肉豆蔻曲代替麩煨肉豆蔻組成方新二神丸的止瀉作用研究

范蒙蒙張雨李紅偉張振凌李凱?

（1. 河南中醫藥大學，鄭州 450046；2. 河南省中藥特色炮制技術工程研究中心，鄭州 450046；3. 國家中醫藥管理局中藥炮制傳承基地，鄭州 450046）

曲類中藥多具有消導之功，可健脾消食，促進胃腸運動，《本草經疏》中有類似記載：“古人用曲，即造酒之曲，其氣味甘溫，性專消導，行脾胃滯氣，散臟腑風冷”。 中藥發酵是借助微生物的自身代謝，對原藥材中化學成分進行分解、加工、結構修飾，達到“增效”和“減毒”的目的，可對中藥的藥性以及藥理作用產生影響[1-3]。 有研究表明，附子經發酵后，生物堿含量顯著降低；黃芪發酵產物的總黃酮含量、體外抗氧化和降糖作用顯著增強；固態發酵葛根渣比直接醇提葛根渣獲得的葛根素含量提高了74.8%，發酵技術的應用為中藥創新發展提供了廣闊空間[4-10]。

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥種仁[11]，其味辛，性溫，歸脾、胃、大腸經，具有溫中行氣、澀腸止瀉的功效，臨床可用于治療脾胃虛寒、久瀉不止、脘腹脹痛、食少嘔吐。 已有研究表明，麩煨肉豆蔻和鹽補骨脂配伍組成的二神丸對脾腎陽虛泄瀉模型有較好的干預效果[12-15]。 肉豆蔻生品中含有大量揮發油，有滑腸之弊，煨制后，揮發油含量顯著降低，其止瀉成分甲基丁香酚、甲基異丁香酚含量升高，毒性成分肉豆蔻醚、黃樟醚含量降低[16]，故臨床多用其炮制品，但大劑量地使用煨肉豆蔻亦可能有產生毒性的風險，因此開發可替代麩煨肉豆蔻的新飲片具有重要意義。本研究受“曲類中藥多具有消導之功，可健脾消食”的啟發，制備肉豆蔻曲，探討肉豆蔻曲及其配伍組成二神丸能否對脾腎陽虛泄瀉起到良好的干預效果，并采用16S rDNA 測序技術，探討其作用機制，為新飲片的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

70 只清潔級雄性KM 小鼠，4 周齡，體重18 ～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK（京）2019-0008】，飼養于河南中醫藥大學動物實驗室【SYXK（豫）2021-0015】，自由飲食飲水，提供12 h 光照與12 h 黑暗晝夜光照變化周期，室溫20 ～25 ℃，相對濕度40% ～65%，飼養環境清潔衛生。 嚴格遵循實驗動物使用的3R 原則，所有操作均符合河南中醫藥大學動物實驗倫理學要求（DWLLGZR202202193）。

1.1.2 藥物

肉豆蔻（211201，安徽惠豐國藥有限公司）、補骨脂（211001，安徽惠豐國藥有限公司）、番瀉葉（皖20210456，安徽康和中藥科技有限公司）。

1.1.3 主要試劑與儀器

氫化可的松注射液（2106203，國藥集團容生制藥有限公司）；MTL、GAS、CORT、TSH、T、TNF-α、IL-1β 酶聯免疫檢測試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司（202302）。 恒溫恒濕培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HWL-125 型電熱恒溫干燥箱（天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司）；TGL-16M 型高速冷凍離心機（常州金壇良友儀器有限公司）；EPOCH2NSC-SN 酶標儀（美國Agilent 公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

（1）肉豆蔻曲：取肉豆蔻粉末（5 號篩）80 g、麥麩13 g、面粉8 g，將面粉加蒸餾水100 mL 加熱制成稀糊，冷卻至室溫，與上述藥粉揉和均勻，以手捏成團，擲之即散為宜，捏制成方塊，放入恒溫恒濕培養箱（溫度：32 ℃，濕度：85% ～90%）內發酵48 h，發酵完成后于50 ℃恒溫干燥箱干燥24 h，即得。

