肉蓯蓉總苷對HepG2肝癌荷瘤小鼠的影響

馮 朵，王 靖，蔣勇軍，周士琦，段 昊，李靜圓，閆文杰,*

（1.北京聯合大學生物化學工程學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100023；2.農業農村部食物與營養發展研究所，北京 100081；3.內蒙古三口生物科技有限公司，內蒙古 鄂爾多斯 017000）

肉蓯蓉具有多種保健功能，具有明顯的藥用價值和經濟價值[1]。肉蓯蓉作為食藥同源物質，在肝癌治療中可以在早期預防、中晚期輔助治療方面起到預防和治療兼顧的作用。已有多項研究證明，肉蓯蓉具有增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等多種營養保健作用[2-6]。

研究表明肉蓯蓉總苷（total glycosides，TG）具有保肝護肝、神經保護、抗氧化和改善記憶的作用。研究發現荒漠肉蓯蓉TG可激活核因子E2相關因子2（nuclear factor NF-E2-related factor 2，Nrf2）/Kelch樣ECH相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap-1）通路，保護急性酒精性肝損傷[7]。此外，肉蓯蓉TG對神經細胞缺血再灌注損傷具有一定的保護作用[8]，表觀改善大鼠認知功能[9-10]。還可與枸杞多糖配伍提高小鼠學習記憶能力，抑制腦內氧化應激水平[11]。

人體的生物屏障、免疫系統與龐大的腸道菌群之間形成一種微妙的和諧共生關系[12]，始終處于動態、復雜的人體生態系統中[13]。腸道微生物群組成及其代謝物與肝癌的發生密切相關[14]，之間存在復雜的相互作用[15]。腸-肝軸雙向連接調節腸道微生物群的組成、腸上皮屏障和血管屏障的完整性，研究發現可以利用微生物治療肝細胞癌[16]。其中，微生物組成和功能是了解肝癌進展的重要方面[17]。

調節腸道微生物是提高肝癌免疫治療療效、減少不良反應的很有前途的策略[14]。此外，調節腸道微生物還可重塑炎癥微環境，腸道微生物群會影響肝臟炎癥微環境，可為癌癥預防和治療開辟新思路[18]。Chen Wen等[15]在腸道菌群失衡的小鼠中可觀察到膽固醇調節元件結合蛋白2（sterol-regulatory element binding protein 2，SREBP2）升高，SREBP2的藥理學抑制可減弱腸道菌群失衡下小鼠肝癌的起始作用。Schneider等[18]研究發現腸道微生物群直接影響小鼠和人的肝臟炎癥微環境，從而影響肝細胞癌的發展。隨著對肝臟相關疾病的深入研究，專家學者們發現腸道菌群及其代謝物是肝癌發展中的重要參與者，因此從新視角深入了解腸道微生物在肝癌中的作用機制尤為重要[19]。

目前，肉蓯蓉TG對肝癌小鼠的研究少有報道，因此本實驗將HepG2肝癌細胞皮下注射到小鼠右后腿處，待細胞不斷增殖成瘤，期間給小鼠灌胃不同劑量TG，觀察藥物對裸鼠體內腫瘤的抑制作用，從氧化應激、調節免疫、改善代謝和平衡腸道微生物層面深入探討TG在裸鼠體內的抗腫瘤效果，以期為TG深度開發為抗腫瘤藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Balb/c-nu裸鼠（雄性，體質號量18～22 g）（生產許可證號：SCXK（京）2019-0008）購自北京華阜康生物科技有限公司，于北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心SPF級動物房（使用許可證號：SYXK（京）2023-0013）單籠飼養，保持12 h的明/暗循環，溫度（26±1）℃，相對濕度（60±5）%，適應性喂養1 周后進行實驗。

4%多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，GOT）、谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒 南京建成科技有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

