基于Nrf2/ARE抗氧化應激途徑探究烏梅丸對潰瘍性結腸炎小鼠的作用機制

陳靜 魏運姣 羅超 黃利華 陳橙 段莎莎

摘要：目的 探究烏梅丸基于核因子E2相關因子2（Nrf2）/抗氧化反應元件（ARE）抗氧化應激途徑對潰瘍性結腸炎（UC）小鼠的作用機制。方法 將70只SPF級雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組、UC組、美沙拉嗪組（MES組，0.82 g/kg MES）、烏梅丸低劑量組（WMW-L組，按生藥5 g/kg）、烏梅丸中劑量組（WMW-M組，按生藥10 g/kg）、烏梅丸高劑量組（WMW-H組，按生藥20 g/kg）和烏梅丸高劑量+Nrf2抑制劑ML-385組（WMW-H+ML-385組，烏梅丸按生藥20 g/kg+20 mg/kg ML-385），每組10只。末次給藥后，對小鼠進行疾病活動指數（DAI）評分及結腸黏膜損傷評分。HE染色觀察小鼠結腸黏膜組織的病理學變化。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定小鼠血清和結腸組織白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6水平。硫代巴比妥酸比色法（TBA）測定小鼠血清和結腸組織丙二醛（MDA）含量。黃嘌呤氧化酶法測定小鼠血清和結腸組織超氧化物歧化酶（SOD）活性。二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）直接法測定小鼠血清和結腸組織谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）活力。免疫組織化學染色法觀察小鼠結腸組織中Nrf2的陽性表達。Western blot檢測小鼠結腸組織血紅素加氧酶1（HO-1）和NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）蛋白的表達情況。結果 與對照組相比，UC組小鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分、結腸組織病理學評分升高，血清和結腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA水平升高，結腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達升高，血清和結腸組織中SOD、GSH-px水平降低（P＜0.05），結腸黏膜損傷嚴重。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠相應指標變化與上述相反，而結腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達升高（P＜0.05），結腸黏膜損傷減輕。WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組各指標變化呈劑量依賴性。WMW-H組與MES組差異無統計學意義；ML-385減弱了高劑量烏梅丸對UC小鼠結腸黏膜損傷的改善作用。結論 烏梅丸可能通過激活Nrf2/ARE抗氧化應激途徑減輕UC小鼠的結腸黏膜損傷。

關鍵詞：結腸炎， 潰瘍性；NF-E2相關因子2；抗氧化反應元件；氧化性應激；烏梅丸

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230533

The mechanism of Wumei pill on ulcerative colitis in mice based on Nrf2/ARE antioxidant stress pathway

