表觀遺傳機制在原發性高血壓中的作用及針刺干預研究

董新蕾,燕虹宇,史維霞,閆欽風,汶 健,張麗麗,3△

1.天津中醫藥大學第一附屬醫院,天津 300193;2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心,天津 300381;3.天津市針灸學重點實驗室,天津 300073

高血壓是心血管疾病(CVD)、慢性腎病(CKD)和認知障礙最常見的可預防性危險因素,也是世界范圍內致死和致殘的主要因素,可分為由環境和遺傳因素綜合造成的原發性高血壓(EH)以及其他疾病導致的繼發性高血壓[1]。中國高血壓調查最新數據表明, 2012年—2015年間,我國成年人口高血壓發生率大約為27.9% ,且總體呈升高趨勢[2]。而針刺作為中醫學的重要組成部分,可分別從免疫、內分泌、氧化應激和神經機制等多靶點、多途徑達到降壓目的[3],但目前針刺降壓有關基因和蛋白層面的研究仍相對較少[4]。

C.H.Waddington首次定義表觀遺傳學是研究基因型在生物體生長過程中形成表型的機理即核苷酸序列不發生改變,而基因轉錄翻譯的過程發生可遺傳性變化[5]。提示在基因組中,除了改變核苷酸序列,還可以通過修飾基因、DNA與蛋白質相互作用等多途徑、多層次的調節遺傳基因。另外,表觀遺傳標志物的分布和表達都易受環境干擾,即強調基因與環境的相互作用且存在可逆性。以上特點與針刺作用的綜合性、功能性、整體性和雙向性有很高的契合度[6]。

研究表明代謝性疾病、神經系統疾病、炎癥和癌癥等人類疾病的發生和發展過程均與異常的表觀遺傳修飾息息相關,而中醫針刺作為環境因素可以通過影響表觀遺傳的基因表達進而產生改善疾病的功效[7]。另外,以表觀遺傳學相關蛋白酶表達水平或者表觀遺傳修飾水平為靶標,可以使針刺療法更具有針對性地干預疾病。因此,筆者認為將表觀遺傳修飾引入針刺治療EH機制研究中具有重要意義。

1 原發性高血壓的表觀遺傳機制

經典表觀遺傳學包括:組蛋白修飾、DNA甲基化、染色質重塑以及非編碼RNA等;而最近興起的RNA表觀遺傳修飾是mRNA上最普遍、最豐富的RNA修飾,其中N6-甲基化腺嘌呤(m6A)為重要標志[8]。該段將從DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA以及RNA甲基化(主要是m6A)4個方面總結EH的表觀遺傳機制。

1.1 DNA甲基化與原發性高血壓

DNA甲基化是指通過調節轉錄因子與DNA的結合或利用調節基因的蛋白質使基因表達與沉默的過程, CpG 島之前的胞嘧啶或鳥嘌呤核苷酸是關鍵位點[9]。DNA甲基化主要通過體液調節因素、體液平衡因素、內皮因素和炎性因子因素等影響血壓變化[10]。

1.1.1 體液調節因素 由腎素、血管緊張素(Ang)等多種激素及蛋白酶構成的腎素血管緊張素系統(RAS),對機體血壓的調控發揮重要作用。AngII受體(AT1R和AT2R)可與AngII結合后通過多種機制升高血壓,同時AT1R(AT1aR和AT1bR)可促進 AngII發揮大部分生物學作用[11]。Pei 發現年齡和血壓都影響AT1aR啟動子區域CpG甲基化,且該甲基化程度與AT1aR有關,是高血壓發展的原因[12]。血管緊張素轉換酶2(ACE2)可通過降解AngⅡ并生成血管擴張劑Ang 1-7來促進血管擴張, Fan 等發現EH患者外周血組織中ACE2基因的CpG4和CpG5甲基化頻率均高于健康組,且確定CpG5甲基化為EH的重要預測因素,提示ACE2啟動子甲基化與原發性高血壓具有相關性[13];大腦中的RAS 在高血壓發病機制中具有因果作用,孕期母體蛋白質缺乏可通過RAS的變化導致成年后代高血壓,且研究證實急慢性腦室內注射ACE抑制劑可減緩高血壓發展。Goyal在孕期母體低蛋白飲食小鼠胎兒大腦中發現ACE1 mRNA顯著增加,提示與ACE-1基因啟動子區域甲基化顯著缺失有關[14]。