肉蓯蓉TG（質量分數≥75%，以松果菊苷和毛蕊花糖苷合計）由內蒙古三口生物科技有限公司提供，用水溶解至相應質量濃度[20-21]。

1.2 儀器與設備

AB Triple TOF 6600質譜儀 美國AB SCIEX公司；290 Infinity LC超高效液相色譜系統、Bioanalyzer 2100生物分析儀 美國安捷倫科技公司；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統 美國Promega生物技術有限公司；ASP200S全自動脫水機、RM2235石蠟切片機、HI1220烤片臺、DM3000正置熒光顯微鏡 德國Leica有限公司；INFINITE M NANO多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；UV-1600紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及皮下成瘤模型建立

HepG2肝癌細胞生長至培養瓶90%時進行傳代，傳代3 次后，使用胰酶消化，完全培養液終止消化細胞，收集細胞并計數，用磷酸鹽緩沖液重懸至2×107個/mL，然后取0.1 mL細胞懸液用一次性注射器接種于裸鼠右后腿處皮下。接種HepG2肝癌細胞10 d后，將造模成功的動物隨機分為4 組，分別為A組：模型組（生理鹽水，n＝9）；B組：4 mg/kgmbTG（n＝12）；C組：16 mg/kgmbTG（n＝11）；D組：64 mg/kgmbTG（n＝12）。連續灌胃18 d，期間每4～5 d使用游標卡尺測量腫瘤長度和寬度，按式（1）計算小鼠皮下實體瘤體積：

末次給藥后，稱小鼠體質量，眼球取血后脫頸處死小鼠，解剖剝離小鼠肝、脾和腫瘤組織。將剖離的腫瘤組織稱質量后按式（2）計算抑瘤率，對各個組織稱質量并按（3）計算臟器指數：

1.3.2 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察組織病理變化

首先將肝臟和腫瘤組織使用多聚甲醛固定后進行石蠟包埋，切成4 μm厚的薄片。組織充分水化后用HE染色，脫水并風干切片，中性樹膠封片后，于光學顯微鏡下觀察各組織的病理變化并拍照。

1.3.3 肝癌小鼠脾臟淋巴細胞轉化能力

以刀豆蛋白A（concanavalin A，con A）誘導動物脾臟淋巴細胞轉化，利用四甲基偶氮唑鹽法對淋巴細胞懸液進行測定，待細胞培養到72 h時，在570 nm波長處測定其光密度值（OD570nm）。通過式（4）計算淋巴細胞的增殖能力：

1.3.4 肝臟組織抗氧化指標檢測

準確稱取肝臟組織質量，按照質量體積比1∶9（g/mL）加入生理鹽水，剪碎組織，冰水浴超聲勻漿，離心后取上清液，放入4 ℃待測。待測樣本準備好后，使用BCA法測定各樣本的蛋白質量濃度，按照試劑盒說明書內容檢測肝臟CAT、GOT、GPT、AKP活力。

1.3.5 腸道內容物16S rDNA擴增子測序與非靶代謝組學分析

收集肝癌小鼠腸道內容物于凍存管中，委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.3.5.1 16S rDNA 擴增子測序

采用十六烷基三甲基溴化銨或十二烷基硫酸鈉方法對樣本的基因組DNA進行提取，并對DNA的純度和濃度進行檢測。根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和高保真DNA聚合酶對選定的V3～V4可變區進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒。參照電泳初步定量結果，對PCR擴增回收產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。使用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit構建庫試劑盒構建文庫。構建好的文庫通過Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit進行質檢，文庫質檢合格后進行上機測序。

獲得原始數據之后，需要進行拼接、過濾得到有效數據。然后對有效數據進行相關的注釋和分析，篩選組間差異顯著的菌群（線型判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞2以及P＜0.05）。