CHEN Jing1， WEI Yunjiao2△， LUO Chao1， HUANG Lihua3， CHEN Cheng1， DUAN Shasha1

1 Department of Pediatrics， 2 Department of Pharmacy， 3 Department of Pathology， the Fourth Hospital of Wuhan，

Wuhan 430034， China

△Corresponding Author E-mail： grqxafrou5@163.com

Abstract： Objective To explore the mechanism of Wumei pill on ulcerative colitis （UC） in mice based on the anti oxidative stress pathway of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）/antioxidant response element （ARE）. Methods Seventy SPF male C57BL/6 mice were randomly divided into the control group， the UC group， the mesalazine group （MES group， 0.82 g/kg MES）， the low dose Wumei pill group （WMW-L group， 5 g/kg crude drug）， the middle dose Wumei pill group （WMW-M group， 10 g/kg crude drug）， the high dose Wumei pill group （WMW-H group， 20 g/kg crude drug） and the high dose Wumei pills+Nrf2 inhibitor ML-385 group （WMW-H+ML-385 group， Wumei pills crude drug 20 g/kg+20 mg/kg ML-385）， with 10 rats in each group. The disease activity index （DAI） score and colonic mucosa injury score were performed in mice after the last administration. Pathological changes of colonic mucosa in mice were observed by HE staining. The levels of interleukin （IL） -1β， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and IL-6 in serum and colon tissue of mice were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The content of malondialdehyde （MDA） in serum and colon tissue of mice was determined by thiobarbituric acid colorimetry （TBA）. The activity of superoxide dismutase （SOD） in serum and colon tissue of mice was measured by xanthine oxidase method. The activity of glutathione peroxidase （GSH-px） in serum and colon tissue of mice was determined by direct method with dithiodinitrobenzoic acid （DTNB）. The positive expression of Nrf2 in colon tissue of mice was observed by immunohistochemistry. The expression of heme oxygenase-1 （HO-1） and NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1 （NQO1） proteins in colon tissue of mice were detected by Western blot assay. Results Compared with the control group， the DAI score， colonic mucosa injury score， colonic histopathology score， levels of IL-1β， TNF-α， IL-6 and MDA in serum and colonic tissue， and expression levels of Nrf2， HO-1 and NQO1 protein in colonic tissue of mice were increased in the UC group， levels of SOD and GSH-px in serum and colon tissue decreased （P＜0.05）， the colon mucosa of mice was seriously damaged. Compared with the UC group， changes of corresponding indexes were contrary to the above in the MES group， the WMW-M group and the WMW-H group. However， the expression levels of Nrf2， HO-1 and NQO1 proteins in colon tissue were increased （P＜0.05）， and the damage of colon mucosa in mice was alleviated. Changes of the above indexes were dose-dependent in the WMW-L group， the WMW-M group and the WMW-H group. There were no significant differences in the above indexes between the WMW-H group and the MES group. ML-385 attenuated the improvement effect of high dose Wumei pill on colon mucosa injury. Conclusion Wumei pill may alleviate the colon mucosal damage of UC mice by activating Nrf2/ARE antioxidant stress pathway.

Key words： colitis， ulcerative; NF-E2-related factor 2; antioxidant response elements; oxidative stress; Wumei pill

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種非特異性的消化系統炎癥性疾病，患者主要癥狀為腹瀉、體質量下降、便血和腸道黏膜病理性損傷［1］。UC患者以青壯年人群多見，且難以痊愈、易復發［2-3］。由于UC的發病機制較為復雜，具體病因難以確定，因此探究UC的發病機制，尋找治療UC安全、有效的藥物成為臨床研究的重點。研究顯示，UC與氧化應激有著密切的聯系，UC患者存在嚴重的氧化還原系統失衡［4-5］。核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）途徑是一條重要的內源性抗氧化應激通路，Nrf2是帽領（cap‘ncollar，CNC）轉錄因子家族成員之一，是細胞抗氧化應激體系中的關鍵轉錄因子，能維持細胞氧化還原的穩態，當其與ARE結合時，在調節細胞抗氧化和抗炎基因的表達過程中具有重要作用［6-7］。烏梅丸來源于《傷寒論·厥陰病篇》，由烏梅、附子、干姜、細辛、川椒、桂枝、黃連、黃柏、人參、當歸等十味中藥組成，具有平調陰陽、和暢氣血等功效，常用于治療UC、心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤等［8］。已有大量證據表明烏梅丸治療UC具有顯著的作用，但其作用機制尚未明確。有研究者認為可能與其多成分作用于多靶點，影響多個信號通路有關［9-10］。本研究建立UC小鼠模型，探究烏梅丸治療UC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 70只雄性C57BL/6小鼠，6周齡，SPF級，體質量18～20 g，購自湖北省實驗動物研究中心，生產許可證號：SCXK（鄂）2020—0018。所有小鼠飼養在武漢大學動物實驗中心［使用許可證號：SYXK（鄂）2019—0013］SPF級環境中，溫度（22±2）℃、相對濕度50%～60%，人工光照黑暗循環12 h/12 h，小鼠自由獲取食物和水。適應性飼養7 d后用于后續實驗。本實驗經我院動物倫理委員會批準（批準號：H20220923），實驗過程符合3R原則。