（2）麩煨肉豆蔻、鹽補骨脂：按照《中國藥典》（2020 版）相關項下方法制備。

（3）藥物混懸液的制備： ①二神丸混懸液：將3 種組合中的補骨脂和肉豆蔻按2 ∶1配比，粉碎成細粉，加蒸餾水均勻混合配制成0.24 g／mL 的混懸液，備用。 ②鹽補骨脂、肉豆蔻曲混懸液：取鹽補骨脂、肉豆蔻曲適量，粉碎成細粉，加蒸餾水均勻混合配制成0.24 g／mL 的混懸液，備用。 ③二神丸Ⅰ組為鹽補骨脂＋麩煨肉豆蔻；二神丸Ⅱ組為鹽補骨脂＋肉豆蔻曲；二神丸Ⅲ組為鹽補骨脂＋肉豆蔻生品。④番瀉葉水煎液的制備：取適量番瀉葉，浸泡1 h，加水煮沸30 min，過濾，減壓濃縮成0.5 g／mL 的藥液，備用。

1.2.2 分組、造模及給藥

取70 只雄性健康KM 小鼠，適應性喂養3 d，隨機分為7 組（正常組、模型組、二神丸Ⅰ組、二神丸Ⅱ組、二神丸Ⅲ組、鹽補骨脂組和肉豆蔻曲組）。 除正常組，各組小鼠每天按0.1 mL／10 g 體重頸部皮下注射氫化可的松注射液，連續7 d，致腎陽虛，從第8 天開始，停止給予氫化可的松注射液，上午用番瀉葉水煎液（0.2 mL／10 g）連續灌胃至第17 天，致脾陽虛，正常組給予同等體積生理鹽水。 除正常組和模型組，其余各給藥組從第8 天開始，每天下午灌胃給藥，連續給藥10 d，各給藥組分別按0.2 mL／10 g體重灌胃給藥，正常組和模型組給予同等體積的生理鹽水。

1.2.3 一般行為學觀察

每天觀察記錄小鼠的一般狀態。

1.2.4 臟器指數檢測

小鼠麻醉處死后，迅速摘取脾、胸腺、腎、睪丸、腎上腺等臟器，去除多余結締組織，稱定重量，計算臟器指數（臟器指數＝器官重量／體重× 100%）。

1.2.5 病理組織學檢查

將脾、腎、睪丸等臟器，用生理鹽水沖洗，組織固定液固定，乙醇逐級脫水，常規石蠟包埋，切片，以蘇木精-伊紅染色并在顯微鏡下觀察。

1.2.6 生化指標測定

小鼠麻醉后取血，分離血清，ELISA 法檢測血清中MTL、GAS、CORT、TSH、T、TNF-α、IL-1β 水平。

1.2.7 小腸推進率、胃殘留率

末次給藥前禁食12 h，自由飲水。 末次給藥后1 h，灌胃炭末糊（5%活性炭）每只2 mL。 求得小腸推進率及胃殘留率[17]（小腸推進率＝（炭末在小腸推進距離／小腸全長） × 100%、胃殘留率＝（胃全-胃凈）／灌胃量× 100%）。

1.2.8 腸道菌群檢測

小鼠取血后迅速開腹，取出腸組織，收集腸內容物，放入無菌凍存管，置于-80 ℃超低溫冰箱保存，以待后續進行16S rDNA 測序。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0 進行統計分析，數據以平均值± 標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗，P＜0.05 表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般行為學觀察

造模前，所有組小鼠精神狀態良好，毛發潔白有光澤，糞便呈顆粒狀。 造模3 d 后，除正常組外，小鼠活動量減少，毛色暗黃，大便稀軟；7 d 后模型組小鼠體型逐漸消瘦，毛發枯糙，出現拱背卷曲、排水樣便、肛周污穢等情況；給藥后，各給藥組小鼠狀況均出現不同程度好轉。

