膜聯蛋白A家族成員在乳腺癌中作用機制的研究進展

南 璐，郭夢杰，高雅楠，賈紅燕

1.山西醫科大學 第一臨床醫學院，山西 太原 030001；2.山西醫科大學第一醫院 乳腺科，山西 太原 030001

乳腺癌(breast cancer)是全球女性最常見的癌,目前已位居女性惡性腫瘤病死率之首,2022年2月,國家癌中心發布的最新一期的全國癌統計數據顯示: 2020年中國女性新發癌病例數209萬, 其中乳腺癌新發超越肺癌,登頂首位。盡管目前針對乳腺癌的手術、化學治療、放射治療、免疫治療及靶向治療等綜合治療已經相對成熟,但越來越多的患者在治療后期會產生耐藥性,因此,探索新的乳腺癌治療策略刻不容緩。

膜聯蛋白A(annexins A,ANX A)家族是受Ca2+調節的蛋白超家族,包括C端核心區域和N端可變區域,前者通過與膜相關磷脂結合發揮作用,后者則可區分不同家族的不同亞型。與一系列生物學活動密切相關,包括生物膜形成、胞吞胞吐,DNA合成等。研究發現ANX A家族參與乳腺癌細胞的侵襲轉移、凋亡、耐藥等。本文通過剖析ANX A家族在乳腺癌中扮演的角色,以期為乳腺癌的診斷和治療提供新方向。

1 ANX A家族成員概述

高等脊椎動物的Annexins被歸類為A家族,含12個成員,命名為ANX A1-ANX A13,其中ANX A12尚未被證實。在生物學中,ANX A蛋白家族是一組鈣依賴性磷脂結合蛋白,當Ca2+存在時,其C端可結合到磷脂膜上并發生構象變化,并暴露出N端從而發揮生物學功能。除了Ca2+外,ANX A的N端也有多個結合位點,S100鈣結合蛋白A10(S100A10)是一種鈣依賴性的信號通路介導分子,S100-ANXA相互作用已被證明可以激活ANX A使其發揮作用。N端結構域是區分不同亞家族的主要依據,是該家族成員具有不同功能特性的結構基礎。

2 ANX A家族各成員的結構和功能特點

ANX A家族均為可溶性蛋白,存在一些共同的結構和生物學功能。在結構上,其C端區域為保守的,除ANX A6由8個核心片段組成外,其余成員均為4個螺旋狀重復單元,并在空間結構中折疊為盤狀,可以以Ca+依賴的方式與磷脂結合。其共同參與有絲分裂、膜離子通道的形成、磷脂酶A2活性的抑制、出胞、入胞作用,并與多種惡性腫瘤的增殖、浸潤及轉移密切相關。其差別主要由N端結構域決定,根據N端序列的不同,表現出不同的功能特點,ANX A1通過其N端激酶特性磷酸化多種蛋白質殘基,ANX A3通過丙氨酸取代經典的Trp-5,與磷脂具有很強的結合能力。同時,家族中的一些成員在特定組織中唯一表達,ANX A3誘導人臍靜脈內皮細胞遷移和小管形成,ANX A4在耳蝸和前庭毛細胞中特異性表達[1],ANX A5則參與免疫T細胞的活化[2]。ANX A家族在癌細胞侵襲、轉移及凋亡中的作用也已經得到證實。ANX A1主要調控腫瘤細胞骨骼重塑和免疫應答相關過程,從而影響癌細胞的侵襲性遷移[3]。ANX A2通過破壞細胞外基質的完整性,導致腫瘤侵襲和轉移[4]。ANX A3通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B、細胞外信號調節激酶和低氧誘導因子-1信號通路等影響細胞增殖、遷移和凋亡。ANX A4通過激活NF-κB信號通路,促進細胞周期進程,抑制細胞凋亡[5]。有些成員還被證實可能與腫瘤耐藥性相關,在正常情況下,紫杉醇誘導ANX A4向細胞質膜易位,促進腫瘤細胞凋亡。然而,ANX A4可以與腫瘤抑制基因Fhit蛋白的N端部分結合,形成ANX A4-Fhit復合物,特異性地阻止細胞質易位并產生耐藥性[6]。含有ANX A6的外泌體的分泌以YAP1依賴的方式促進乳腺癌細胞的紫杉醇耐藥[7]。