1.3.5.2 非靶代謝組學分析

提取樣本，采用預冷的甲醇-乙腈-水溶液（2∶2∶1，V/V），渦旋充分混合，4 ℃、14 000×g離心20 min，取上清液備用。

采用超高效液相色譜系統HILIC色譜柱進行分離。柱溫25 ℃；流速0.5 mL/min；進樣量2 μL；流動相A為水＋25 mmol/L乙酸銨＋25 mmol/L氨水，B為乙腈；梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～7 min，5%～35% A、95%～65% B；7～8 min，35%～60% A、65%～40% B；8～9 min，60% A、40% B；9～9.1 min，60%～5% A、40%～95% B；9.1～12 min，5% A、95% B。

樣本通過色譜系統分離后進行質譜分析。電噴霧離子源：正、負離子模式進行檢測：霧化氣輔助加熱氣1（Gas1和Gas2）壓力為60 psi。一級質荷比檢測范圍：60～1 000 Da，二級子離子質荷比檢測范圍：25～1 000 Da，一級質譜掃描累計時間：0.20 s/spectra，二級質譜掃描累計時間0.05 s/spectra。

獲得原始數據之后，進一步對數據進行整理和定量分析，篩選組間差異顯著的代謝物（變量權重值（variable importance for the projection，VIP）＞1以及T檢驗（P＜0.05），然后對篩選到的顯著差異代謝物進行定性分析。

1.3.5.3 關聯分析

基于Illumina雙端測序平臺，選擇變異區域，利用保守區設計通用引物進行PCR擴增，對高變區進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析和菌種鑒定。利用β多樣性進行組間分析，找出在不同分類水平上的分組間豐度變化差異顯著的物種。

基于液相色譜-質譜聯用技術，對生物樣本中的小分子代謝物進行定性和相對定量分析。利用多維統計分析正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）的VIP值和單變量統計分析的P值，找出分組間豐度變化差異顯著的代謝物。

利用Spearman統計方法分析實驗樣本中篩選到的顯著差異菌群與顯著差異代謝物之間的相關性系數，并結合R語言和Cytoscape軟件，多角度挖掘菌群-代謝物之間的相互作用關系。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 25.0統計軟件進行ANOVA單因素顯著性分析，結果以表示；使用Graphpad Prism 8.0.2軟件作圖。P＜0.05表示差異具有統計學意義，P＜0.01表示具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 TG對HepG2肝癌小鼠體質量的影響

為了確定藥物干預過程是否會影響裸鼠的正常生長，在飼喂期間對裸鼠的生長、飲食、活動能力進行跟蹤觀察，發現裸鼠在整個飼喂過程中，體質量正常生長、飲食正常，無毒副作用，這與Gao Yuqiu等[22]的研究結果一致。說明TG在抑制裸鼠實體瘤的同時，不會影響裸鼠的正常生長。

隨著腫瘤的不斷長大，在干預后期，模型組小鼠精神狀態欠佳、行動緩慢、食欲下降、體型變瘦、活力下降、皮膚泛白，逐漸表現出惡病質癥現象；其他處理組的裸鼠精神狀態良好、皮膚紅潤、活動能力正常；在干預前期，TG各劑量組體質量生長速率較其他組更高（圖1），由此推斷TG可以給裸鼠提供一定的營養補充，但TG各組之間體質量沒有差異。

圖1 各組裸鼠平均體質量趨勢變化Fig.1 Trends in average body mass of nude mice in each group

整體來看，裸鼠干預前期體質量增長快速，可能是由于腫瘤的快速增長促進了小鼠的攝食，導致體質量快速增長；中間增長趨勢緩慢，可能是腫瘤的增長進入了平臺期；而后期體質量的增長可能是由于腫瘤增長占據了主導地位。

2.2 TG對HepG2肝癌小鼠腫瘤體積的影響

為了觀察藥物是否可以抑制腫瘤的增長，每5 d測量一次裸鼠皮下實體瘤體積，通過表1發現，在干預前期，與模型組對比，處理組的增長趨勢較為緩慢，當癌細胞快速繁殖，瘤體積不斷擴大時，TG具有一定的抑制體內腫瘤體積的作用，且高質量濃度抑制效果更好（（716.59±514.46）mm3）。