2.2 臟器指數

由表1 可知，模型組各臟器指數顯著低于正常組，說明造模后各臟器均發生不同程度病變；各給藥組小鼠臟器指數較模型組出現不同程度升高，其中二神丸Ⅱ組對脾腎陽虛泄瀉小鼠臟器指數的干預效果優于其他給藥組。

表1 各組小鼠脾、腎、腎上腺、胸腺、睪丸的臟器指數（± s，n ＝10）Table 1 Organ index of spleen， kidney， adrenal gland， thymus gland， and testis in each group of mice （± s，n ＝10）

表1 各組小鼠脾、腎、腎上腺、胸腺、睪丸的臟器指數（± s，n ＝10）Table 1 Organ index of spleen， kidney， adrenal gland， thymus gland， and testis in each group of mice （± s，n ＝10）

注：與正常組相比，??P ＜0.01；與模型組相比，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01；與二神丸Ⅰ組相比，＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01。 （下表同）Note. Compared with normal group， ??P ＜0.01. Compared with model group， ＃P ＜0.05， ＃＃P ＜0.01. Compared with ershen pills Ⅰgroup， ＆P ＜0.05， ＆＆P ＜0.01. （The same in the following tables）

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2.3 病理組織學檢查

如圖1 所示，腎組織切片中：與正常組相比，模型組小鼠腎小球萎縮，腎小囊體積變大，腎小管出現空泡，細胞形態發生改變，各給藥組出現不同程度好轉，其中二神丸Ⅰ、Ⅱ組對腎小球形態的改善效果最明顯，二神丸Ⅱ組腎小管的破壞明顯減輕；睪丸組織切片中，正常組小鼠生精細胞排列整齊，基底膜完整，精原細胞排列整齊，精子數量豐富，模型組小鼠生精細胞形態發生改變，基底膜受損，精原細胞紊亂，未見成熟的精子，各給藥組中以二神丸Ⅰ、Ⅱ組對睪丸組織的恢復效果最佳；脾組織切片中：與正常組相比，模型組小鼠白髓萎縮，白髓中淋巴細胞明顯減少，白髓與紅髓交界的邊緣區模糊，各給藥組淋巴細胞出現不同程度的增多。

圖1 各組小鼠病理組織的HE 染色切片Note. Red arrow. Glomerulus. Green arrow. Renal tubules. Blue arrow. Basement membrane. Yellow arrow. Spermatogenic cells. Black arrow. Sperm. Orange. Lymphocytes.Figure 1 HE staining sections of pathological tissues in each group of mice

2.4 血清生化指標檢測

與正常組相比，模型組小鼠胃腸激素相關血清指標GAS 水平下降、MTL 水平上升；腎功能相關指標CORT、TSH、T 水平均下降；炎癥因子相關指標TNF-α、IL-β 水平均上升，給藥后，血清各指標水平均有不同程度改善，二神丸Ⅰ、Ⅱ組對血清相關指標的干預效果優于其他給藥組，且兩組之間無明顯差異，說明二神丸Ⅰ、Ⅱ組對脾腎陽虛泄瀉模型小鼠的血清生化指標均有顯著的改善效果，見表2。

表2 各組小鼠血清相關指標檢測（± s，n ＝10）Table 2 Detection of serum related indicators in each group of mice（± s，n ＝10）

表2 各組小鼠血清相關指標檢測（± s，n ＝10）Table 2 Detection of serum related indicators in each group of mice（± s，n ＝10）

注：與正常組相比， ?P ＜0.05。Note. Compared with normal group， ?P ＜0.05.