1.1.2 主要藥物制備 烏梅丸由本院中藥房煎制，由烏梅16 g、細辛6 g、桂枝6 g、附子6 g、干姜10 g、川椒4 g、黃連16 g、黃柏6 g、人參6 g、當歸4 g組成。以上藥物中附子先煎0.5 h，其他藥物加水浸泡0.5 h后加入，常規煎煮2次后混合、過濾、水浴、蒸發，制成1 g/mL（以生藥含量計）的水煎液，4 ℃冰箱保存備用。美沙拉嗪緩釋顆粒購自上海愛的發制藥有限公司，研磨后用100目篩過篩，以蒸餾水溶解配制成0.041 g/mL的混懸藥液，置于4 ℃儲存。

1.1.3 主要試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）購自美國MP Biomedicals公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、NAD（P）H：醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase-1，NQO1）、GAPDH、Nrf2一抗和羊抗兔IgG二抗購自Cell Signaling Technology公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）試劑盒購自南京建成生物研究所。凝膠成像儀、iMark多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 UC小鼠模型的建立 參照文獻［11］方法和本實驗室前期預實驗結果，構建小鼠UC模型。造模前小鼠禁食24 h，不禁水。24 h后提起鼠尾將其懸空，使掙扎以排出大腸遠端的糞便。隨機抽取60只C57BL/6小鼠，自由飲用5%DSS溶液7 d制備UC模型，第8天全部更換為蒸餾水。當小鼠出現精神萎靡、食欲減退、懶動、體質量下降，逐漸出現黏液膿血便，則說明UC小鼠模型建立成功。

1.2.2 動物分組與給藥 將成功造模的60只UC小鼠按隨機數字表法分為UC組、美沙拉嗪組（MES組，0.82 g/kg MES）、烏梅丸低劑量組（WMW-L組，按生藥5 g/kg）、烏梅丸中劑量組（WMW-M組，按生藥10 g/kg）、烏梅丸高劑量組（WMW-H組，按生藥20 g/kg）和烏梅丸高劑量+Nrf2抑制劑ML-385組（WMW-H+ML-385組，烏梅丸按生藥20 g/kg+20 mg/kg ML-385［12］），每組10只。另10只未造模小鼠設為對照組，自由飲用蒸餾水。本實驗劑量的設置根據前期預實驗結果來確定。UC模型建立后MES組、WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組按相應藥物劑量灌胃烏梅丸和MES，并腹腔注射等量生理鹽水；WMW-H+ML-385組灌胃相應劑量烏梅丸，腹腔注射ML-385；對照組和UC組灌胃和腹腔注射等量的生理鹽水。每日1次，共14 d。

1.2.3 小鼠疾病活動指數（DAI）評分 末次給藥后，根據小鼠體質量、大便性狀及便血情況進行DAI評分［13］。0分：體質量無降低，大便性狀正常，無便血；1分：體質量降低1%～5%，大便松散，大便隱血；2分：體質量降低6%～10%，大便松散，大便隱血；3分：體質量降低11%～15%，大便稀溏，肉眼血便；4分：體質量降低大于15%，大便稀溏，肉眼血便。

1.2.4 小鼠結腸黏膜損傷評分 末次給藥后，所有小鼠禁食不禁水24 h，次日小鼠摘眼球取血，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，分裝后置-20 ℃冰箱保存待測。所有小鼠脫頸處死，立即解剖，取出肛門至盲腸末端的整個腸段，迅速沿著腸系膜縱軸剪開，用預冷生理鹽水漂洗干凈，然后將結腸平展開，觀察腸黏膜的潰瘍和炎癥情況，對小鼠進行結腸黏膜損傷評分［14］。評分標準：0分，正常無損傷；1分，充血但沒有潰瘍；2分，充血且腸壁增厚，無潰瘍；3分，1處較小潰瘍灶，直徑<1 cm；4分，較大潰瘍，直徑1～2 cm，無腸管與周邊臟器粘連；5分：潰瘍灶直徑1～2 cm，但腸管增厚，且與鄰近臟器嚴重粘連。之后將其剪成2部分，其中一部分放入-80 ℃保存，另一部分放入4%多聚甲醛固定，待制備病理切片。