表1 TG對HepG2肝癌小鼠腫瘤體積的影響Table 1 Effect of TG on tumor volume of HepG2-bearing mice

2.3 TG對HepG2肝癌小鼠臟器指數、抑瘤率的影響

如表2所示，與模型組對比，經TG處理后的小鼠肝臟指數、脾臟指數均相應地降低，且具劑量-效應關系，但各組別之間均不存在顯著差異（P＞0.05）。各處理組的腫瘤質量均小于模型組，說明TG對HepG2荷瘤小鼠體內腫瘤均有一定程度的抑制作用，抑瘤率分別為6.133 2%、18.270 6%、26.855 7%，具有劑量依賴性。由于小鼠存在個體差異，處理組抑瘤率雖有所增長，但是各組之間并不存在顯著差異（P＞0.05）。

表2 TG對HepG2肝癌小鼠臟器指數、抑瘤率的影響Table 2 Effect of TG on visceral organ indices and tumor suppression rate of HepG2-bearng mice

2.4 TG對HepG2肝癌小鼠組織的影響

如圖2a所示，模型組顯示不規則的結構和顆粒細胞質，大多數肝細胞體積腫脹，細胞質疏松，細胞間隙擴大，部分肝細胞顯示周圍微小性癥細胞浸潤現象[23]。各處理組小鼠肝臟肝細胞結構較規則，壞死情況減少，炎性細胞浸潤現象減輕，肝細胞多角或類圓形，呈清淡的嗜酸性著色，細胞核呈圓形或多角形，位于中央，染色質較稀疏，核膜清楚。

圖2 TG作用于小鼠組織HE染色形態學變化Fig.2 Morphological changes of TG-treated HepG2-bearing mice by HE staining

腫瘤組織HE染色結果顯示，模型組小鼠腫瘤細胞正常，生長旺盛，細胞核大，腫瘤細胞排列不規則，分布緊密，細胞結構完整（圖2b）。各處理組腫瘤細胞分布變得越來越稀疏，細胞核出現固縮，空泡變樣程度增加，細胞破裂乃至溶解壞死現象，結構不清，其中，高劑量TG組腫瘤細胞壞死效果最明顯。

2.5 TG對HepG2肝癌小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響

從圖3可知，與模型組對比發現隨著TG質量濃度的提高，脾臟淋巴細胞增殖能力逐漸上升，分別增長了5.96%、29.57%、54.88%，呈劑量依賴性，但組間不具有顯著差異（P＞0.05）。該結果表明，TG可以通過改善小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力從而達到抑制肝癌小鼠體內腫瘤增長的效果。

圖3 TG作用于肝癌小鼠各組脾臟淋巴細胞增殖能力Fig.3 Effect of TG on proliferative capacity of splenic lymphocytes in HepG2-bearing mice

2.6 TG對HepG2肝癌小鼠肝臟組織抗氧化指標的影響

在癌變和免疫系統受損發生時，機體的抗氧化能力也會下降。由圖4可知，與模型組比較，各處理組的肝臟組織CAT活力都有所上升，低、中、高劑量TG組分別提高了7.62%、18.51%、39.31%，提高幅度較大，各組與模型組之間均存在極顯著差異（P＜0.01）。與模型組對比，TG各劑量組（低、中、高）AKP活力分別下降了0.52%、3.76%、25.46%，其中，TG高劑量組與模型組存在極顯著差異（P＜0.01）。與模型組對比發現，隨著TG質量濃度的提高，各TG劑量組GPT活力分別提高了35.70%、53.59%、62.46%。低、中、高TG劑量組小鼠肝組織GOT活力較模型組分別下降了2.21%、11.00%、11.58%。綜上，推測模型組的肝臟發生了非常嚴重的病變，處理組較模型組病變程度低，并且隨著TG濃度的升高，其病變程度隨之降低。結果表明TG可以提高小鼠抗氧化能力、緩解小鼠肝臟氧化損傷程度、改善肝臟抗氧化功能，從而起到抑制小鼠體內腫瘤生長的作用，提示后續可采用肉蓯蓉輔助治療肝癌患者以保護肝臟器官免受損傷。