1.1.2 體液平衡因素 水和無機鹽代謝失衡在原發性高血壓發病中具有重要的作用。Na(+)-K(+)-2Cl(-)共轉運蛋白 1(NKCC1)是與高血壓發生有關的轉運蛋白,研究表明使用NKCC1抑制劑可降低血壓,若同時敲除NKCC1基因,則血壓不發生改變。Lee發現NKCC1基因的50個非翻譯區和相鄰的內含子都含有較多CpG島,后采用亞硫酸氫鹽限制性試驗和亞硫酸氫鹽測序聯合法觀察到NKCC1啟動子在SHR主動脈和心臟中的低甲基化,提示導致SHR高血壓的NKCC1表達上調與其啟動子的低甲基化狀態有關,同時考慮SHR與健康大鼠對NKCC1特異性抑制劑敏感度不同也是由NKCC1啟動子甲基化程度不同所引起[15]。

1.1.3 內皮因素 Mfn2基因在高血壓患者的VSMC中以低水平表達,是一種負調節血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的基因。研究發現,高血壓患者的Mfn2基因內含子C堿基甲基化水平明顯低于正常血壓組,提示低甲基化抑制該基因表達導致血壓升高[16]。

1.1.4 炎性因子因素 研究表明,TLR2(Toll樣受體2)、iNOS(誘導型一氧化氮合酶)和IFN-γ(干擾素-γ)均在炎癥性心血管疾病中發揮重要作用。 Alexeeff發現DBP(舒張壓)與TLR2和iNOS基因高甲基化有正比關系,而DBP和SBP(收縮壓)卻均與IFN-γ基因低甲基化成正比[17],以上提示促炎基因甲基化與血壓變化的相關性。

1.2 組蛋白修飾與原發性高血壓

組蛋白是染色質中與基因緊密結合的氨基酸, 調控轉錄過程并在細胞增殖期間發揮維持必要的染色質狀態的作用,且參與到調節基因表達、染色質狀態和復制與修復DNA的過程。其修飾種類主要包括:甲基化、乙?；?、SUMO化、泛素化和磷酸化等[18]。

現代已有研究表明組蛋白甲基化、乙?；蚐UMO化等均在高血壓的發生發展中起重要作用[10]?；虮磉_的激活和沉默與組蛋白甲基化有密切聯系[19]:因高血壓易引起靶器官損傷如心肌肥厚,其中,心房利尿肽(ANP)、腦利鈉肽(BNP)在肥厚心肌中被激活,組蛋白H3的第4位賴氨酸殘基三甲基化(H3K4me3)能促進基因的轉錄翻譯過程,而H3K27me3與H3K9me3卻產生抑制作用。Mehrotra研究發現鹽敏感大鼠心臟中ANP、BNP基因啟動子上的H3K4me3水平顯著高于抗鹽大鼠,而抗鹽大鼠心臟的H3K27me3和H3K9me3水平顯著低于鹽敏感大鼠[20]。組蛋白乙?；烧{節基因表達的動態平衡,其中組蛋白乙酰轉移酶(HAT)和去乙?；?HDAC)起到關鍵作用。 NLRP3炎癥小體是VSMC表型轉化和增殖的關鍵調控因子,VSMC增殖與血管重塑均參與到高血壓的發生發展。Sun發現高血壓中組蛋白乙酰有助于活化SHR中VSMC的NFκB(核轉錄因子)進而激活NLRP3炎癥小體,而抑制HAT則減弱SHR中血管平滑肌增殖以及血管重塑[21]。NO是血管內皮舒張因子,通過影響血管內皮功能參與高血壓的發生發展[22],Zhang發現SUMO化抑制劑和SUMO1(小泛素樣修飾劑1)可改善 AngⅡ誘導的高血壓小鼠主動脈的血管擴張,可能是由于SUMO化抑制劑增加了eNOS(內皮型一氧化氮合酶)表達和NO(一氧化氮)的產生[23],提示組蛋白SUMO化是調節血管功能的關鍵修飾且與高血壓存在相關性。