3 ANX A家族各成員在乳腺癌發生發展中的作用機制

3.1 ANX A1在乳腺癌發生發展中的作用機制

PRSS22是人絲氨酸蛋白酶中的一員,最初被證實為促進胃癌轉移的新型癌基因,篩選PRSS22和ANX A1蛋白結合的乳腺癌細胞后發現PRSS22裂解ANX A1后可產生一個n端肽,該肽啟動FPR2/ERK信號軸以增加乳腺癌的侵襲性[8]。USP7為程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)的去泛素化酶,ANX A1衍生肽A11與USP7競爭結合和降解癌細胞中的PD-L1,通過抑制腫瘤免疫逃逸表現出明顯的抗腫瘤作用[3]。ANX A1通過減少上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)標志物、波蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶的表達也可以抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)DCST1-AS1通過ANX A1促進TGF-β誘導的EMT,并增強三陰性乳腺癌細胞的化療耐藥[9]。目前TNBC可分為6個亞型,大多數關于ANX A1的研究與TNBC中的間質干細胞型(mesenchymal stem-like,MSL)、基底樣-1型(basal-like-1,BL-1)及基底樣-2型(basal-like-2,BL-2)相關,這3種亞型約占TNBC的70%～80%,因此可以推斷ANX A1與TNBC之間存在良好的關聯。而未來的機制研究應側重于ANX A1在未被充分代表的TNBC分子亞型中的作用,并使用更具有臨床相關性的疾病模型。

3.2 ANX A2在乳腺癌發生發展中的作用機制

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)被認為是轉移的前體細胞,是最終導致乳腺癌死亡的主要原因,Ral蛋白是Ras小G蛋白家族的成員,激活的RalA可以直接與下游效應物相互作用,Src家族激酶(Src family kinases,SFKs)是一類非受體型的蛋白酪氨酸激酶,Src為家族中的一員,可使ANX A2磷酸化,RalA-ANXA2-Src復合物通過激活ERK1/2信號在乳腺癌中促進CTC的形成,導致乳腺癌進展[10]?；罨疌激酶1(receptor for activated C kinase 1,Rack1)作為信號中樞,也可以介導Src激酶對ANX A2的磷酸化,在乳腺癌細胞耐藥和侵襲/轉移的潛能中發揮作用[11]。癌蛋白c-Myc的表達和定位在轉錄、mRNA轉運、翻譯以及蛋白穩定性水平上受到高度調控,胞質中磷酸化的ANX A2可以與c-Myc mRNA的3′非翻譯區(untranslated region,UTR)的特定定位元件結合,導致其定位到核周區域[12],參與乳腺癌細胞凋亡。此外,S100鈣結合蛋白A10(S100A10)是一種鈣依賴性的信號通路介導分子,ANXA2/S100A10四聚體復合體 (AIIt)的發現,在惡性癌細胞和纖溶之間建起了橋梁[4]。該復合物是惡性及非惡性血管生成的關鍵因子,促進腫瘤細胞的侵襲和轉移,因此了解其在乳腺癌中的作用,有望成為乳腺癌治療的新靶點。