圖4 TG對HepG2肝癌小鼠肝臟組織抗氧化指標的影響Fig.4 Effect of TG on antioxidant indexes of liver tissues in HepG2-bearing mice

2.7 腸道菌群代謝組學分析

由圖5a可知，本實驗正負離子模式合并后共鑒定得到1 889 種代謝物，其中正離子鑒定到1 163 種，負離子鑒定到726 種。對鑒定到的所有代謝物進行分類統計，按照化學分類歸屬信息主要包括有機酸及其衍生物、脂質和類脂分子、有機雜環化合物、苯環型化合物、有機氧化合物、苯丙烷類和聚酮類、有機氮化合物、核苷酸及其類似物等。

圖5 肉蓯蓉TG作用于小鼠腸道內容物代謝組學結果Fig.5 Metabolomics results of intestinal contents in TG-treated mice

OPLS-DA是一種對偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）進行修正的分析方法，可以濾除與分類信息無關的噪音，提高模型的解析能力和有效性；在OPLS-DA得分圖中，有預測主成分和正交主成分，OPLS-DA將組間差異最大化的反映在t[1]上，可直接區分組間變異，而在正交主成分to[1]上則反映了組內的變異，橢圓代表95%置信區間，點的分布狀態反映組間、組內的差異度。由圖5b可知，OPLS-DA模型可以區分A組和D組。

顯著差異代謝物（VIP＞1，P＜0.05）的層次聚類分析結果如圖5c所示，聚在同一簇內的代謝物具有相似的表達模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程或細胞通路。圖5c中每行代表一個差異代謝物，每列代表一組樣品，紅色代表顯著上調，藍色代表顯著下調，顏色深淺表示上下調的程度，表達模式接近的代謝物聚在左側同一聚類下。結果表明A組和D組代謝物明顯不同，D組中茴香霉素、伊馬替尼、拉貝洛爾、巨大戟醇、DL-正纈氨酸和原海蔥苷A的含量較高，水楊酸含量較低，表明TG可顯著調節肝癌小鼠腸道代謝物水平。

2.8 腸道菌群轉錄組學分析

群落結構組分圖（圖6a）可以展示每個樣本或分組在不同分類水平上的群落結構，根據物種注釋結果，選取A組和D組在屬水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看在屬水平上相對豐度較高的物種及其比例。由圖6a可知，D組中擬桿菌屬（Bacteroides）較A組升高，羅氏菌屬（Roseburia）、丹毒絲梭菌屬（Erysipelatoclostridium）較A組降低。

圖6 肉蓯蓉TG作用于小鼠腸道內容物16S rDNA檢測結果Fig.6 16S rDNA sequencing results of intestinal contents in TG-treated mice

微生物覆蓋率為測序深度指數，均在0.99以上，品種間文庫覆蓋率指數通過Tukey和Wilcox秩和檢驗，如圖6b所示，A組和D組存在顯著差異（P＝0.045＜0.05），D組菌群多樣性高于A組，表明測序深度已基本覆蓋樣品所有的物種，可進行下一步數據分析。

β多樣性指數組間差異分析中，箱形圖可以直觀地反映組內物種多樣性的中位數、離散程度、最大值、最小值、異常值。通過Wilcox秩和檢驗發現A和D組間物種多樣性差異極顯著（P＝0.000 659 4＜0.01），組間差異大于組內差異（圖6c），表明分組具有意義。

圖6d、e分別是不同處理組小鼠樣本LDA值分布柱狀圖及具有統計學差異的Biomarker柱狀圖，代表在A組和D組起重要作用的微生物類群。重點關注兩組中差異菌屬的相對豐度，A組中卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、魯杰氏菌屬（Ruegeria）和Tyzzerella_3菌屬的豐度較高；D組中丁酸球菌屬（Butyricicoccus）豐度較高。