1.3 非編碼RNA與原發性高血壓

非編碼RNA(ncRNA)是不參與翻譯的RNA分子,根據核苷酸大小被分為小ncRNA(sRNA,<200nt,如miRNA)和長ncRNA(lncRNA,>200nt,如lincRNA、circRNA)[24]。近年來,有關于非編碼RNA對高血壓病理生理學作用的研究與日俱增。

1.3.1 miRNA 高血壓靶器官損傷的基礎是血管加速老化,氧化應激增加、周圍炎癥增加和內皮功能障礙等都將加重由血管周圍纖維化介導的血管僵硬程度。Nosalski發現miR-214可通過阻止T細胞活化和IFN-γ釋放來保護小鼠內皮功能,防止高血壓引起的血管僵硬和血管周圍纖維化[25]。Cheng發現miR-204-5p可以通過靶向SHP2(蛋白酪氨酸磷酸酶)和抑制STAT3(轉錄活化蛋白3)的活化來保護高血壓腎損傷患者免受腎臟纖維化損傷[26];miRNA 4516的上調和miRNA 145的下調可以作為高血壓的獨立預測因子[27]。以上表明miRNA的調節可能能夠介導病理性血管損傷、重塑和血管生成的進展,這對高血壓疾病具有重要意義。

1.3.2 lncRNA Chen S等[28]通過RCT研究發現低表達水平的NR-034083和高表達水平的NR-104181是高血壓的危險因素。內皮祖細胞(EPC)在內源性血管修復中起重要作用,促進生成新血管并修復損傷內皮,與高血壓聯系密切。Li C[29]發現lncRNA-p21可調節SESN2(應激誘導蛋白Sestrin2)表達和mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)磷酸化,并通過AMPK/TSC2途徑增強自噬,在緩解AngII誘導的內皮祖細胞(EPC)衰老中發揮作用。Zhuo X等[30]發現PPARγ可促進炎癥、動脈粥樣硬化和血管重塑等過程,進而參與高血壓的發展。在SHR中上調lncRNA AK094457可抑制PPARγ(過氧化物酶體增殖物激活受體),但同時也會加速Ang Ⅱ誘導的血管功能障礙。提示lncRNA AK094457參與高血壓的進程,可能是治療高血壓的新靶點。lncRNA MALAT1通過抑制MyoD(在肌肉發育和生長中起著關鍵作用)的轉錄從而增強高血壓大鼠心肌纖維化[31]。以上均提示lncRNA與高血壓病密切相關。

1.3.3 circRNA Liu Y等[32]采用高通量RNA測序(RNA-seq)分析發現與正常大鼠相比,SHR主動脈血管組織中共發現485個差異表達circRNA,其中279個上調circRNA和206個下調circRNA,經RT-PCR分析證實,觀察到rno-circRNA-0009197下調,rno-circRNA-0005818、rno-circRNA-0005304、rno-circRNA-0005506和rno-circRNA-0009301的上調,提示主動脈circRNA在調節高血壓血管重塑和功能障礙中具有潛在作用。

1.4 RNA甲基化與原發性高血壓

RNA甲基化隸屬于表觀轉錄組學與表觀基因組學、蛋白質組學共同調控真核生物基因的表達,包括6-甲基腺嘌呤(N6-甲基腺苷,m6A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)及1-甲基腺嘌呤(m1A)[33]。該修飾與心血管疾病、炎癥反應以及癌癥等有著密切聯系。目前RNA甲基化與EH的相關研究主要集中在m6A。