1.2.5 HE染色觀察小鼠結腸黏膜組織學變化 取1.2.4中多聚甲醛固定后的結腸組織，進行石蠟包埋、切片（5 μm），根據HE染色試劑盒說明書進行HE染色、封片，在光鏡下（400倍）觀察各組小鼠結腸的組織學改變情況，根據參考文獻［15］的病理學評分標準進行病理學評分。

1.2.6 血清和結腸組織炎性因子、氧化指標的檢測 取1.2.4中血清和凍存的結腸組織，結腸組織制備組織勻漿，勻漿以3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒檢測血清和結腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

硫代巴比妥酸比色法（TBA）測定小鼠血清和結腸組織MDA含量。取勻漿液或血清0.5 mL置于10 mL試管中，加入2 mL 0.6%TBA，用保鮮膜封口，扎一小孔后沸水浴15 min，取出后用流水冷卻，1 000 r/min離心10 min，取上清液，采用酶標儀測定450 nm、532 nm和600 nm波長處的吸光度（A）值。CMDA=6.45×（A532-A600）-0.56×A450。

采用黃嘌呤氧化酶法測定小鼠血清和結腸組織SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）直接法測定小鼠血清和結腸組織GSH-px活力，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 免疫組織化學染色檢測小鼠結腸組織Nrf2蛋白表達 取1.2.5中制備的結腸組織切片，經過烤片、脫蠟、梯度乙醇脫水等操作后，使用枸櫞酸溶液浸泡切片以修復抗原。3%過氧化氫孵育，10%胎牛血清室溫下封閉。然后使用PBS清洗，根據免疫組化染色試劑盒說明書加入Nrf2一抗（1∶400），4 ℃過夜。次日經PBS洗滌后加入二抗，室溫孵育30 min；再次使用PBS洗滌，加入DAB顯色，蘇木素復染，清水沖洗，透明，二甲苯揮發、封片。在顯微鏡下觀察并拍照。棕褐色或棕黃色著色的為陽性細胞。

1.2.8 Western blot法檢測小鼠結腸組織HO-1、NQO1蛋白的表達 用RIPA裂解液提取1.2.4中凍存的結腸組織總蛋白，并根據BCA蛋白定量檢測試劑盒對蛋白進行定量。用凝膠電泳分離蛋白質，并進行PVDF轉膜。用5%脫脂奶粉封閉后，將膜與HO-1（1∶1 000）、NQO1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗在4 ℃下孵育過夜。次日，在常溫下加入相應二抗（1∶5 000），繼續孵育2 h，加入ECL試劑進行顯色，在凝膠成像儀下進行曝光，以GAPDH蛋白作為內參，利用Image Lab軟件對目標蛋白的灰度值進行計算。

1.3 統計學方法 應用Graph Pad Prism 7.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（[[x] ±s]）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分、結腸組織病理學評分比較 與對照組相比，UC組小鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分、結腸組織病理學評分升高（P＜0.05）；與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分、結腸組織病理學評分下降（P＜0.05），WMW-L組變化差異無統計學意義（P＞0.05）；WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組小鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分、結腸組織病理學評分依次降低（P＜0.05）；WMW-H組小鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分、結腸組織病理學評分低于WMW-H+ML-385組（P＜0.05），與MES組差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組小鼠結腸組織病理學改變 對照組小鼠結腸組織結構正常，層次分明，腺體排列有序，黏膜、固有層、肌層未見明顯異常。與對照組相比，UC組小鼠結腸組織隱窩結構丟失、杯狀細胞減少，潰瘍形成，伴有大量炎性細胞浸潤。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠結腸組織隱窩結構破壞減輕，上皮結構和杯狀細胞結構相對完整，炎性細胞浸潤減少；WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組結腸組織損傷依次減輕。WMW-H+ML-385組結腸組織損傷較WMW-H組加重。見圖1。