2.9 顯著差異菌群和顯著差異代謝物聯合分析

關聯分析是數據深入挖掘的一種方式，主要用來發現隱藏在數據集中的關聯性或相關性。16S rDNA與代謝的關聯分析主要是基于統計學的算法發現顯著差異菌群與顯著差異代謝物之間的關聯。為直觀地反映顯著差異菌群和顯著差異代謝物表達模式的異同，對差異顯著的菌群和代謝物進行Spearman相關性層次聚類分析。

層次聚類熱圖中每一行表示一個差異顯著的菌屬，每一列表示一種差異顯著的代謝物。左側樹杈表示對差異菌屬進行聚類的結果，上側樹杈表示對差異代謝物進行聚類分析的結果。聚類出現在同一個聚類的顯著差異代謝物或者差異的菌屬具有相似的相關性模式。層次聚類熱圖中每一個格子包含兩種信息（相關系數r和P值）。r以顏色表示，r＞0表示正相關（紅色）；r＜0表示負相關（藍色），顏色越深表示相關性越強。圖7展示了185 對顯著性相關的差異菌屬和代謝物，其中58 對的P＜0.01，相關性極顯著。

圖7 顯著差異菌群與顯著差異代謝物的Spearman相關性分析層次聚類熱圖Fig.7 Hierarchical clustering heatmap of Spearman correlation analysis of significantly differential intestinal microflora and metabolites

A組和D組樣本在代謝組學層面上以及菌群多樣性上具有明顯的區分，共篩選到12 個顯著差異菌群與60 個顯著差異代謝物。通過Spearman統計學分析方法，對兩者之間的相關性進行計算，共找到72 對具有顯著性正相關的菌群-代謝物，113 對具有顯著性負相關的菌群-代謝物。

3 討論與結論

前期研究TG在體外水平上，可以顯著抑制HepG2細胞增殖，誘導細胞凋亡、壞死[21]。因此需利用動物模型進行體內檢測，從而對抗腫瘤藥物進行全面分析解釋，為肉蓯蓉臨床應用提供更準確的理論依據。選用HepG2細胞接種在裸鼠右后腿處，建立裸鼠皮下實體瘤模型，造模成功后，灌胃不同質量濃度TG，在整個飼喂過程中，測量小鼠體質量變化并分析小鼠的腫瘤體積增長趨勢，監督觀察其精神狀態、飲食和活動能力，結果發現模型組小鼠精神狀態較差，而處理組精神狀態良好，且皮膚紅潤，此外，TG不會影響小鼠的正常生長，可以抑制小鼠皮下腫瘤體積的增長。

在HE染色中，蘇木精染液呈堿性，可使細胞核著藍紫色；伊紅染液呈酸性，可使細胞質和細胞外基質著紅色。該實驗采用HE染色小鼠肝臟和腫瘤組織，發現TG可以減輕肝臟病理變化，緩解炎性細胞浸潤現象。此外，TG在保護肝臟的同時[23]，破壞腫瘤組織中腫瘤細胞結構，導致細胞壞死。HE染色結果直觀地反映了肉蓯蓉在肝癌小鼠中的肝保護和抗癌作用。

CAT是過氧化物酶體的標志酶，促使過氧化氫分解為水和氧分子，使細胞和組織器官免受H2O2的毒害[24]。GPT是一種參與人體蛋白質新陳代謝的酶，是肝細胞損傷最敏感和特異的指標。GOT是反映肝細胞壞死程度的標準，主要存在于肝細胞線粒體中，可以通過檢測肝臟組織中GOT的含量確定肝臟組織病變程度。AKP是一種膜結合酶，廣泛存在于人體各臟器中，其中以肝臟含量最高。臨床研究表明，當肝系統受到惡性腫瘤細胞刺激時，AKP水平增加[25]。通過檢測肝組織抗氧化指標，發現TG可以緩解小鼠肝臟氧化損傷程度，改善肝臟抗氧化功能，減輕肝癌小鼠肝臟病變程度，從而起到抑制小鼠體內腫瘤生長的作用。阻止腫瘤細胞侵害肝臟，為肉蓯蓉作為輔助治療或中醫治療藥物在肝癌臨床應用上提供一定的實驗依據。

