化和抗炎等作用，可以減輕大鼠神經病理性疼痛［2-3］。另有研究發現，自噬在神經病理性疼痛中發揮著重要作用，鞘內注射自噬誘導劑雷帕毒素能提高脊髓背角小膠質細胞自噬水平，抑制白細胞介素-1β（IL-1β）釋放，提高大鼠痛閾，從而減輕神經病理性疼痛［4］。但富氫液可否通過增加自噬來改善神經病理性疼痛尚不明確。本研究旨在探討自噬在富氫液治療神經病理性疼痛中的作用，為神經病理性疼痛的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠40只，8～10周齡，體質量180～220 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（京）-0008。所有大鼠均單籠飼養于天津市內分泌研究所動物中心［動物使用許可證號：SYXK（津）2020-0001］，處于晝夜交替的通風環境，自由飲水、飲食，實驗開始前適應性飼養7 d。

1.1.2 主要試劑與儀器 3-甲基腺嘌呤（3-MA，美國Sigma公司）；微管相關蛋白輕鏈3（LC3）Ⅱ兔單克隆抗體、Beclin-1兔單克隆抗體、p62鼠單克隆抗體、羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗（英國Abcam公司）；BCA試劑盒、RIPA裂解液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、微量丙二醛（MDA）測試試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BSEVF3 von Frey纖維絲（美國Harvard Apparatus公司）；YLS-6B智能熱板儀（安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及干預 腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，保留自主呼吸，必要時追加麻醉藥物。于L3—L4棘突間隙逐層分離組織結構，用鑷子夾住PE-10聚乙烯導管尖端輕柔地將導管于間隙向上置入1.5～2.0 cm。如果大鼠出現甩尾反射，或導管內可見清亮的腦脊液流出，則標志置管成功。采用隨機數字表法將40只鞘內置管成功大鼠分為5組：假手術組（S組）、神經病理性疼痛組（C組）、富氫液組（H組）、自噬抑制劑組（M組）和富氫液+自噬抑制劑組（HM組），每組8只。M組和HM組于術后鞘內注射3-MA 30 μg/kg；H組和HM組于術后腹腔注射富氫液（0.6 mmol/L）10 mL/kg；其余組鞘內/腹腔給予等容量生理鹽水，2次/d，連續7 d。

1.2.2 神經病理性疼痛模型的制備 除S組外，各組參照文獻［5］采用坐骨神經慢性壓迫法（CCI）制備神經病理性疼痛模型。腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠后，用小剝離子經左后肢股二頭肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經，用4.0含鉻羊腸線于坐骨神經主干結扎4道，每道間隔1 mm，以打結時引起小腿肌肉輕微抽動且不影響血供為準。局部用生理鹽水沖洗，縫合各層組織，用碘伏消毒皮膚預防感染。術后大鼠出現舔足、縮爪、術側足不敢著地等疼痛行為學表現為造模成功。S組除不結扎坐骨神經外，其余操作均與C組相同。

1.2.3 富氫液的制備 參照文獻［6］制備富氫液。將生理鹽水暴露在0.4 MPa壓力下的高純氫氣環境中6 h，使生理鹽水達飽和狀態，氫氣濃度達0.6 mmol/L，4 ℃冰箱儲存備用。

1.2.4 機械痛閾和熱痛閾的測定 于造模前1 d和造模后1、3、5、7、14 d（T0—T5）測定大鼠的機械刺激縮足閾值（MWT）和熱刺激縮足潛伏期（TWL）。采用BSEVF3 von Frey纖維絲對準大鼠左后足第2、3趾骨間施加壓力，記錄出現嘶叫、縮足反應或舔舐左足時的壓力，間隔10 min，測定3次，取平均值即為MWT。將大鼠置于52 ℃的YLS-6B智能熱板儀上，記錄從左后足接觸熱板至出現回縮、嘶叫或舐足時的時間，間隔10 min，測定3次，取平均值即為TWL。

1.2.5 Western blot法檢測脊髓神經細胞自噬相關蛋白的表達 T5時測定痛閾后經生理鹽水心臟灌注，取脊髓L4—L6節段，加入組織蛋白裂解液提取脊髓組織總蛋白，測定樣品蛋白質含量。經SDS凝膠電泳將蛋白轉至PVDF膜；室溫條件下使用5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜后加入一抗LC3Ⅱ、Beclin-1、p62和內參β-actin（稀釋度均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后在室溫條件下加入羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗（稀釋度均為1∶5 000）孵育1 h；暗室中將顯色底物加至PVDF膜上反應2 min，曝光，掃描。采用Quantity One圖像分析軟件測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內參β-actin灰度值的比值反映LC3 Ⅱ、Beclin-1和p62的表達量。

1.2.6 脊髓組織氧化應激水平檢測 脊髓L4—L6節段用4 ℃生理鹽水制備10%脊髓組織勻漿，12 000 r/min離心10 min，取上清液。參照試劑盒說明書檢測上清液中SOD活性和MDA含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0進行數據分析。計量資料以均數±標準差（[x] ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；不同時點多組間比較采用重復測量設計的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組造模前后行為學結果 組內比較：除S組外，其余組造模前后不同時點MWT（F時間=218.116）和TWL（F時間=233.644）差異有統計學意義（P＜0.05）；各組MWT和TWL總體均呈下降變化，C組、M組和HM組T5時達到最低，H組MWT和各組TWL均在T4時達到最低。組間比較：各組間MWT（F組間=281.176）和TWL（F組間=76.298）差異均有統計學意義（P＜0.05）。T0和T1時，各組MWT和TWL差異均無統計學意義（P＞0.05）；T2—T5時，與S組比較，C組MWT和TWL均降低（P＜0.05）；與C組比較，H組MWT和TWL均升高，M組MWT和TWL均降低（P＜0.05）；與M組比較，HM組MWT和TWL均升高（P＜0.05），見表1、2。