2.3 各組小鼠血清和結腸組織炎性因子比較 與對照組相比，UC組小鼠血清和結腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠血清和結腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05），WMW-L組無明顯變化（P＞0.05）。WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組小鼠血清和結腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平依次降低（P＜0.05）；WMW-H組小鼠血清和結腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平低于WMW-H+ML-385組（P＜0.05），與MES組差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.4 各組小鼠血清和結腸組織氧化應激指標比較 與對照組相比，UC組小鼠血清和結腸組織中SOD、GSH-px水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠血清和結腸組織中SOD、GSH-px水平升高，MDA水平降低（P＜0.05），WMW-L組無明顯變化（P＞0.05）。WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組小鼠血清和結腸組織中SOD、GSH-px水平依次升高，MDA水平依次降低（P＜0.05）；WMW-H組小鼠血清和結腸組織中SOD、GSH-px水平高于WMW-H+ML-385組，MDA水平低于WMW-H+ML-385組（P＜0.05），小鼠血清和結腸組織SOD、MDA、GSH-px水平與MES組差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.5 各組小鼠結腸組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平比較 與對照組相比，UC組小鼠結腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達升高（P＜0.05）。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠結腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達升高（P＜0.05），WMW-L組無明顯變化（P＞0.05）。WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組小鼠結腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達依次升高（P＜0.05）；WMW-H組小鼠結腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達高于WMW-H+ML-385組（P＜0.05），與MES組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2—5。

3 討論

UC的發病原因目前尚未明確，研究認為UC的發生發展與環境、遺傳、免疫、精神心理等因素密切相關［16］。研究顯示，在全世界范圍內UC的患病率較高［17］。目前臨床治療UC一般采取控制炎癥、抑制免疫反應等手段為主。本研究采取DSS誘導小鼠發生UC，這種建模方法與人類患UC相似，造模方法簡便，成功率高，是研究UC常用的模型。氧化應激與UC的發病密切相關，是UC重要的發病機制之一。SOD、GSH-px水平降低和MDA水平升高標志體內氧化應激反應的過度激活，能客觀反映機體脂質過氧化反應對組織的損傷程度［18］。本研究結果顯示，與對照組相比，UC組小鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分、結腸組織病理學評分、血清和結腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6及SOD、GSH-px水平均升高，MDA水平降低，與蔣曉梅等［14］研究結果一致，提示DSS可誘導小鼠發生結腸炎性損傷和氧化應激損傷，UC小鼠模型構建成功。

烏梅丸是中醫中“寒熱并用、溫清結合、斂肺固澀”的代表方，方中重用味酸之烏梅，取其酸主收澀，可澀腸止瀉；川椒、細辛、附子、桂枝、干姜均為辛熱之品，既可溫中祛寒，又可溫腎暖脾而助運；黃連、黃柏味苦性寒，苦能下蛔，寒能清熱，可清熱燥濕止痢，人參、當歸益氣補血，扶助正氣，且合桂枝養血通脈，調和陰陽以解四肢厥冷。全方組寒熱并用，邪正兼顧，攻補兼施，通理氣血，調和三焦，共奏溫中補虛、清熱燥濕止痢之功效［19-20］。烏梅丸對UC具有顯著的治療效果。研究發現，烏梅丸對2，4，6-三硝基苯磺酸誘導的UC模型大鼠具有顯著的調節作用，且可通過抑制Toll樣受體/核轉錄因子-κB/髓樣分化因子8（TLRs/NF-κB/myD88）信號通路的活化降低促炎細胞因子的表達，減少炎性因子釋放，從而減輕UC反應［21-22］。本研究結果顯示，與UC組相比，WMW-M組、WMW-H組小鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分、結腸組織病理學評分、血清和結腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA水平顯降低，血清和結腸組織中SOD、GSH-px水平顯著升高；與上述研究一致，說明使用烏梅丸對UC小鼠結腸黏膜損傷的修復作用比自然修復效果好，提示烏梅丸，尤其是高劑量烏梅丸可以減輕UC小鼠的結腸黏膜損傷，其機制與降低炎癥反應、改善氧化應激水平有關。