周細胞是內皮細胞基底膜的組成部分,在內皮細胞損傷和微循環障礙的發病機制中起著重要作用,Wu等通過m6A測序技術(m6A-seq)比較SHR與正常大鼠,并取得一式三份的m6A-seq,在每個樣品的mRNA上鑒定富集區即m6A峰。m6A甲基化在mRNA的編碼序列(CDS)(特別是3'UTR和5'UTR)中顯著富集,且SHR與正常大鼠相比,周細胞平均m6A信號降低。同時據基因本體(GO)和信號傳導通路(KEGG)富集分析確定,m6A的甲基化水平與微血管周細胞中高血壓的發展密切相關[34]。遺傳變異通過改變靶點或關鍵核苷酸的RNA序列影響m6A, Mo調查大規模全基因組關聯研究(GWAS),探究m6A 單核苷酸多態性(SNPs)與高血壓的相關性,發現在GWAS-2011與2018數據中,DBP中GWAS的非m6A-SNP的比例明顯低于m6A SNP且與DBP相關的SNPs顯著富集了m6ASNPs。提示m6A SNPs(例如,rs9847953和rs197922)可能通過改變基因表達進而調節血壓[35]。FTO是一種m6A去甲基化酶,同時壓力誘導的阻力動脈收縮(定義為肌張力)是血管阻力和血壓的主要決定因素,Krüger分別采用高脂肪飲食(HFD)和正常飲食(NC)誘導FTO基因缺失小鼠和正常小鼠對其三級腸系膜動脈進行了肌張力分析,發現FTO基因缺失小鼠的肌源性張力可以免受因HFD誘導的動脈縮小,提示內皮FTO的丟失對血管阻力具有保護作用。之后對主動管腔直徑和被動管腔直徑的進一步分析,發現內皮FTO的損失拮抗壓力誘導的收縮[36]。以上研究均提示,m6A與高血壓進程密切相關。

2 針灸治療高血壓的表觀遺傳機制

由上述研究成果分析可知,高血壓與表觀遺傳修飾有著密不可分的聯系,各類表觀遺傳修飾在高血壓的發生發展中具有關鍵作用。而針刺作為國家傳統醫學的一部分,可通過疏通經絡、調節陰陽和通調氣血等多功效達到降壓的目的[37],但是針刺降壓相關機制仍未完全明確。目前研究發現針刺的整體性和多靶點作用與表觀遺傳學理論能夠很好地契合[38],因此以表觀遺傳學視角探究針刺治療高血壓的作用機制將為其提供分子生物學依據,成為新的研究方向。盧圣鋒等在“理、法、方、穴、術”幾個方面探討針灸與表觀遺傳學的聯系,如“用針之要在于調節陰與陽”,陰與陽可相互轉化,這與表觀遺傳學中的相關蛋白酶作用具有相似性(甲基轉移酶、去甲基化酶等);另有中醫的 “整體觀念”從分子生物學水平上與“結合遺傳與環境,通過調控基因轉錄與表達實現治療目的”的現代表觀遺傳學治療疾病的思想有異曲同工之妙[6]。

2.1 針刺調控RAAS相關基因啟動子甲基化降壓

目前,針刺降壓的表觀遺傳機制探討仍處在初級階段。在RAAS(腎素-血管緊張素-醛固酮系統)中,Ace是將血管緊張素原(Agt)轉化為AngⅡ并介導高血壓發生的關鍵酶;同時有研究證實基因啟動子處于低甲基化水平時,基因處于高表達狀態。吳星[39]在實驗前期總結出針刺太沖穴調控原發性高血壓大鼠血壓與影響RAAS蛋白濃度有關, RAAS相關基因的蛋白表達增加將導致血壓升高,且機體受到環境等刺激因素的影響,提示針刺可能通過影響甲基化修飾改變基因的轉錄表達。因此,研究者采用WGBS(全基因組重亞硫酸鹽測序)對各組大鼠下丘腦室旁核進行甲基化分析,直接探究針刺太沖穴與基因表達的相關性。結果表明:干預后,Agt與Ace基因穴位組啟動子的甲基化與相對應模型組相比,甲基化程度水平增高均具有統計學意義;為驗證實驗結果,研究者還檢測了Agt基因與Ace基因的mRNA與蛋白表達的情況,證明差異具有統計學意義。以上提示針刺太沖穴確實可調控RAAS相關基因的甲基化修飾即改變啟動子序列甲基化水平進而影響表達。因此,結合目前針灸降壓的優勢特點以及表觀遺傳學在原發性高血壓發生發展的作用機制,筆者認為將表觀遺傳學理念引入針灸降壓的機制研究中具有重要研究意義和價值。