2.2 各組脊髓自噬相關蛋白的表達 與S組比較，C組脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1和p62蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與C組比較，H組脊髓LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平降低；M組脊髓LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平降低，p62蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與M組比較，HM組脊髓LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖1、表3。

2.3 各組脊髓氧化應激水平相關指標的表達 與S組比較，C組脊髓SOD活性降低，MDA含量增加（P＜0.05）。與C組比較，H組脊髓SOD活性增強，MDA含量減少；M組脊髓SOD活性降低，MDA含量增加（P＜0.05）。與M組比較，HM組SOD活性增強，MDA含量減少（P＜0.05），見表4。

3 討論

CCI是研究神經病理性疼痛的一種常用建模方法，結扎坐骨神經可引起神經水腫及炎癥反應，模擬臨床上的自發性疼痛、痛覺過敏等癥狀。本研究結果顯示，與S組比較，C組T2—T5時大鼠MWT降低，TWL縮短，行為學表現為痛閾水平降低，提示神經病理性疼痛模型造模成功。有研究發現，富氫液因其抗氧化和抗炎等作用對神經病理性疼痛大鼠具有治療作用［2-3］。本研究結果顯示，與C組比較，H組T2—T5時大鼠MWT升高，TWL延長，行為學表現為痛閾水平提高，表明富氫液治療后大鼠的神經病理性疼痛減輕。

近年一些研究發現線粒體功能障礙在神經病理性疼痛的發生發展中起重要作用。Springer［7］等發現，外周神經損傷可干擾線粒體動力學，導致線粒體功能障礙和病理性活性氧產生增加，氧化應激水平增加，引起神經病理性疼痛。神經細胞通過自噬移除損傷的線粒體，發揮保護神經細胞的作用［8］。還有研究報道富氫液可通過介導自噬對帕金森病模型大鼠起到神經保護作用［9］。因此，針對線粒體功能障礙的清除途徑——線粒體自噬的研究可能是治療神經病理性疼痛的重要靶點。本研究采用自噬標志蛋白LC3、Beclin-1和p62反映脊髓細胞的自噬水平。LC3分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，LC3Ⅱ在自噬體膜表面表達，其與自噬泡數量呈正相關［10］，LC3Ⅱ表達上調代表自噬增多，也可能代表自噬體降解受阻。因此，本研究結合其他自噬標志蛋白p62和Beclin-1進行分析。p62作為自噬降解的標志物可與LC3結合，并通過泛素化底物的作用進入自噬小體并降解自噬泡，p62表達水平與細胞自噬的活性呈負相關［11］，Beclin-1與Ⅲ型PI3K結合形成復合物，以調節自噬前體中其他蛋白的定位，從而調節自噬活性［12］。本研究結果顯示，與S組比較，C組造模后14 d大鼠脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1和p62表達上調，表明CCI本身作為一種損傷刺激會誘發自噬現象，但p62表達上調提示自噬降解過程被抑制，自噬流受阻；與C組比較，H組大鼠脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1表達上調，而p62表達下調，自噬水平增加，行為學表現為MWT升高，TWL延長，大鼠痛閾水平提高，提示富氫液可能通過增加自噬水平減輕神經病理性疼痛；M組大鼠自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1表達下調，p62表達上調，自噬水平下降，行為學表現為MWT降低，TWL縮短，大鼠痛閾水平降低，提示抑制自噬水平后大鼠的神經病理性疼痛加重；與M組比較，HM組大鼠脊髓LC3Ⅱ、Beclin-1表達上調，而且p62表達下調，自噬水平增加，行為學表現為MWT升高，TWL延長，大鼠痛閾水平提高，進一步證明富氫液可以通過增加自噬水平減輕神經病理性疼痛。

有研究發現，在氧化應激過程中，星形膠質細胞自噬損傷會上調紅細胞衍生核因子2樣蛋白2（NFE2L2）［13］。這是一種在增加谷胱甘肽水平和抗氧化應激中發揮重要作用的關鍵蛋白［14-15］，自噬損傷亦增加了初級星形膠質細胞的活性氧水平，這可能與線粒體功能障礙有關，而自噬激活可下調NFE2L2及其靶基因的活性，并且自噬與NFE2L2通路的協同激活較單獨激活自噬具有更強的鎮痛作用。本研究采用SOD活力和MDA含量來反映機體氧化應激水平。SOD是一種清除自由基的內源性抗氧化酶，其活性可反映機體細胞清除活性氧的能力［16］。作為脂質過氧化反應的一種產物，MDA含量可反映機體內脂質過氧化程度［17］。本研究結果顯示，與C組比較，H組造模后14 d大鼠SOD活性增強，MDA含量減少，提示富氫液治療后大鼠氧化應激水平降低；M組大鼠SOD活性降低，MDA含量增加，提示自噬水平受抑制后大鼠氧化應激水平增加；與M組比較，HM組大鼠SOD活性增強，MDA含量減少，提示富氫液可通過減輕脊髓氧化應激來部分逆轉3-MA對神經病理性疼痛的加重作用。

綜上所述，富氫液可減輕大鼠神經病理性疼痛，抑制脊髓氧化應激，其機制與增加自噬有關。

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（2023-05-16收稿 2023-08-18修回）

（本文編輯 陳麗潔）