正常生理狀態下，Nrf2存在于細胞質中且處于失活狀態。當細胞受到炎癥、紫外線輻射或氧化應激等刺激時，Nrf2活化從細胞質中轉位進入細胞核，與ARE結合，并激活ARE下游一系列抗氧化基因的表達，誘導GSH-px、SOD等多種抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶（如HO-1、NQO1）的產生，從而加速清除氧自由基等氧化物質，維持細胞內的氧化還原平衡，減輕機體損傷［23］。林培琦等［24］研究發現Nrf2/ARE信號通路的激活能減輕DNA損傷、促進受損DNA的修復和抑制放射誘導的細胞凋亡，減輕放射治療中的組織損傷。Ma等［25］研究發現Farrerol通過激活Nrf2/ARE信號通路，有效抑制了順鉑誘導的炎癥和腎纖維化，為急性腎損傷的治療提供了新的潛在靶點。本研究結果顯示，與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠結腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達顯著升高；WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組各指標變化呈劑量依賴性。提示烏梅丸可能通過激活Nrf2/ARE抗氧化應激途徑減輕UC小鼠的結腸黏膜損傷。為驗證此猜想，本研究采用Nrf2抑制劑ML-385來干預高劑量烏梅丸組，結果發現ML-385減弱了烏梅丸對UC小鼠結腸黏膜損傷的改善作用，提示烏梅丸對UC小鼠結腸黏膜損傷的改善作用與激活Nrf2/ARE抗氧化應激途徑相關。

綜上所述，烏梅丸可能通過激活Nrf2/ARE抗氧化應激途徑減輕UC小鼠的結腸黏膜損傷。本研究為UC的靶向治療和發病機制研究提供了新的依據。然而，烏梅丸是否通過其他途徑和分子機制治療UC尚待進一步探究。

參考文獻

［1］ WIRTZ S，POPP V，KINDERMANN M，et al. Chemically induced mouse models of acute and chronic intestinal inflammation［J］. Nat Protoc，2017，12（7）：1295-1309. doi：10.1038/nprot.2017.044.

［2］ KUCHARZIK T，KOLETZKO S，KANNENGIESSER K，et al. Ulcerative colitis-diagnostic and therapeutic algorithms［J］. Dtsch Arztebl Int，2020，117（33/34）：564-574. doi：10.3238/arztebl.

2020.0564.

［3］ DU L，HA C. Epidemiology and pathogenesis of ulcerative colitis［J］. Gastroenterol Clin North Am，2020，49（4）：643-654. doi：10.1016/j.gtc.2020.07.005.

［4］ ELMAKSOUD H A A，MOTAWEA M H，DESOKY A A，et al. Hydroxytyrosol alleviate intestinal inflammation，oxidative stress and apoptosis resulted in ulcerative colitis［J］. Biomed Pharmacother，2021，142：112073. doi：10.1016/j.biopha.2021.112073.

［5］ CHEN S，WU X，YU Z. Juglone suppresses inflammation and oxidative stress in colitis mice［J］. Front Immunol，2021，12：674341. doi：10.3389/fimmu.2021.674341.

［6］ HOU Y，LI X，PENG S，et al. Lipoamide ameliorates oxidative stress via induction of Nrf2/ARE signaling pathway in PC12 cells［J］. J Agric Food Chem，2019，67（29）：8227-8234. doi：10.1021/acs.jafc.9b02680.