3.3 ANX A3在乳腺癌發生發展中的作用機制

ANXA3被認為是一種新的血管生成因子,與乳腺癌細胞的侵襲轉移、凋亡及耐藥有關,并且是乳腺癌的潛在治療靶點。ANX A3主要通過NF-κB信號通路發揮作用,該通路在乳腺癌模型的EMT過程中起重要作用。在三陰性乳腺癌細胞系中發現在敲低ANX A3的癌細胞中存在EMT,其證據是間質標志物(vimentin和N-cadherin)減少,上皮標志物(E-cadherin和γ-cadherin)增加,而敲低NF-κB抑制蛋白IκBɑ可以部分逆轉ANXA敲低誘導的EMT狀態,證實ANX A3通過該信號通路影響乳腺癌細胞的侵襲和遷移[13]。ANX A3的異常表達也被證明可以通過下調多種促凋亡蛋白和細胞周期獨立激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDKs),從而促進細胞凋亡和細胞周期阻滯。在一項對乳腺癌細胞系的體外研究中發現,抑制ANX A3可顯著降低細胞周期調節蛋白激酶4(CDK4)的表達,增強轉錄因子E2F1和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27Kip1的表達[14]。同時,ANX A3激活 NF-κB通路活性也被認為是影響乳腺癌細胞對阿霉素和多西紫杉醇耐藥性的可能機制[13]。最新的一項研究表明,miR-221/222直接靶向ANX A3的3′-UTR,在mRNA和蛋白水平上抑制ANX A3的表達。與阿霉素聯合,下調ANX A3可能使阿霉素誘導的細胞死亡致敏,誘導持續的G2/M和G0/G1驟停。通過增加miR-221/222的表達抑制ANX A3,可以提高化療藥物的有效性[15]。盡管有這些發現,但目前關于ANX A3在抗腫瘤抗生素和紫杉烷類藥物耐藥中作用的數據非常有限,表明該領域迫切需要進一步探索。

3.4 ANX A4在乳腺癌發生發展中的作用機制

STAT3信號在乳腺癌中經常被激活,ANX A4可以通過提高JAK1和p-STAT3的表達來激活JAK-STAT3信號通路,增強乳腺癌細胞的侵襲和轉移,該作用被證實是與ANX A1共同介導的結果[16]。此外,上調ANX A4可增強其與NF-κB p50的相互作用,激活NF-κB信號通路,促進細胞周期進程,抑制細胞凋亡[5]。ANX A4還可以與腫瘤抑制基因Fhit蛋白的n端部分結合,形成ANX A4-Fhit復合物,特異性地阻止細胞質易位并產生耐藥性,并且目前已經通過合成Fhit衍生物在親和力測量方面進行了量化[6]。

3.5 ANX A5在乳腺癌發生發展中的作用機制

所有膜聯蛋白家族的成員都有暴露于凋亡細胞表面的高度保守的核心結構域,并通過樹突狀細胞相關的C型凝集素-1(dectin-1)受體觸發吞噬細胞中的耐受性信號轉導。誘導細胞凋亡后所有表達的膜聯蛋白均能轉移到細胞表面,其中以ANX A1、ANX A2和ANX A5為主,并根據人類數據發現其在惡性組織中的表達與免疫浸潤相關[17]。當細胞凋亡時,通常位于質膜內小葉中的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)會重新定位到外質膜,一旦外化,PS與其受體結合促進吞噬細胞對凋亡細胞的攝取。ANX A5與PS具有高親和力,二者結合阻礙PS與免疫細胞的相互作用,目前已被用作檢測細胞凋亡的標志物[18]。ANX A5可能通過與其他膜聯蛋白家族成員的協同作用參與乳腺癌的侵襲轉移和凋亡,尚未發現其在乳腺癌中產生耐藥的機制,探究該復雜的生物活動過程,對于未來乳腺癌的早期診斷、治療和預后方面有廣泛的應用前景。