有大量臨床數據和實驗研究表明，許多癌癥患者均有免疫功能低下的癥狀，首先是細胞免疫功能較低，在腫瘤生長過程中，體液免疫也在慢慢降低。有研究報道，肉蓯蓉及其活性成分可以緩解化療藥物對免疫細胞造成的損傷，改善機體免疫功能[26-27]。此外，肉蓯蓉多糖能夠促進小鼠淋巴細胞的增殖并釋放Ca2＋，細胞內Ca2＋的升高能夠促進免疫因子的表達，循環調節淋巴細胞的增殖[28]。本實驗表明肉蓯蓉可以成為化學藥物治療中解決免疫能力低下的方法之一。

研究報道肝細胞癌患者在門靜脈和糞便樣本中的亞油酸和苯酚水平低于健康對照組，亞油酸和苯酚可顯著抑制肝癌細胞增殖，表明代謝物在肝細胞癌的發病機制中起重要作用[29]。研究發現茴香霉素激活p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通過介導H3S10磷酸化促進HCC細胞的鐵死亡[30]。伊馬替尼可能通過miR-124和STAT3/HLF/IL-6通路發揮其抗肝纖維化活性[31]。巨大戟醇可減輕肝和胃腸道損傷，減少腹水體積，加劇H22細胞凋亡程度，改善異常的促炎細胞因子[32]。Nair等[33]發現拉貝洛爾與細胞分裂周期因子20表現出顯著的相互作用，可作為一種潛在的抗肝癌靶向藥物。原海蔥苷A對多種HCC細胞系具有很強的抗癌作用，可顯著抑制HCC細胞增殖、遷移和侵襲，與細胞凋亡、線粒體損傷、自噬密切相關，且對MHCC97H異種移植裸鼠中HCC細胞也有明顯的抑制作用[34]。本研究結果顯示，肉蓯蓉可通過調節代謝物水平抑制肝癌的發展。此外，負離子模式下，D組中正纈氨酸較A組升高，水楊酸較A組降低，這與肉蓯蓉多糖緩解腸道微生物失調相關患者的學習和記憶障礙結果[35]一致。

研究發現，卟啉單胞菌屬會產生纖維化介質（例如轉化生長因子-β1），加劇非酒精性脂肪型肝炎的纖維化[36]。D組中較A組卟啉單胞菌屬相對豐度低，表明TG可以緩解肝纖維化，從而抑制肝癌的發生。此外，一項研究中提到Tyzzerella_3可作為預測胃癌的潛在標志物[37]，由此推測模型組可能已經發生了腫瘤轉移情況，后續需要進一步研究探討。TG可以改善丁酸球菌屬相對豐度，這與Mu Hongna等[38]研究柚皮苷減輕高脂肪飲食誘導的非酒精性脂肪肝病結果一致。表明TG可通過改善腸道微生物組成，減輕肝細胞持續損傷，抑制肝炎的發生，并在肝損傷后及時進行肝修復，在肝癌未發生時起到預防干預作用。

綜上，肉蓯蓉作為食藥同源物質，富含營養價值和功能成分，可改善機體免疫能力，抑制腫瘤生長代謝，阻止腫瘤侵襲轉移，調節機體代謝水平，改善機體腸道微生物組成等，表現出一定的抗肝癌作用。本實驗關于TG抗HepG2肝癌效應的相關研究可以為肉蓯蓉的后期開發利用和推廣提供一定的理論依據和技術支撐。