［7］ 馬娟，郭銀雪，謝恂，等. 穿山龍總皂苷經Nrf2/ARE通路抑制慢性腎臟病大鼠血管鈣化的作用［J］. 中國老年學雜志，2022，42（12）；3011-3016. MA J，GUO Y X，XIE X，et al. Inhibition effect of total saponin from rhizoma dioscorea nipponica on vascular calcification in rats with chronic kidney disease via Nrf2/ARE pathway［J］. Chinese Journal of Gerontology，2022，42（12）：3011-3016. doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2022.12.045.

［8］ 朱黎紅，張衛華. 烏梅丸臨證思考［J］. 浙江中醫藥大學學報，2019，43（8）：786-788. ZHU L H，ZHANG W H. Thoughts on the clinical syndrome differentiation of Wumei pill［J］. Journal of Zhejiang Chinese Medical University，2019，43（8）：786-788. doi：10.16466/j.issn1005-5509.2019.08.012.

［9］ 曾榮，金小晶. 烏梅丸治療潰瘍性結腸炎臨床應用綜述［J］. 遼寧中醫藥大學學報，2020，22（6）：115-118. ZENG R，JIN X J. A review of the clinical application of Wumei pill in ulcerative colitis［J］. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，2020，22（6）：115-118. doi：10.13194/j.issn.1673-842x.2020.06.029.

［10］ 馬清林，臧凱宏，杜麗東，等. 烏梅丸治療潰瘍性結腸炎的網絡藥理學研究［J］. 中藥藥理與臨床，2019，35（2）：11-16. MA Q L，ZANG K H，DU L D，et al. Network pharmacology study of Wumei Pill in the treatment of ulcerative colitis［J］. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica，2019，35（2）：11-16. doi：10.13412/j.cnki.zyyl.2019.02.003.

［11］ 付敏軍，石榮珍，沈建君，等. 新麥纖散對DSS誘導UC大鼠的治療作用及機制分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2018，24（5）：126-130. FU M J，SHI R Z，SHEN J J，et al. Curative effect and mechanism of Xinmaixian Powder on ulcerative colitis rats induced by dextran sodium sulfate［J］. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2018，24（5）：126-130. doi：10.13422/j.cnki.syfjx.2018050126.

［12］ 殷玉琨，陳佳陽，劉麗星，等. Nrf2抑制劑ML-385腹腔注射對小鼠乳腺癌骨轉移的抑制作用及其與骨橋蛋白的關系［J］. 山東醫藥，2022，62（23）：45-48. YIN Y K，CHEN J Y，LIU L X，et al. Inhibitory effect of intraperitoneal injection of Nrf2 inhibitor ML-385 on bone metastasis of mouse breast cancer and its relationship with osteopontin［J］. Shandong Medical Journal，2022，62（23）：45-48. doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.23.010.

［13］ 王雨欣，黃雨彤，楊盼盼，等. 水蘇糖對小鼠潰瘍性結腸炎的改善作用［J］. 中國食品學報，2022，22（10）：171-179. WANG Y X，HUANG Y T，YANG P P，et al. The protective effect of stachyose on ulcerative colitis in mice［J］. Journal of Chinese Institute Of Food Science and Technology，2022，22（10）：171-179. doi：10.16429/j.1009-7848.2022.10.019.

［14］ 蔣曉梅，劉翀，朱延焱. 黃連總生物堿對潰瘍性結腸炎模型大鼠腸黏膜損傷及p38-PPARγ/NF-κB通路的影響［J］. 中國藥師，2019，22（12）：2188-2193. JIANG X M，LIU C，ZHU Y Y. Effects of the total alkaloids of coptis chinensis on intestinal mucosal injury and p38-PPARγ/NF-κB pathway in rats with ulcerative colitis［J］. China Pharmacist，2019，22（12）：2188-2193. doi：10.3969/j.issn.1008-049X.2019.12.007.

［15］ 車璐. 蒲公英甾醇對潰瘍性結腸炎的保護作用及其機制［D］. 鄭州：鄭州大學，2020. CHE L. Protective effect of dandelion sterol on ulcerative colitis and its mechanism［D］. Zhengzhou：Zhengzhou University，2020.