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2.5 對小腸推進及胃排空的影響

與正常組相比，模型組小鼠小腸推進率顯著升高、胃殘留率降低，各給藥組小鼠小腸推進率水平低于模型組，二神丸Ⅰ、Ⅱ組以及肉豆蔻曲組胃殘留率顯著升高。 實驗結果見表3，說明二神丸Ⅰ、Ⅱ組對脾腎陽虛泄瀉模型小鼠胃腸功能的干預效果優于其他組，且二神丸Ⅱ組效果更佳，二神丸Ⅲ組與鹽補骨脂組對小腸功能的干預作用更強，但其顯著低于正常水平，可能引發胃腸道副作用。

表3 各組小鼠小腸推進率和胃殘留率（± s，n ＝10）Table 3 Small intestine propulsion rate and gastric residue rate of mice in each group（± s，n ＝10）

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2.6 腸道菌群結果

2.6.1 各組小鼠腸道菌群OTU 聚類分析結果

以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（見圖2），7 組小鼠腸道菌群檢測共檢出3083 個OTU，組間共有OTU 為45 個，與正常組相比，模型組OTU明顯降低，與模型組相比，各給藥組OTU 出現不同程度升高，說明脾腎陽虛泄瀉模型會降低小鼠腸道菌群多樣性，給藥后物種多樣性得到改善，二神丸Ⅱ組對腸道菌群的改善作用優于二神丸Ⅰ組。

圖2 各組小鼠腸道菌群OTU 聚類分析結果Note. A. Normal group. B. Ershen pills I group. C. Ershen pills Ⅱgroup. D. Ershen pills III group. E. Salt psoralen group. F.Nutmeg koji group. G. Model group.Figure 2 OTU cluster analysis results of gut microbiota in each group of mice

2.6.2 α 多樣性與β 多樣性分析

α 多樣性指數反映樣本內物種多樣性，由圖3可知，與正常組相比，模型組Shannon、Simpson、ACE、Chao1 指數均明顯降低，與模型組比較，二神丸Ⅰ、Ⅱ組與肉豆蔻曲組各指標明顯上升，組間比較未見顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠腸道菌群箱線圖Figure 3 Box plot of gut microbiota in each group of mice

β 多樣性反映不同組間的群落多樣性，主要用于樣本組間差異的比較，樣本距離越近，表示物種組成結構越相似。 由圖4 可知，不同組樣本在群落結構及組成上和模型組之間的存在差異。

圖4 基于weighted unifrac 算法的PCoA 圖Figure 4 PCoA diagram based on weighted unifrac algorithm

2.6.3 各組小鼠腸道菌群物種組成差異分析

如圖5 所示，在科水平上，正常組優勢物種普雷沃 菌 科 （ Prevotellaceae ） 和 毛 螺 菌 科（Lachnospiraceae） 相對豐度分別為23.70% 和18.59%，模型組顯著降低，給藥后，二神丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組、鹽補骨脂組、肉豆蔻曲組在Prevotellaceae 水平上相對豐度分別為9.66%、 12.90%、 13.87%、4.89%、4.93%，在Lachnospiraceae 水平上相對豐度分別為9.80%、11.82%、0.85%、7.70%、8.47%，其中二神丸Ⅱ組與二神丸Ⅰ組提高二者物種相對豐度的程度相當；模型組在腸桿菌科（Enterobacteriaceae）占比10.70%，正常組占比0.07%，給藥治療后，各組水平較模型組顯著降低，占比分別為2.88%、3.36%、13.99%、0.89%、4.66%，二神丸Ⅱ組與二神丸Ⅰ組下調趨勢相當，鹽補骨脂組效果最顯著。

圖5 各組小鼠腸道菌群結構分析Figure 5 Analysis of gut microbiota structure in each group of mice

在屬水平上，模型組在擬桿菌屬（Bacteroides）占比較高，為32.86%，正常組占比為12.10%，給藥后，二神丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組、鹽補骨脂組、肉豆蔻曲組占比分別為 18.69%、 17.85%、 19.20%、 21.47%、20.76%，埃希氏-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）在模型組中的相對豐度（10.69%）顯著高于正常組（0.03%），治療后，各給藥組占比分別為2.77%、0.31%、13.19%、0.51%、0.13%，二神丸Ⅱ組與肉豆蔻曲組能顯著下調Escherichia-Shigella 相對豐度。