3.6 ANX A6在乳腺癌發生發展中的作用機制

ANX A6是所有保守膜聯蛋白中最大的蛋白,主要存在于質膜和內體室中。ANX A6作為多功能支架蛋白,招募信號蛋白,調節膽固醇和膜轉運,影響肌動蛋白動力學。ANX A6與許多癌相關的生物學過程有關,包括細胞侵襲轉移、凋亡、耐藥等。ANX A6通常被認為是腫瘤抑制基因,主要是因為ANX A6負調控表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)及其下游MAPK和PI3K-Akt信號通路的磷酸化,這是腫瘤發生的兩個重要信號,從而進一步抑制腫瘤的侵襲和轉移[19]。而乳腺癌中ANX A6的表達是多功能的,其在基底樣乳腺癌患者的腫瘤組織中低表達,但在浸潤性乳腺癌表型中升高[20]。外泌體-ANX A6(ANX A6-exo)上調可提高敏感癌細胞的細胞活力和集落形成,抑制細胞凋亡[21]。ANX A6的耐藥可由多種因素介導。TNBC細胞暴露于缺氧(>24 h)而不是短暫暴露(<24 h)可以刺激ANX A6的表達,并且缺氧誘導的ANX A6表達也可以增加TNBC細胞對EGFR和雄激素受體(androgen receptor,AR)拮抗劑的抗性[22]。YAP1是一種轉錄共激活因子,其活性受Hippo信號通路控制,ANX A6-exo通過上調YAP1促進Hippo通路的調控異常,并且通過沉默YAP1可以取消ANX A6-exo對乳腺癌細胞紫杉醇(PTX)耐藥和癌細胞侵襲性的促進作用[7],其可能為ANX A6-exo促進乳腺癌進展和PTX耐藥的潛在機制。各項研究表明ANX A6的檢測可能不僅能作為特定乳腺癌亞型的潛在生物標志物,還有望對基底樣TNBC對靶向治療干預的反應進行預測。因此進一步研究ANX A6的上述特性并加以利用,對于作為描述乳腺癌的診斷及預后的生物標志物是有必要的。

3.7 ANX A家族其他成員在乳腺癌發生發展中的作用機制

大量臨床前和臨床研究表明,大多數ANX A具有明顯的侵襲性和轉移性。構建體外三維(3D)“乳腺導管原位癌(ductal carcinomainsitu,DCIS)樣”無定形結構,發現受全反式視黃酸(all-trans retinoic acid,ATRA)調控的miRNA可以靶向調節ANX A8 mRNA從而影響ATRA-全反式視黃酸受體α(retinoic acid receptor,RARA)-ANX A8,其失調可能導致DCIS的發生[23]。敲低AXNA7可促進乳腺癌細胞MCF-7凋亡[24],其可能由激素和/或神經遞質介導。MicroRNAs(miRNAs)是細胞中一類短的內源性非編碼RNA,主要功能是沉默靶mRNA。miRNA篩選分析發現miR-186-5p在人乳腺腫瘤中下調,過表達miR-186-5p可以調節Bcl-2和p53信號誘導細胞凋亡。ANXA9作為miR-186-5p的靶基因,提示miR-186-5p-ANX A9可能參與乳腺癌細胞凋亡的調控[25]。

4 問題與展望

ANX A蛋白家族眾多成員中的大多數已被發現與乳腺癌有關,但目前國內外均尚未發現ANX A10-ANX A13在乳腺癌中的應用,并且許多相關研究方向仍集中于蛋白C端功能的研究,這些研究雖有一定意義,但由于蛋白C端功能較為一致,無法體現每個家族成員的獨特分子特征及功能。此外,ANX A蛋白也與多藥耐藥密切相關,目前,大多數涉及ANX A蛋白的藥物研究仍處于實驗室階段,只有少數臨床應用。如何將這些發現應用于臨床治療是未來乳腺癌研究的挑戰之一。未來的研究應側重于ANX A蛋白家族N端功能的研究以及深入了解ANX A家族誘導化療耐藥的機制,評估ANX A家族作為診斷或預后生物標志物在更大患者隊列中的臨床意義,實現防癌與治癌相結合。