［16］ PORTER R J，KALLA R，HO G T. Ulcerative colitis：Recent advances in the understanding of disease pathogenesis［J］. F1000Res，2020，9：F1000 Faculty Rev-294. doi：10.12688/f1000research.20805.1.

［17］ FEUERSTEIN J D，MOSS A C，FARRAYE F A. Ulcerative Colitis［J］. Mayo Clin Proc，2019，94（7）：1357-1373. doi：10.1016/j.mayocp.2019.01.018.

［18］ SHEN J，CHENG J，ZHU S，et al. Regulating effect of baicalin on IKK/IKB/NF-kB signaling pathway and apoptosis-related proteins in rats with ulcerative colitis［J］. Int Immunopharmacol，2019，73：193-200. doi：10.1016/j.intimp.2019.04.052.

［19］ 張云娜，韓俊泉，劉喆，等. 烏梅丸治療潰瘍性結腸炎的學術經驗［J］. 中國中西醫結合外科雜志，2023，29（4）：535-536. ZHANG Y N，HAN J Q，LIU Z，et al. Academic experience of Wumei Pill in treating ulcerative colitis［J］. Chinese Journal of Surgery of Integrated Traditional and Western Medicine，2023，29（4）：535-536. doi： 10.3969/j.issn.1007-6948.2023.04.022.

［20］ 何夢婷，黃凱歌，陳德軒. 從烏梅丸淺談厥陰病類腹痛的治療［J］. 中醫臨床研究，2022，14（22）：104-106. HE M T，HUANG K G，CHEN D X. A brief discussion on treating abdominal pain of Jueyin disease with Wumei Wan［J］. Clinical Journal Of Chinese Medicine，2022，14（22）：104-106. doi：10.3969/j.issn.1674-7860.2022.22.030.

［21］ 郭琴，張立石，王穎，等. 烏梅丸及其拆方對TNBS致潰瘍性結腸炎大鼠的作用研究［J］. 中國中醫基礎醫學雜志，2021，27（7）：1099-1103. GUO Q，ZHANG L S，WANG Y，et al. Effects of Wumei Pill and its separated prescriptions on TNBS induced ulcerative colitis in rats［J］. Journal of Basic Chinese Medicine，2021，27（7）：1099-1103. doi：10.19945/j.cnki.issn.1006-3250.2021.07.015.

［22］ 張旭東，劉宏巖. 烏梅丸對潰瘍性結腸炎大鼠TLRs/NF-κB/myD88信號通路影響的研究進展［J］. 吉林中醫藥，2019，39（3）：410-413. ZHANG X D，LIU H Y. Research progress on the effect of Wumei Pill on TLRs/NF-κB/myD88 signal pathway of ulcerative colitis in rats［J］. Jilin Journal of Chinese Medicine，2019，39（3）：410-413. doi：10.13463/j.cnki.jlzyy.2019.03.038.

［23］ HE F，ANTONUCCI L，KARIN M. NRF2 as a regulator of cell metabolism and inflammation in cancer［J］. Carcinogenesis，2020，41（4）：405-416. doi：10.1093/carcin/bgaa039.

［24］ 林培琦，龍遠鑄，張霓霓，等. Nrf2/ARE信號通路激活對放射治療中減輕組織損傷的作用機制［J］. 中國組織工程研究，2022，26（11）：1780-1787. LIN P Q，LONG Y Z，ZHANG N N，et al. Activation of Nrf2/ARE signal pathway reduces radiotherapy-induced tissue injury［J］. Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2022，26（11）：1780-1787. doi：10.12307/2022.366.

［25］ MA N，WEI Z，HU J，et al. Farrerol ameliorated cisplatin-induced chronic kidney disease through mitophagy induction via Nrf2/PINK1 pathway［J］. Front Pharmacol，2021，12：768700. doi：10.3389/fphar.2021.768700.

（2023-04-18收稿 2023-05-18修回）

（本文編輯 陳麗潔）