3 討論

MTL 和GAS 是重要的胃腸激素，其中MTL 能夠作用于消化道平滑肌細胞上的受體，促進胃腸運動和胃腸道對水、電解質的運輸[18]。 GAS 可刺激消化腺分泌，促進食管和胃的括約肌及消化道平滑肌的收縮，加強胃腸道運動[19]。 CORT、TSH、T 均為評價腎功能狀態的重要指標[20]，作為下丘腦-垂體-腎上腺軸、下丘腦-垂體-甲狀腺軸、下丘腦-垂體-性腺軸相關激素指標，在機體受到應激時，可引發軸功能紊亂，引發機體產生一系列的腎陽虛癥狀。 脾虛常常伴隨炎癥的產生，TNF-α 和IL-1β 是炎癥產生時重要的細胞因子，TNF-α 主要由活化的單核細胞和巨噬細胞產生，TNF-α 為促炎因子，可誘導其他炎癥因子IL-1β 的產生[21]。 本實驗選取以上血清相關指標探討二神丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組以及鹽補骨脂、肉豆蔻曲在治療脾腎陽虛泄瀉中的作用效果，結果顯示各給藥組對脾腎陽虛泄瀉小鼠模型具有不同程度的改善，且二神丸Ⅱ組能達到二神丸Ⅰ組的改善水平。

腸道菌群是寄生在胃腸道內的眾多微生物的統稱，隨著對腸道菌群的深入研究，中藥通過調節微生態治療腹瀉性疾病的作用機制越來越明確。有研究表明，黃芩湯可降低潰瘍性結腸炎小鼠大腸桿菌志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、毛螺菌屬NK4A136（Lachnospiraceae-NK4A13-group）、腸桿菌屬（Enterorhabdus）相對豐度[22-23]，金晶等[24]在研究四神丸、二神丸及五味子散對結腸炎小鼠腸道菌群實驗中發現，致病菌擬桿菌屬（Bacteroides）、斷鏈真桿菌（Eubacterium-fissicatena）和毛螺菌科UCG-006（Lachnospiraceae-UCG-006）等相對豐度降低，毛螺菌科NK4A136（Lachnospiraceae-NK4A136）、木犀草科（Muribaculaceae）和阿克曼菌屬（Akkermansia）菌群的相對豐度增加；二神丸可上調大鼠普雷沃菌屬（Prevotellaceae），降低變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）等群落水平的物種多樣性來治療腹瀉型腸易激綜合征[25]。 本研究對各組小鼠腸道菌群進行高通量測序，發現模型組小鼠的腸道菌群物種豐富度顯著降低， 擬桿菌屬（Bacteroides）、 埃希氏-志賀菌屬（ Escherichia-Shigella）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）豐度增加，普雷沃菌科 （ Prevotellaceae ） 和毛螺菌科（Lachnospiraceae）豐度降低，Escherichia-Shigella 和Enterobacteriaceae 是與泄瀉疾病相關的致病菌[26]，給藥治療后，各給藥組小鼠腸道菌群水平得到不同程度改善，二神丸Ⅰ、Ⅱ組優于其他給藥組，且兩組之間無顯著性差異。 本實驗證明肉豆蔻曲及其配伍組成二神丸可改善脾腎陽虛泄瀉模型導致的菌群失調， 降低致病菌 Bacteroides、 Escherichia-Shigella、 Enterobacteriaceae 豐度， 增加有益菌Prevotellaceae、Lachnospiraceae 豐度，發揮治療作用。

本研究創新性地以肉豆蔻為發酵原料，采用自然發酵法對其進行炮制，制得肉豆蔻曲，代替麩煨肉豆蔻并對組方新二神丸的藥理作用進行探究，發現其在減少肉豆蔻用量的情況下，與鹽補骨脂配伍使用對脾腎陽虛泄瀉小鼠也可達到良好的效果，減少了肉豆蔻的使用量，降低了中毒的風險。

綜上所述，肉豆蔻曲配伍使用對脾腎陽虛泄瀉模型的作用效果顯著，與生品相比，其溫脾止瀉作用增強，本研究初步探索了肉豆蔻曲配伍組成二神丸的作用機制，建立了肉豆蔻曲的炮制方法，為創新飲片的研究提供了參考。