2.2 針刺通過表觀遺傳修飾調控免疫系統降壓

研究表明:在高血壓模型鼠中,調節性T細胞 (Tregs) 含量減少,輔助性T細胞17 (Th17) 含量增加,而兩種細胞數目在螺內酯治療后發生改變,提示高血壓病的發生與發展與二者之間的平衡有關[40]。已有研究發現針刺關元、足三里穴可以上調Treg細胞數量, 下調Th17細胞數量,調節Th17/Treg細胞平衡,進而降低血壓[41];同時,有實驗發現表觀遺傳學對相關免疫細胞也具有調節作用[42]:SCFAs是重要的HDAC抑制劑,SCFAs可以通過上調Treg細胞含量達到免疫抑制的功能,進而維持結腸的免疫穩態即組蛋白乙?；揎椏梢杂绊慣reg細胞[43];組蛋白H3K27去甲基化酶Jmjd3可以選擇性促進Th17細胞的分化[44]。由此推測,針刺可能通過調控表觀遺傳修飾影響免疫表達,進而發揮降壓作用,這將是未來的研究方向。

2.3 針刺通過表觀遺傳修飾調控氧化應激反應

高血壓的發生與發展與氧化應激反應具有密切聯系,機體氧化和抗氧化平衡異常,將導致血壓持續升高甚至出現血管損傷、重構和炎性反應[45]。NO作為血管內皮細胞(EC)損傷標志物以及血管內皮功能障礙本身與高血壓關系密切[22]。研究表明[46]電針足三里、太沖穴可以增加SHR中NO的生物利用能力,針刺可以使血管內NO的含量增加,使機體的抗氧化能力增強,減輕對血管的損傷,進而達到降壓效果。同時也有研究總結表觀遺傳因子:HDAC、DNMT(DNA甲基轉移酶)和非編碼RNA均可通過調節NO含量進而參與EC功能和功能障礙的調控[47],如促動脈粥樣硬化搏動(PS)誘導Ⅲ類HDAC Sirt1的過表達,可以增強NO的生物利用度并防止EC功能障礙。那么針刺是否可能通過調節表觀遺傳因子的表達影響NO含量最終達到降壓功效,這也是未來值得研究的方向。

綜上,筆者認為從表觀遺傳修飾角度探究針刺調控免疫系統、氧化應激反應等可作為未來深入研究的方向,同時結合目前針灸降壓的機制以及高血壓與表觀遺傳學的關聯性也可以篩選出針刺降壓的優勢靶點,為針刺降壓機制開辟新道路,為新藥開發提供新角度。

3 小結

針刺是以針具刺入人體的穴位,并通過手法量學、穴位配伍等發揮綜合、整體和雙向調節治療作用的一種中醫治病方式,與表觀遺傳的特征具有相似性。但針刺治療疾病的作用機理以及相關分子生物學依據都尚未有全面地闡述,且僅在動物實驗中初步證實的調控位點也未經臨床驗證。近年來,國家自然科學基金涉及到表觀遺傳學探討中醫治療疾病機制的多個方面,這對將表觀遺傳學機制引入針刺治療原發性高血壓具有積極意義。

表觀遺傳現象是由環境因素引起的生物細胞內遺傳物質變化的結果,未來研究中或可采用全基因組DNA甲基化圖譜、ChIP-seq和RNA-seq等方式在基因表達水平方面量化表觀遺傳學變化以制定個體化的針灸降壓處方,即將表觀遺傳機制作為靶標納入高血壓靶器官損害早期的篩查靶點。但該視角仍存在局限性:基因水平層面確診疾病是否會增加診斷的負擔以及該診斷方式需要技術的進一步發展。另外,以量化的表觀遺傳學修飾水平(相關蛋白酶的表達情況或甲基化、乙?；栃月?為靶標,也可用于疾病的預防?！罢w觀念”是中醫理論的核心,針刺可整體調節機體功能和狀態,從表觀遺傳學機制角度進行深入研究為針灸防治疾病提供了新的方向,即針灸通過干預表觀遺傳學修飾,調節基因的表達,提早調整機體的異常狀態。然而,表觀遺傳機制與中醫干預如何有機地結合仍具有挑戰。這也是中醫現代化研究的一個重要方向。

最后,相信結合針灸降壓的研究基礎和表觀遺傳學機制與高血壓疾病的相互關聯,進行表觀遺傳學視角下的針刺降壓機制探究,將會為針刺降壓的分子生物學水平研究提供新的依據。